張燕 王瑞琪 韋麗妮 曹志文 雷倩 趙寧 李立#

（1 中國中醫(yī)科學(xué)院 北京 100700；2 中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700）

甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）是最容易發(fā)生變異的流感病毒之一，且致病性高，對人類健康和全球公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅?？共《绢w粒（KBDG）由中醫(yī)經(jīng)典名方“白虎湯”（《傷寒論》）、“菖蒲郁金湯”（《溫病全書》）和“清瘟敗毒飲”（《疫疹一得》）加減化裁而來，組方包括板藍(lán)根、地黃、廣藿香、連翹、石膏、蘆根、石菖蒲、郁金、知母9 味中藥，具有清熱祛濕、涼血解毒的功效，臨床上常用于病毒感染性疾病[1]，對于流行性感冒也有較好的療效[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，KBDG 對甲型流感病毒FM1 株感染小鼠有較好的抗病毒、解熱和抗炎作用[3]，但具體機(jī)制仍不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可整體化、網(wǎng)絡(luò)化地分析生物信息并預(yù)測藥物靶點(diǎn)，是闡明中藥潛在治療機(jī)制的有效方法[4]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測KBDG 治療甲型流感的主要活性成分、潛在靶點(diǎn)和信號通路，解析其可能的分子機(jī)制，并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，旨在揭示KBDG 對甲型流感的保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 KBDG 化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)獲取 通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[5]查詢KBDG 中藥物板藍(lán)根、地黃、廣藿香、連翹、石膏、蘆根、石菖蒲、郁金、知母的化學(xué)成分（石膏主要成分為硫酸鈣和無機(jī)鹽，無法查詢[6]），并以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行初步篩選，獲取活性成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。使用UniPort 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得作用靶標(biāo)蛋白所對應(yīng)的基因名。

1.2 甲型流感相關(guān)靶點(diǎn)基因獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DisgeNet 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）中獲取“Influenza A Virus Infection”相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 KBDG 治療甲型流感關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取 運(yùn)用Draw Venn Diagram 在線工具對KBDG 的潛在作用靶點(diǎn)與甲型流感相關(guān)靶點(diǎn)取交集，交集基因即為KBDG 治療甲型流感的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將關(guān)鍵靶點(diǎn)提交至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制圖。使用軟件中MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析,得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊，并根據(jù)其參與的生物學(xué)進(jìn)程分析其功能。利用CentiScaPe 2.2 Menu 插件根據(jù)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括介度（Betweenness）、緊密度（Closenesss）及連接度（Degree），進(jìn)一步篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO 與KEGG 通路富集分析 將核心靶點(diǎn)錄入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行富集分析，設(shè)置篩選條件為P＜0.05，分別選取GO 分析中的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）及分子功能（MF）中P值排名前10 位的條目，及KEGG 信號通路中P值排名前20 位的通路進(jìn)行展示。

1.6 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，并計算每個節(jié)點(diǎn)的Degree 值。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動物與病毒 SPF 級BALB/c 雌性小鼠48只，6～8 周齡，體質(zhì)量（16±2）g，由中國科學(xué)院微生物研究所提供（批準(zhǔn)號：202010002）。甲型流感病毒A/PR/8/34 H1N1 株由中國科學(xué)院微生物研究所提供并保存。

1.7.2 儀器與試藥 Avanti J-25I 超速低溫離心機(jī)（美國BECKMAN），MH-1 型微量震蕩器（江蘇?？谑须瑚脶t(yī)用儀器廠生產(chǎn)），包埋機(jī)（美國Thermo Fisher 公司），切片機(jī)（美國Thermo Fisher 公司），CKX53 倒置光學(xué)顯微鏡（上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司），SpectraMax iD5 型多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）?？共《绢w粒（9 g×10 袋/盒、無蔗糖，四川光大制藥有限公司），磷酸奧司他韋膠囊（達(dá)菲）（75 mg×10 粒/盒，意大利Delpharm Milano S.r.l 生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝），4%多聚甲醛，異氟烷（瑞普〈天津〉生物藥業(yè)有限公司），多因子檢測試劑盒（HyClone R&D SYSTEMS）。

1.7.3 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、KBDG 組，每組12 只，分別于第4 天、第7 天各取材6 只。空白組和模型組給予等容積的雙蒸水溶液灌胃，陽性藥組給予奧司他韋混懸液20 mg/（kg·d）灌胃，KBDG 組給予KBDG 混懸液3 510 mg/（kg·d）灌胃。各組灌胃1 次/d，連續(xù)7 d。

1.7.4 造模及取材 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，空腹8 h后開始實(shí)驗(yàn)。除空白組外，其余三組小鼠用3%異氟烷麻醉，以15 個LD50 流感病毒液（A/PR/8/34 H1N1 株）滴鼻感染（35 μl/只）。感染后2 h 開始給藥，每天1 次，連續(xù)7 d。第4、7 天取材，麻醉小鼠后，摘眼球取血，解剖摘取小鼠肺臟，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗表面血跡，濾紙吸干表面液體后置于4%多聚甲醛固定液中固定留存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.5 HE 染色觀察與評價 肺組織樣本用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。采取雙盲法對所有樣本病理切片統(tǒng)一操作，并進(jìn)行病理評分[7]。

