李思奇 高孟 安彤 張柯欣 馬培凱 沈錢(qián)通 朱赟 莊昉成 陳剛

杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310053

佐劑是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，在疫苗中廣泛使用[1]。 尋找安全有效的新型佐劑一直是免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 CpG 分子具有巨大的潛力[2]，它是模式識(shí)別受體——Toll 樣受體9（TLR9）的激動(dòng)劑[3]，其作用機(jī)制是激活TLR9 并引發(fā)下游炎癥相關(guān)基因表達(dá)，從而達(dá)到激活和加強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果[4]。 CpG 根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為A、B、C 三種類(lèi)型[5]。 2017 年在美國(guó)上市的新型乙型肝炎疫苗由于和CpG1018聯(lián)用，對(duì)不同年齡組人群的保護(hù)效果均優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗[6]。 但是由于專(zhuān)利保護(hù)的原因，目前全球僅有個(gè)別公司可以使用CpG1018。 本研究在設(shè)計(jì)出多個(gè)新型CpG 分子的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)其對(duì)重組亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用，篩選出具有潛力的分子，為后續(xù)新型CpG 佐劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

材料與方法

一、儀器與試劑

SPECTRAMAX 190 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；MCO-20AIC 二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)株式會(huì)社廠(chǎng)）。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）亞單位疫苗由浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，主要成分為SARS-CoV-2 受體結(jié)合域（RBD）抗原蛋白和鋁佐劑[7]；CpG 寡核苷酸由擎科生物公司合成且經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE-2） 蛋白、SARS-CoV-2 RBD 蛋白以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）酶標(biāo)的SARS-CoV-2 RBD 蛋白均購(gòu)自金斯瑞公司；HRP 酶標(biāo)羊抗鼠IgG1、 羊抗鼠IgG2a 抗體購(gòu)自Abcam 公司； 小鼠IFN-γ 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自達(dá)科為公司；小鼠IL-2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自Mabtech 公司,SARS-CoV-2 RBD 原型株和Delta 突變株肽刺激物由金斯瑞公司合成；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑購(gòu)自索萊寶公司；TMB 顯色液購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

4 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2018-0012；合格證編號(hào)：20170005044109]，SPF 環(huán)境下保持溫度20~25 ℃、 相對(duì)濕度為40%~70%。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）分子設(shè)計(jì)

目前的研究發(fā)現(xiàn)CpG1018 只含有刺激基序AACGTT，導(dǎo)致其效果有限[8]。 本實(shí)驗(yàn)將人鼠共源的CpG 基序TCGTT[9]加入到所有設(shè)計(jì)的CpG 序列之中， 在CpG1~CpG5 中只加入單一種類(lèi)的刺激基序——TCGTT，并且都以TCGTT 作為開(kāi)頭而后以2個(gè)胸腺嘧啶作為連接，以相同的序列TCGTT 作為結(jié)尾，中間序列不含腺嘌呤核苷酸，通過(guò)不同的排列組合將2~3 個(gè)TCGTT 序列插入其中。 CpG6 在引入TCGTT 序列的同時(shí)還包含有GACGTT 和AACGTT基序，所設(shè)計(jì)的CpG 長(zhǎng)度均為19~26 bp，并采用全硫代修飾。 由于CpG-ODN 分子仍處于研發(fā)階段，此處略去CpG1~CpG6 的完整序列。

2.動(dòng)物分組及免疫

將4 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠分為9 組，每組5 只。 空白對(duì)照組小鼠只接種注射用水，疫苗對(duì)照組小鼠接種SARS-CoV-2 亞單位疫苗（含鋁佐劑成品），實(shí)驗(yàn)組小鼠接種SARS-CoV-2 亞單位疫苗和7 種不同的CpG 佐劑， 根據(jù)加入的CpG 不同而分為CpG1~CpG6 組以及CpG1018 組。 免疫途徑均為腹腔注射，體積為0.5 mL。SARS-CoV-2 疫苗抗原蛋白劑量為50 μg/劑， 根據(jù)前期的研究結(jié)果，CpG劑量采用20 μg/劑，鋁佐劑用量為0.5 mg/劑。

免疫程序?yàn)槌醮蚊庖弋?dāng)天計(jì)為第0 天， 第14天加強(qiáng)免疫。 2 次免疫的疫苗均來(lái)自浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。 初次免疫后7 d 小鼠眼眶采血收集血清，14 d 后免疫前采血同時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。 加強(qiáng)免疫后每周繼續(xù)采集眼眶血，收集血清，加強(qiáng)免疫21 d 后脫頸處死小鼠，取眼球血收集血清，取脾臟收集淋巴細(xì)胞。

