王 鑫，申 亮，王培珍

（1.衡水市中醫(yī)醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.華北醫(yī)療集團峰峰總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200；3.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

糖尿病腎臟?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，也是導致糖尿病患者死亡的最重要原因[1-2]。DKD臨床最初表現(xiàn)為尿白蛋白（albumin，Alb）排泄增加，隨后腎小球濾過率逐漸下降，最終發(fā)展為終末期腎病[3]。形態(tài)學上DKD表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增寬及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積聚，導致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）[4]。其中纖維化是與DKD相關(guān)高發(fā)病率及高死亡率的核心[5]。DKD發(fā)病機制復雜，因此評估DKD發(fā)病機制并制定有效的治療措施具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（transcription factor NF-E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）通路為抗氧化應(yīng)激經(jīng)典信號途徑[6]，該通路激活可改善糖尿病誘導的腎組織纖維化損傷[7]。赤芍總苷（total paeony glycoside，TPG）為單萜苷類化合物，是中藥赤芍的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)控血糖和血脂等藥理活性[8]。目前TPG臨床應(yīng)用相對有限，關(guān)于TPG是否可通過Nrf2/HO-1通路改善DKD大鼠腎纖維化尚未見報道，故本研究擬通過構(gòu)建DKD大鼠模型，探討TPG對DKD大鼠腎纖維化病理損傷的改善作用及可能作用機制，以期為DKD治療策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性8周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003。于24 ℃恒溫，相對濕度45%～55%環(huán)境下普通飼養(yǎng)，12 h光照-12 h黑暗交替，適應(yīng)性培養(yǎng)1周，并給予充足潔凈飲水和普通飼料。研究方案經(jīng)衡水市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（倫理編號：IACUC2020031），實驗過程遵循實驗動物3R原則并給予人道主義關(guān)懷。

1.2 藥物與主要試劑 赤芍購自張仲景大藥房，經(jīng)河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥藥學部王培珍鑒定為正品；二甲雙胍（純度≥98%，批號：1115-70-4）購自寶雞市國康生物科技有限公司；HE染色試劑盒（批號：G1120）、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（批號：S8050-1）、過碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（批號：G1280）、Masson染色試劑盒（批號：G1340）、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（批號：BC0020）、超氧化物歧化酶（SOD）含量檢測試劑盒（批號：BC0170）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；Alb ELISA試劑盒（批號：ZK-R4044）購自深圳子科生物科技有限公司；細胞質(zhì)/細胞核蛋白提取試劑盒（批號：ALH387-DWP）購自北京百奧萊博科技有限公司；Nrf2 抗體（批號：ab92946）、HO-1抗體（批號：ab68477）、平滑肌肌動蛋白（alphasmooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號：ab7817）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體（批號：ab268020）均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：WK400）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 XPR106DUH/AC型電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；VHX-7000N型電子顯微鏡[基恩士（中國）有限公司]；E0987型組織包埋機、E0972型全自動石蠟切片機均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BX53M型光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；HY-1508型石蠟切片機（德國QIAGEN公司）；AU5800型全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）；5425R型高速離心機（南京貝登電子商務(wù)有限公司）；MultiskanTMFC型多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；1658040型垂直電泳槽（美國BIO-RAD公司）；Fluor Chem E化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）。

1.4 TPG制備 通過乙醇回流法提取TPG[9]：清理赤芍表面雜質(zhì)，粉碎過篩，70%乙醇回流提取并濃縮，過吸附柱，3倍量蒸餾水洗，然后3倍量乙醇洗脫，收集20%洗脫組分，減壓回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。TPG純度達95%以上。

1.5 造模、分組及給藥 隨機選擇10只大鼠作為對照組，剩余50只大鼠用于構(gòu)建DKD模型[10]：大鼠禁食12 h，連續(xù)2 d單次腹腔注射STZ（檸檬酸緩沖液稀釋至pH值為4.5），60 mg/kg，注射3 d后尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖（FBG），連續(xù)3 d的FBG≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型構(gòu)建成功，1周后進行尿Alb定性檢查，尿蛋白陽性提示腎功能損害，表明成功構(gòu)建DKD大鼠模型。對照組大鼠僅腹腔等量注射檸檬酸緩沖液（pH值為4.5）。成功建模43只DKD模型大鼠，隨機選擇40只大鼠，并隨機分為模型組、TPG低劑量組、TPG高劑量組及二甲雙胍組，每組10只。其中TPG低、高劑量組大鼠灌胃劑量分別為100、200 mg/（kg·d），二甲雙胍組[11]大鼠灌胃劑量為250 mg/（kg·d）；對照組及模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥12周。

1.6 觀察指標

1.6.1 樣本采集與處理 末次給藥結(jié)束后，觀察大鼠一般體征，稱量體質(zhì)量（body weight，BW）；各組大鼠均被放置于單獨的代謝籠里，收集24 h尿液以檢測尿Alb含量；然后禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，尾靜脈采血檢測FBG；采集眼眶血，4 ℃，2 500 r/min離心20 min，取上清液并保存于-80 ℃，以檢測血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；處死大鼠，摘取腎臟，生理鹽水沖洗右腎并擦拭干凈后稱量腎臟質(zhì)量（kidney weight，KW），然后將各組大鼠右腎保存于4%多聚甲醛溶液以用于組織病理學染色；左腎保存于液氮中用于氧化應(yīng)激因子及Western blotting檢測。