1.7.6 多因子檢測 選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析的關(guān)鍵靶點(diǎn)，同時具有抗炎或促炎功能的代表性因子進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。采集各組小鼠外周靜脈血，以1 200×g 離心12 min，每個樣本吸取15 μl 血清，檢測白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-10、IL-6、IL-1β水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KBDG 的活性成分與靶點(diǎn) 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取板藍(lán)根、地黃、廣藿香、連翹、知母、蘆根、石菖蒲、郁金的活性成分，分別為板藍(lán)根35 個、地黃2個、廣藿香9 個、連翹18 個、知母12 個、蘆根1 個、石菖蒲4 個、郁金3 個，合并去重后共獲得抗病毒顆粒活性成分74 個。各藥的作用靶點(diǎn)分別為板藍(lán)根91 個、地黃31 個、廣藿香162 個、連翹229 個、知母113 個、蘆根31 個、石菖蒲82 個、郁金69 個，合并去重后共得到260 個藥物作用靶點(diǎn)。見表1。

表1 KBDG 各藥味化學(xué)成分和靶點(diǎn)數(shù)（個）

2.2 甲型流感相關(guān)靶點(diǎn) 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得甲型流感靶點(diǎn)1 323 個，在DrugBank、DisgeNet和TTD 數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，分別得到18、117、4個靶點(diǎn)。合并4 個數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)信息并去重后獲得1 379 個甲型流感相關(guān)靶點(diǎn)。將KBDG 藥物靶點(diǎn)與甲型流感疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到109 個共同靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 KBDG 靶點(diǎn)-甲型流感靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取和PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在STRING 11.5 平臺構(gòu)建109 個共同靶的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用CentiScaPe 2.2 Menu 插件根據(jù)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選出包括AKT1、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-10 等在內(nèi)的核心蛋白質(zhì)30 個。見圖2。根據(jù)MCODE 模塊分析得到2 個模塊，模塊1包含54 個靶點(diǎn)，得分為44.34 分；模塊2 包含12 個靶點(diǎn)，得分為3.636 分。見圖3。

圖2 KBDG 治療甲型流感共同靶點(diǎn)與核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 KBDG 治療甲型流感關(guān)鍵靶點(diǎn)MCODE 模塊分析

2.4 GO 和KEGG 富集分析 核心靶點(diǎn)GO 富集分析得到461 條目，其中BP 條目366 個，涉及基因表達(dá)的正向調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路等；CC 條目30 個，與大分子復(fù)合物、胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、核質(zhì)等有關(guān)；MF條目65 個，與酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相關(guān)。圖4 展示各類別中排列前10 的條目。核心靶點(diǎn)KEGG 分析得到136 條信號通路，P值排名前20的信號通路涉及IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Th17 信號通路等。見圖5。

圖4 KBDG 治療甲型流感關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 富集分析

圖5 KBDG 治療甲型流感關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 富集分析

2.5 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 KBDG 治療甲型流感的活性成分、核心靶點(diǎn)、通路、疾病之間可以形成復(fù)雜且關(guān)系密切的網(wǎng)絡(luò)。見圖6。

圖6 KBDG 治療甲型流感中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 小鼠肺組織外觀及病理切片HE 染色 空白組小鼠肺組織形態(tài)正常，病理顯示肺泡大小結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)無增厚、無炎癥細(xì)胞浸潤、無出血水腫。模型組小鼠肺外觀可見明顯腫脹充血，病理顯示肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺間質(zhì)明顯增厚，肺泡和肺間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)，肺泡腔可見出血水腫；與模型組比較，陽性藥組和KBDG 組的肺組織形態(tài)與肺泡結(jié)構(gòu)病變程度均有所緩解，表現(xiàn)為可見較多結(jié)構(gòu)較完整肺泡出現(xiàn)，肺間質(zhì)充血水腫有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，隨著病程的延長，病理狀態(tài)趨于改善，在第7天時，KBDG 組病理評分較模型組改善明細(xì)（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠肺組織外觀、病理切片HE 染色（200×）及病理評分

2.6.2 小鼠血清中IL-2、IL-10、IL-1β、IL-6 的表達(dá)選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析的關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-10、IL-1β、IL-6 及IL-2 因子，作為具有抗炎或促炎功能的代表性因子進(jìn)行分析。治療第4 天，模型組小鼠血清中IL-2、IL-10 表達(dá)均明顯低于空白組（P＜0.05、P＜0.01），IL-6 表達(dá)高于空白組（P＜0.05）。陽性藥組、KBDG 組的IL-2、IL-10 均高于模型組（P＜0.05、P＜0.01），KBDG 組IL-1β、陽性藥組的IL-6 均低于模型組（P＜0.05）。治療第7 天后，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 明顯高于空白組（P＜0.05）。陽性藥組的IL-2、KBDG 組 的IL-2 及IL-10 明 顯 高 于 模 型 組（P＜0.01、P＜0.05），陽性藥組、KBDG 組的IL-6 明顯高于模型組（P＜0.05）。見圖8。