3.不同亞型血清結(jié)合抗體效價(jià)檢測(cè)

取商品化SARS-CoV-2 RBD 蛋白 （濃度為1.22 mg/mL）， 稀釋1 500 倍后包被96 孔板， 用含1%牛血清白蛋白的PBS 溶液稀釋小鼠血清， 每孔100 μL 梯度倍比稀釋?zhuān)?以1%牛血清白蛋白的PBS溶液作為本底，每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)置平行復(fù)孔。 37 ℃孵育1 h 后洗版，將HRP 酶標(biāo)的抗小鼠IgG1、IgG2a抗體分別稀釋5 000 倍， 加入96 孔板37 ℃孵育0.5 h，再次洗板，加入TMB 顯色液，室溫避光孵育后終止顯色， 酶標(biāo)儀讀取450 nm 處的OD 值。 cutoff 值為本底孔OD 平均值的2.1 倍，且≥0.105。 選擇結(jié)合抗體水平最高的CpG 組的血清做后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)。

4.競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)結(jié)合抗體效價(jià)

將商品化的ACE-2 蛋白（濃度為0.65 mg/mL）稀釋700 倍，包被在96 孔板上。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)用稀釋液稀釋小鼠血清， 并與1 000 倍稀釋的酶標(biāo)HRP的SARS-CoV-2 RBD 蛋白1∶1 充分混合均勻，37 ℃水浴鍋孵育30 min， 取出后加入到包被ACE-2 蛋白的96 孔板中，37 ℃水浴鍋孵育15 min， 洗版后加入TMB 顯色液室溫避光顯色15 min 后終止并讀數(shù)。 酶標(biāo)儀讀取450 nm 處的OD 值， 用各個(gè)稀釋度下血清的抑制率表示其中和能力，計(jì)算公式為抑制率=（1-樣本讀數(shù)的平均值/陰參讀數(shù)的平均值）×100%。

5.小鼠細(xì)胞免疫水平檢測(cè)

取加強(qiáng)免疫后21 d 的小鼠脫頸處理，并在無(wú)菌環(huán)境下取出小鼠脾臟， 置于濾網(wǎng)中碾磨經(jīng)過(guò)洗滌、裂解紅細(xì)胞等處理后得到小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，參照試劑說(shuō)明書(shū)將細(xì)胞濃度稀釋到5×106個(gè)/mL，每孔100 μL 加入到預(yù)包被小鼠IFN-γ和IL-2 的板子上，然后加入SARS-CoV-2 RBD 肽庫(kù)作為刺激物。 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)參考文獻(xiàn)[10]的方法并參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.3.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s 表示， 組間兩兩比較采用S-N-K 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血清結(jié)合抗體水平

在初次免疫后14 d，CpG6 組小鼠血清IgG2a和IgG1 水平分別為3.63±0.27 和3.44±1.03，顯著高于CpG1018 組的2.06±1.30 和2.06±0.39。 加強(qiáng)免疫后除空白對(duì)照組之外，所有組別的血清IgG2a 和IgG1水平均大幅提高，且接種了CpG 佐劑組均高于疫苗對(duì)照組。 加強(qiáng)免疫后14 d，CpG6 組IgG2a 水平為6.52±0.21，高于CpG1018 組的6.33±0.40。 根據(jù)結(jié)合抗體的結(jié)果，選擇效果較好的CpG6 組，做后續(xù)的免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。 具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同佐劑聯(lián)用的新型冠狀病毒亞單位疫苗注射后小鼠血清IgG 結(jié)合抗體亞型水平

二、血清結(jié)合抗體抑制率

采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法檢測(cè)血清結(jié)合抗體水平，在初次免疫14 d、加強(qiáng)免疫21 d 后，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.66、12.58、19.38 和19.38，均P<0.001）。 初次免疫后第14 天將CpG6 組小鼠血清稀釋10 倍， 對(duì)SARS-CoV-2 原型株的抑制率為（64.67±20.41）%， 高 于CpG1018 組 的 （27.84±20.23）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.70, P=0.031）；并且高于疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.42, P=0.001；t=5.07, P=0.001），結(jié)果如表1所示。對(duì)加強(qiáng)免疫后21 d 處死的小鼠眼球血血清稀釋150 倍后發(fā)現(xiàn)CpG6 組和CpG1018 組的結(jié)合抗體抑制率分別為（88.21±1.47）%和（78.09±8.20）%，且CpG6 組抑制率明顯高于疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.78 和39.51, 均P<0.001）。將血清稀釋1 000 倍后CpG6 組和CpG1018組對(duì)SARS-CoV-2 原型株的抑制率仍然維持在很高的水平，其中CpG6 組血清抑制率為（89.71±4.83）%，高于CpG1018 組的（70.84±17.20）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.36, P=0.046），也高于疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.35, P=0.002；t=30.56, P<0.001）。 對(duì)SARS-CoV-2 Delta 突變株的抑制率上，CpG6 組為（79.04±6.32）%， 高于CpG1018組的（52.61±14.22）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.80,P=0.005）， 并且CpG6 組抑制率明顯高于疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.94, P=0.004；t=19.61, P<0.001）。