1.6.2 大鼠腎臟指數(shù)（kidney index，KI） 測定大鼠KI以評估腎功能損害程度，KI=KW/BW×100。

1.6.3 24 h尿Alb含量 收集24 h尿液，4 ℃，3 000 r/min離心15 min，收集上清液。使用ELISA法檢測，設(shè)置標準品孔和樣本孔：標準品孔加不同濃度標準品50 μL，樣本孔先加5倍稀釋的尿液50 μL，后于各孔加入HRP標記的抗體，37 ℃溫育1 h，洗板，加入底物A、B避光孵育15 min，終止液終止反應(yīng)，450 nm波長處測定各孔OD值。繪制標準曲線并計算Alb含量。

1.6.4 腎組織HE染色 腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制備成3 μm腎組織石蠟切片，二甲苯、梯度乙醇及蒸餾水脫蠟，0.5%蘇木精染液染色2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，1%伊紅染色3 min，脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。

1.6.5 腎組織PAS染色 腎組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇及蒸餾水脫蠟，碘酸氧化溶液脫蠟5 min，希夫試劑脫蠟15 min，蘇木精染色1 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，脫水、透明封片，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。PAS糖原陽性呈紫紅色，用于評估基底膜、系膜基質(zhì)變化情況。

1.6.6 腎組織Masson染色 腎組織切片經(jīng)0.5%蘇木精染色5 min，洗滌，0.5%鹽酸酒精分化20 s，洗滌，Masson復合染色液染色5 min。0.2%乙酸溶液洗滌，5%磷鉬酸溶液反應(yīng)5 min，0.2%乙酸溶液洗滌，2%苯胺藍溶液浸泡20 s，無水乙醇洗滌并干燥，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。腎間質(zhì)區(qū)膠原染色呈藍色，用于評估腎纖維化。

1.6.7 腎組織MDA含量及SOD活性 取200 mg腎臟組織，按質(zhì)量利用生理鹽水將其制備為10%組織勻漿，離心后取上清液0.5 mL，硫代巴比妥酸比色分析法測定MDA含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.6.8 腎組織中Nrf2、HO-1、α-SMA、FN蛋白相對表達量 取液氮保存的腎臟組織，研缽碾碎，根據(jù)全蛋白提取試劑盒及細胞質(zhì)/細胞核蛋白提取試劑盒說明書提取腎組織全蛋白及核蛋白。測定蛋白濃度并加熱變性蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜于5%脫脂乳中37 ℃封閉2 h后，直接放于一抗（均1∶1 000稀釋）內(nèi)4 ℃孵育過夜；次日洗膜，多次換液后，將PVDF膜于二抗（1∶8 000稀釋）內(nèi)孵育2 h，多次洗膜后，利用ECL顯影試劑于化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影，并拍照記錄。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白總Nrf2、核Nrf2、HO-1、α-SMA及FN與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般體征及KI變化情況 與對照組比較，模型組大鼠精神萎靡，運動遲緩，被毛粗糙無光澤，多飲多食，體型消瘦；與模型組比較，TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠上述癥狀均有所好轉(zhuǎn)。5組大鼠KI比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠KI高于對照組（P<0.05）；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠KI均低于模型組（P<0.05）；TPG高劑量組及二甲雙胍組大鼠KI均低于TPG低劑量組（P<0.05）；二甲雙胍組大鼠KI低于TPG高劑量組（P<0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠KI 比較 （±s，n=10）

2.2 各組大鼠24 h尿Alb含量比較 5組大鼠24 h尿Alb含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠24 h尿Alb含量高于對照組（P<0.05）；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠24 h尿Alb含量均低于模型組（P<0.05）；TPG高劑量組及二甲雙胍組大鼠24 h尿Alb含量均低于TPG低劑量組（P<0.05）；二甲雙胍組大鼠24 h尿Alb含量低于TPG高劑量組（P<0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠24 h 尿Alb 含量比較 （±s，n=10）

2.3 各組大鼠FBG、Scr、BUN水平比較 5組大鼠FBG、Scr、BUN水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠FBG、Scr、BUN水平均高于對照組（P<0.05）；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠FBG、Scr、BUN水平均低于模型組（P<0.05）；TPG高劑量組及二甲雙胍組大鼠FBG、Scr、BUN水平均低于TPG低劑量組（P<0.05）；二甲雙胍組大鼠FBG、Scr、BUN水平均低于TPG高劑量組（P<0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠FBG、Scr、BUN 水平比較 （±s，n=10）