圖8 KBDG 對甲型流感感染小鼠血清IL-2、IL-10、IL-1β、IL-6 的影響

3 討論

流感是由流感病毒感染引起的一種具有高度傳染性的急性病毒性呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)造成巨大的發(fā)病率和病死率。在引起人類疾病的3 種流感類型中，甲型流感由于對抗原變異具有高敏感性，是引起大流行的最主要類型。目前，甲型流感的主要防治手段是疫苗注射和神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NI），但存在病毒變異、毒株難以匹配、高耐藥性等問題，此外，各種免疫調(diào)節(jié)劑和信號通路抑制劑也還處于臨床前開發(fā)階段，因此迫切需要尋找更多治療甲型流感的替代藥物。從分子水平上了解甲流相關(guān)細(xì)胞信號通路，有助于了解免疫病理學(xué)變化的原因，明確免疫調(diào)節(jié)干預(yù)措施和開發(fā)新的治療藥物。

甲型流感病毒流引起的季節(jié)性流感在中醫(yī)學(xué)內(nèi)被歸屬于“瘟疫”，也稱“疫病、疫癘、毒氣”。中醫(yī)藥能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，緩解流感病毒引起的過度免疫反應(yīng)，在甲流病毒引起的肺炎防治中具有獨(dú)特優(yōu)勢。KBDG 是臨床常用的治療流感的中藥復(fù)方制劑，對新發(fā)傳染性疾病和新冠肺炎等疾病也具有潛在臨床應(yīng)用價值。為闡明KBDG 對甲型流感的保護(hù)作用及機(jī)制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲得該藥的51個藥物活性成分和作用于疾病的30 個核心靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物-活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。分析發(fā)現(xiàn)：槲皮素、豆甾醇、漢黃芩素等是KBDG 治療甲型流感的有效成分，其中槲皮素可以提高存活率和肺指數(shù)抑制率、降低肺指數(shù)，對甲型H1N1 流感感染小鼠具有保護(hù)作用[8]，相關(guān)機(jī)制可能與阻斷血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)、抑制病毒復(fù)制、影響免疫系統(tǒng)等有關(guān)。豆甾醇可以降低血凝素結(jié)合活性，抵抗H1N1 流感病毒感染[9]。漢黃芩素可以通過下調(diào)活性氧（ROS）水平，抑制巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激，發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)的作用[10]。

針對GO 和KEGG 的分析結(jié)果提示，IL-17、TNF、Th17 等經(jīng)典信號通路在KBDG 治療甲型流感中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，流感小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-17，Th17 介質(zhì)以及IL-17 反應(yīng)性細(xì)胞因子和趨化因子的水平均升高[11]。IL-17A 是流感病毒誘導(dǎo)的肺功能受損和免疫病理學(xué)改變的常見和關(guān)鍵驅(qū)動因素[12]。TNF 基因多態(tài)性研究顯示，TNF 基因的-376 顯性模型AA+GA 與甲型流感（H1N1）的易感性有關(guān)[13]。

甲型流感病毒感染常引起患者全身促炎與抑炎細(xì)胞因子水平變化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、TNF、IL-10 等是抗病毒顆粒治療甲型流感的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。其中IL-1β、IL-6、TNF-α 等細(xì)胞炎癥因子在甲型流感發(fā)病中具有重要作用，其表達(dá)水平與甲型H1N1 流感患者的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。炎癥基因IL-1β、IL-6 與促炎分子表型改變有關(guān)，參與IAV 感染和危重癥形成[16]。IL-6 是感染甲流病毒患者危重癥的標(biāo)志[17]，其過量與流感患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[18]。IL-2 可以向靶向甲型流感病毒的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞傳遞生存信號，促進(jìn)記憶CD4+T 細(xì)胞形成，改善流感感染預(yù)后[19]。IL-10 是最有效的抗炎細(xì)胞因子，有助于改善免疫病理損傷[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KBDG 能有效緩解病毒引起的肺損傷，減輕機(jī)體的過度免疫反應(yīng)，升高IL-2、IL-10 表達(dá)水平，抑制IL-1β、IL-6 表達(dá)，避免細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。

綜上所述，槲皮素、豆甾醇、漢黃芩素可能是KBDG 抗甲型流感的主要活性成分，KBDG 能夠有效升高甲型流感小鼠血清中IL-2、IL-10 表達(dá)，抑制IL-1β、IL-6 表達(dá)，其機(jī)制可能與IL-17、Th17 信號通路等免疫通路有關(guān)，這一研究結(jié)果可為KBDG 的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。