表1 免疫后各組小鼠在不同免疫天數(shù)的血清結(jié)合抗體抑制率（%, ±s）

表1 免疫后各組小鼠在不同免疫天數(shù)的血清結(jié)合抗體抑制率（%, ±s）

注：a：血清稀釋10 倍；b：血清稀釋150 倍；c: 稀釋1 000 倍；與CpG6 組比較，d：P<0.05，e：P<0.01

組別 只數(shù)（只） 初次免疫14 d 加強(qiáng)免疫21 d原型株a 原型株b 原型株c Delta 株c CpG1018 5 27.84±20.23d 78.09±8.20 70.84±17.20d 52.61±14.22e CpG6 5 64.67±20.41 88.21±1.47 89.71±4.83 79.04±6.32疫苗對(duì)照 5 8.46±1.22e 46.49±33.53e 33.18±28.66e 31.30±26.34e空白對(duì)照 4 11.82±2.71e 21.80±3.43e 9.88±2.07e 14.67±1.59e F 值 13.66 12.58 19.38 19.38 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

三、細(xì)胞免疫水平檢測(cè)結(jié)果

利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠特異性細(xì)胞水平，結(jié)果如表2 所示，CpG1018、CpG6、疫苗對(duì)照和空白組細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=14.08、14.71、17.37 和13.85， 均P<0.001）。 CpG6 組針對(duì)SARS-CoV-2 原型株敏感[（795.06±332.09）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞]和Delta 突變株敏感的特異性IFN-γ 分泌T細(xì)胞[（678.53±269.60）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞] 均明顯高于疫苗對(duì)照組（t=4.74，P=0.001；t=4.74，P=0.001）和空白 對(duì) 照 組 （t =3.95，P =0.008；t =3.93，P =0.008）。CpG1018 組針對(duì)SARS-CoV-2 原型株敏感和Delta突變株敏感的特異性IFN-γ 分泌細(xì)胞數(shù)分別為（947.62±300.92）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞和（825.67±326.11）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞，與CpG6 組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.76，P=0.469；t=0.78，P=0.459）。 在特異性IL-2 分泌T 細(xì)胞數(shù)量上CpG6 組無(wú)論針對(duì)SARSCoV-2 原型株[（874.75±402.28）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞]，還是針對(duì)Delta 突變株[（743.68±332.07）個(gè)/5×105個(gè)細(xì)胞]，均高于疫苗對(duì)照組（t=2.98，P=0.018；t=2.02，P=0.019） 和空白對(duì)照組 （t=4.30，P=0.004；t=4.30，P=0.004）；而CpG1018 組與CpG6 組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.70，P=0.503；t=0.90，P=0.395）。

表2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠特異性細(xì)胞水平（±s）

表2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠特異性細(xì)胞水平（±s）

注：a：與疫苗對(duì)照組比較，P<0.05；b：與空白對(duì)照組比較，P<0.05

組別 只數(shù)（只） 分泌IL-2 的特異性細(xì)胞（個(gè)/5×105 個(gè)細(xì)胞） 分泌IFN-γ 的特異性細(xì)胞（個(gè)/5×105 個(gè)細(xì)胞）原型株肽庫(kù)刺激 Delta 株肽庫(kù)刺激 原型株肽庫(kù)刺激 Delta 株肽庫(kù)刺激CpG1018 5 1 030.44±291.33ab 915.74±270.03ab 947.62±300.92ab 825.67±326.11ab CpG6 5 874.75±402.28ab 743.68±332.07ab 795.06±332.09ab 678.53±269.60ab疫苗對(duì)照 5 290.95±175.17 259.12±165.53 82.12±48.73 92.43±62.60空白對(duì)照 4 18.89±7.66 19.80±3.58 10.11±8.28 15.16±11.57 F 值 14.08 14.71 17.37 13.85 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

討 論

一、新型CpG 佐劑分子的設(shè)計(jì)思路

佐劑在保證及提升疫苗免疫效果中扮演了重要角色。 CpG 佐劑具有作用機(jī)制明確、不良反應(yīng)小、對(duì)細(xì)胞免疫提升大等優(yōu)點(diǎn)，目前已在一些商業(yè)化重組蛋白疫苗中獲得使用批準(zhǔn)。

