董怡

(永農(nóng)生物科學(xué)有限公司，浙江 紹興 312300)

精草銨膦又稱L-草銨膦，是拜耳從吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)發(fā)酵液中分離得到具有殺菌活性的三肽化合物——雙丙氨膦(bialaphos)，由2 分子L-丙氨酸和一種當(dāng)時(shí)未知的氨基酸構(gòu)成[1]。精草銨膦(L-草銨膦)屬于膦酸類除草劑，其作用機(jī)制和草銨膦相同。草銨膦是D/L-草銨膦的外消旋物，僅L-草銨膦具有除草活性[2]，通過作用于植物體谷氨酰胺合成酶，抑制L-谷氨酰胺合成，導(dǎo)致細(xì)胞毒劑銨離子累積、銨代謝紊亂、氨基酸缺失、葉綠素解體、光合作用被抑制，最終將雜草徹底殺死[3]。

除草劑銷售榜首草甘膦[4]的長期廣泛使用已導(dǎo)致牛筋草、小飛蓬、田旋花等雜草抗性的發(fā)生、發(fā)展。2015 年，草甘膦被國際癌癥研究列為可能的人類致癌物，慢性動(dòng)物飼養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致肝臟和腎臟腫瘤發(fā)病率增加[5]，種種致癌風(fēng)波使法、德等國家禁用草甘膦。因此，草銨膦市場進(jìn)一步增量，其銷售額從2012 年4.5 億美元增至2020 年10.50 億美元，成為增長最快的非選擇性除草劑。

相較于傳統(tǒng)草銨膦，精草銨膦活性是其2 倍以上。永農(nóng)生物科學(xué)有限公司2018 年在國內(nèi)登記了精草銨膦的原藥和制劑，精草銨膦的推廣能夠降低50%施藥量，即每使用1 t 精草銨膦相當(dāng)于直接向農(nóng)田減排1 t D-草銨膦無效體，有效減輕農(nóng)田耕作對(duì)環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)[6]，符合國家農(nóng)藥減量增效政策。

1 精草銨膦化學(xué)合成現(xiàn)狀

L-草銨膦制備方法主要有3 種：不對(duì)稱合成法[7-9]、外消旋體拆分法[10-12]和生物催化法。工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)方法主要是不對(duì)稱合成法和外消旋體拆分法[13]。

不對(duì)稱合成法是從手性原料出發(fā)合成光學(xué)純L-草銨膦。2007 年，明治制果將β-次膦酸酯基醛與伯胺反應(yīng)生成亞胺類化合物，在Jacobsen 催化下，用三甲基硅氰對(duì)亞胺進(jìn)行不對(duì)稱Strecker 反應(yīng)(圖1)，再經(jīng)水解轉(zhuǎn)化得到精草銨膦，e.e.值最高達(dá)94%[14]。此工藝較復(fù)雜，需要使用昂貴的手性拆分試劑，理論收率僅50%，單次拆分率低[15]。

圖1 不對(duì)稱Strecker 反應(yīng)合成L-草銨膦工藝路線

外消旋體拆分法是通過對(duì)外消旋DL-草銨膦或其衍生物進(jìn)行手性拆分，實(shí)現(xiàn)D 型和L 型異構(gòu)體分離，從而得到光學(xué)純L-草銨膦。2018 年史泰龍等[16]報(bào)道了以Pseudomonassp.zjut126 為催化劑、N-癸酰草銨膦為拆分底物水解拆分制備L-草銨膦的合成工藝路線。拆分過程中N-癸酰草銨膦在Pseudomonassp.zjut126 催化下，L-N-癸酰草銨膦水解生成L-草銨膦(圖2)，而(D)-N-癸酰草銨膦不參與反應(yīng)，處理后可得e.e.值大于95.2%的L-草銨膦。此工藝步驟多、收率低、手性原料昂貴，不利于大規(guī)模制備。

圖2 用Pseudomonas sp.zjut126 細(xì)胞拆分外消旋草銨膦制L-草銨膦工藝流程

2 精草銨膦生物合成

生物催化具有立體選擇性嚴(yán)格、反應(yīng)條件溫和、收率高等優(yōu)點(diǎn)，具有替代傳統(tǒng)化學(xué)合成潛力。傳統(tǒng)生物催化法主要包括：⑴以L-草銨膦衍生物為底物，通過酶法直接水解獲得，但前體昂貴且不易得；⑵以外消旋草銨膦前體為底物，通過酶選擇性拆分獲得，理論收率僅50%，造成原料浪費(fèi)。此外，以DL-草銨膦為原料的去消旋合成法優(yōu)勢(shì)明顯，由于當(dāng)前市售的草銨膦主要為DL-草銨膦，其工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)成熟，去消旋合成法以DL-草銨膦為原料，原料易得，且成本較低，能夠較好地對(duì)接現(xiàn)有草銨膦工業(yè)生產(chǎn)體系。

2.1 草銨膦脫氫酶突變體去消旋合成L-草銨膦

浙江工業(yè)大學(xué)薛亞平教授團(tuán)隊(duì)[17]發(fā)現(xiàn)了一種由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中草銨膦脫氫酶V377S 位點(diǎn)突變所得的突變體。以DL-草銨膦為原料，D-草銨膦在D-氨基酸氧化酶催化下形成2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸，L-草銨膦因不參與反應(yīng)而被完全保留；產(chǎn)物2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸通過草銨膦脫氫酶突變體催化還原為L-草銨膦。該方法是對(duì)當(dāng)前去消旋合成法的升級(jí)，草銨膦脫氫酶突變體具有更好催化效率，以外消旋DL-草銨膦為底物進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)高于野生型酶，PPO 產(chǎn)率也大幅提升。