本研究在設(shè)計(jì)新型CpG1~CpG6 分子時(shí)， 參考CpG1018 加入了TCGTT 基序， 突出其免疫增強(qiáng)效果，并希望在后續(xù)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)和臨床試驗(yàn)中能體現(xiàn)出相應(yīng)的效果。 CpG 存在種屬特異性，人和鼠的TLR9 受體在氨基酸水平上只有76%的同源性[11]。由于針對(duì)不同的物種產(chǎn)生的效果不一致，目前上市的 疫 苗 中，CpG1018 用 量 較 大 （達(dá) 到3 mg/劑）。TCGTT 基序可以同時(shí)增強(qiáng)小鼠和人免疫應(yīng)答水平。相對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)，TCGTT 基序?qū)θ说拿庖咛嵘饔酶裑9]。 CpG1018 序列中不含有TCGTT 基序，因此CpG1018 雖然可以較好地激活小鼠免疫應(yīng)答，但在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的效果可能弱于含該序列的CpG分子。

二、CpG6 佐劑分子的特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)中，CpG6 和CpG1018 兩組對(duì)小鼠免疫增強(qiáng)效果都較為明顯，均高于疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組。本文在細(xì)胞免疫水平的評(píng)估中選擇了IL-2 和IFN-γ 這兩項(xiàng)指標(biāo)。 IFN-γ 可以作用于多種APC，通過(guò)受體-配體相互作用， 啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 觸發(fā)STAT1 磷酸化， 并最終激活轉(zhuǎn)錄因子T-bet 使T 細(xì)胞向Th1 類(lèi)細(xì)胞分化，是反映細(xì)胞免疫水平的重要因子[12-14]。 IL-2 是T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)于T 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及發(fā)揮效應(yīng)起重要作用，是重要的細(xì)胞免疫因子[15]。 在本研究中， CpG6 誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫激活水平與CpG1018 組相比無(wú)顯著性差異。 相比于CpG1018，自行設(shè)計(jì)的新型CpG，特別是CpG6 在初次免疫后的體液免疫和細(xì)胞免疫方面保護(hù)效果更顯著，能更快地激活特異性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體和刺激細(xì)胞免疫等相關(guān)應(yīng)答。同時(shí)，加強(qiáng)免疫后CpG6 組的IgG2a 抗體滴度高于CpG1018 組。 以上結(jié)果表明CpG6 和CpG1018 佐劑一樣， 能引起相應(yīng)的機(jī)體免疫應(yīng)答。 不過(guò)在面對(duì)新發(fā)、突發(fā)傳染病，需要盡快誘導(dǎo)特異性高水平免疫應(yīng)答時(shí)，CpG6 在初次免疫時(shí)即可表現(xiàn)出的良好作用， 使其效果極有可能優(yōu)于CpG1018。

總體來(lái)說(shuō)， 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的新型佐劑分子CpG6在初次免疫后表現(xiàn)出超越CpG1018 的良好效果,在加強(qiáng)免疫后誘導(dǎo)的體液免疫強(qiáng)于CpG1018，細(xì)胞免疫效果也不弱于CpG1018。 有待對(duì)其免疫增強(qiáng)的機(jī)制做進(jìn)一步研究， 并且探究CpG6 對(duì)于其他類(lèi)型的疫苗（如治療性疫苗）是否也具有顯著的免疫效果提升作用。 本研究存在一定的局限性：（1）實(shí)驗(yàn)中所用到的疫苗為原核表達(dá)，其抗原分子與目前主流的真核疫苗有一定區(qū)別；（2） 研究所用到的CpG 分子的計(jì)量單位為質(zhì)量而不是摩爾數(shù)，可能由于CpG 分子量的不同而加入不同摩爾數(shù)的CpG 分子；（3）實(shí)驗(yàn)中使用的重組亞單位疫苗劑量為50 μg/劑，高于已上市的重組亞單位疫苗，后續(xù)研究中，將對(duì)其劑量探究。 在保證免疫效果的情況下，降低CpG 自身及抗原蛋白的用量， 并針對(duì)鋁佐劑做一定的優(yōu)化，這對(duì)于降低疫苗不良反應(yīng)、提升安全性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李思奇：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計(jì)分析；高孟：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)和材料支持、指導(dǎo)；安彤、張柯欣：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析；馬培凱：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析；沈錢(qián)通：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；朱贊：分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、技術(shù)和材料支持；莊昉成：對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、技術(shù)和材料支持、指導(dǎo)；陳剛：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、統(tǒng)計(jì)分析、獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)和材料支持、指導(dǎo)