2.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶去消旋合成L-草銨膦

2021 年浙江大學(xué)楊立榮教授團(tuán)隊(duì)[18]公開了一種全新生物酶——ω-轉(zhuǎn)氨酶，來自芽孢桿菌(Bacillussp.)YM?01，用于去消旋化生產(chǎn)L-草銨膦，能夠避免有毒物質(zhì)過氧化氫生成。以DL-草銨膦為原料，通過R-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶將D-草銨膦轉(zhuǎn)化為2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸，L-型草銨膦由于不參與反應(yīng)而得以保留；然后谷氨酸脫氫酶以2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸為原料不對(duì)稱合成L-草銨膦，從而得到光學(xué)純L-型草銨膦(圖3)，并使用醇脫氫酶進(jìn)行輔酶再生，同時(shí)生成丙酮作為第一步轉(zhuǎn)氨酶的氨基受體，最大幅度提高了原料利用率。合成過程中所需輔原料異丙醇轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物異丙胺，經(jīng)過簡單蒸餾回收為農(nóng)藥化工原料。

圖3 全新生物酶法去消旋化合成L-草銨膦的工藝流程

2.3 多酶級(jí)聯(lián)生物催化生產(chǎn)L-草銨膦

上述2 種去消旋合成法相對(duì)傳統(tǒng)生物合成法均具有一定突破，但在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中仍具有其局限性。利用D-氨基酸氧化酶將D-草銨膦氧化為2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸的過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，易導(dǎo)致酶蛋白失活，盡管理論上可以通過添加過氧化氫酶的方式將其去除，但在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中并不能完全消除其不利影響，并且過氧化氫酶的使用會(huì)增加過程成本。ω-轉(zhuǎn)氨酶去消旋合成L-草銨膦的生物合成路線雖然能夠避免催化過程中過氧化氫的產(chǎn)生，但其后續(xù)的生物不對(duì)稱合成反應(yīng)大多為可逆反應(yīng)，因此存在酶利用效率低、L-草銨膦收率低等問題[17-18]。

2022 年，中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)組織專家召開了“手性純草銨膦(精草銨膦)除草劑綠色生物制造技術(shù)與應(yīng)用”科技成果鑒定會(huì)。該成果由永農(nóng)生物聯(lián)合華東理工大學(xué)生物催化與生物合成領(lǐng)域?qū)＜椅簴|芝教授團(tuán)隊(duì)共同開發(fā)，借助魏東芝教授團(tuán)隊(duì)20 多年在酶工程與生物催化方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)以及永農(nóng)生物在草銨膦生產(chǎn)與應(yīng)用方面的經(jīng)驗(yàn)積累，開發(fā)了多酶級(jí)聯(lián)生物催化生產(chǎn)L-草銨膦新工藝，創(chuàng)新了高活性、高對(duì)映選擇性酶定制技術(shù)和多酶自組裝生物催化技術(shù)，創(chuàng)建了高底物濃度、純水反應(yīng)體系，通過生物催化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)將DL-草銨膦近100%效率轉(zhuǎn)化為L-草銨膦，是生物制造生產(chǎn)農(nóng)藥品種的成功范例。該項(xiàng)目建成國際首條生物技術(shù)可實(shí)現(xiàn)年產(chǎn)5 000 t L-草銨膦生產(chǎn)線，在全球范圍內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)L-草銨膦綠色生物制造工藝產(chǎn)業(yè)化。大規(guī)模生物法制造L-草銨膦屬國際首創(chuàng)，有力推動(dòng)了產(chǎn)業(yè)升級(jí)，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著[19]。

3 展望

1995 年，拜耳、先正達(dá)等巨頭開始推廣抗草銨膦以及多抗轉(zhuǎn)基因作物[20]，1996 年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植，2018 年全球26 個(gè)國家和地區(qū)種植了轉(zhuǎn)基因作物，種植面積超1.9 億hm2，其中大豆是最大抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物，玉米其次。2020 年草銨膦轉(zhuǎn)基因作物需求為1.2 萬t，在草銨膦總需求中占比26%。目前草銨膦已成為僅次于草甘膦的第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，主要需求在單抗草銨膦種子(主要為巴斯夫的耐草銨膦油菜種子和耐草銨膦大豆種子)以及大豆、棉花、玉米的雙抗/三抗種子。此外，全球草銨膦抗性基因已經(jīng)導(dǎo)入水稻、小麥、甜菜、煙草、大豆、棉花、番茄、玉米、油菜、甘蔗等20 多種作物中，商業(yè)化程度大幅提升。預(yù)計(jì)2025 年，轉(zhuǎn)基因作物需求將達(dá)3.4 萬t，占比36%，草銨膦全球需求量也將達(dá)6.76 萬t[21]。當(dāng)前抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化程度提升，草銨膦需求結(jié)構(gòu)性改善。相較于傳統(tǒng)草銨膦，精草銨膦活性倍增、用量減半，其可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)滅生性除草劑草甘膦、百草枯，也同樣適用于耐草銨膦轉(zhuǎn)基因作物，精草銨膦正處于快速發(fā)展期，市場前景廣闊。