2.4 大鼠腎臟組織形態(tài)學變化 HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎小球大小正常，形狀規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，腎小管管腔無滲出，上皮細胞排列整齊；與對照組比較，模型組大鼠腎小球膨出、囊腔變小，部分腎小管上皮細胞空泡變性、萎縮壞死，炎癥細胞浸潤明顯增多；與模型組比較，TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷情況逐漸好轉(zhuǎn)，炎性滲出逐漸減少，腎小球大小、形狀及結(jié)構(gòu)逐漸恢復正常。（見圖4）

圖4 各組大鼠腎組織HE 染色圖 （×400）

2.5 大鼠腎臟組織系膜基質(zhì)、基底組織學變化 PAS染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。與對照組比較，模型組大鼠腎組織有大量紅染糖原沉積；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎小球基底膜逐漸變薄，系膜區(qū)域范圍減小，糖原沉積逐漸減少，腎小管管狀結(jié)構(gòu)逐漸恢復正常。（見圖5）

圖5 各組大鼠腎組織PAS 染色圖 （×400）

2.6 大鼠腎臟組織膠原蛋白沉積情況 Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。與對照組比較，模型組大鼠腎小球及腎小管間質(zhì)病變處膠原蛋白過度沉積，呈深色藍染，腎纖維化嚴重；與模型組比較，TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織膠原纖維藍染變淡，范圍減少，腎纖維化程度逐漸減弱。（見圖6）

圖6 各組大鼠腎組織Masson 染色圖 （×400）

2.7 各組大鼠腎組織中MDA含量及SOD活性比較 5組大鼠腎組織中MDA含量及SOD活性比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠腎組織中MDA含量高于對照組（P<0.05），SOD活性低于對照組（P<0.05）；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織中MDA含量均低于模型組（P<0.05），SOD活性均高于模型組（P<0.05）；TPG高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織中MDA含量均低于TPG低劑量組（P<0.05），SOD活性均高于TPG低劑量組（P<0.05）；二甲雙胍組大鼠腎組織中MDA含量低于TPG高劑量組（P<0.05），SOD活性高于TPG高劑量組（P<0.05）。（見圖7）

圖7 各組大鼠腎臟組織中MDA 含量及SOD 活性比較（±s，n=10）

2.8 各組大鼠腎組織中Nrf2、HO-1、α-SMA、FN蛋白相對表達量比較 5組大鼠腎組織中總Nrf2蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；5組大鼠腎組織中核Nrf2、HO-1、α-SMA、FN蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組大鼠腎組織中核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均低于對照組（P<0.05），α-SMA、FN蛋白相對表達量均高于對照組（P<0.05）；TPG低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織中核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均高于模型組（P<0.05），α-SMA、FN蛋白相對表達量均低于模型組（P<0.05）；TPG高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織中核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均高于TPG低劑量組（P<0.05），α-SMA、FN蛋白相對表達量均低于TPG低劑量組（P<0.05）；二甲雙胍組大鼠腎組織中核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均高于TPG高劑量組（P<0.05），α-SMA、FN蛋白相對表達量均低于TPG高劑量組（P<0.05）。（見圖8～9）

圖8 各組大鼠腎組織相關(guān)蛋白表達Western blotting 圖

3 討 論

有研究表明，改善糖尿病腎臟病炎癥反應(yīng)、清除炎癥因子可達到改善TIF的作用[12]。但據(jù)其他文獻報道，氧化應(yīng)激在TIF及系膜硬化、足細胞異常和壁上皮細胞損傷引起的腎小球硬化中同樣具有重要驅(qū)動作用[13]。TIF作為進行性腎臟病常見途徑，其特點為ECM蛋白在腎單位間隙中積聚，為腎功能下降指標，標志著不可逆腎損傷[14]。這提示抗氧化應(yīng)激反應(yīng)也是DKD治療策略的重要參考機制之一。

持續(xù)高血糖水平可促進腎小球脂質(zhì)過氧化和系膜細胞中H2O2的產(chǎn)生，導致氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。本研究中大鼠經(jīng)連續(xù)單次腹腔注射STZ后，F(xiàn)BG水平持續(xù)升高并出現(xiàn)尿蛋白陽性，提示成功誘導構(gòu)建DKD大鼠模型。與對照組比較，模型組大鼠機體狀態(tài)不佳，KI、尿Alb、Scr及BUN水平等腎臟功能障礙指標均升高，提示高FBG可驅(qū)動糖尿病大鼠腎臟損傷及機體狀態(tài)失常。二甲雙胍為雙胍衍生物，已成為治療2型糖尿病的首選一線口服降糖藥[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)低、高劑量及二甲雙胍治療后，DKD大鼠FBG水平降低，提示TPG具有降血糖作用；且大鼠KI、尿Alb、Scr及BUN水平等腎功能障礙指標均降低，機體一般體征逐漸好轉(zhuǎn)，提示TPG可能通過降低血糖改善腎功能障礙。病理組織學染色顯示：模型組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯病理變化，提示DKD大鼠腎功能障礙可能由腎組織結(jié)構(gòu)病理損傷及腎纖維化引起；經(jīng)低、高劑量及二甲雙胍治療后，DKD大鼠腎組織病理改變均明顯好轉(zhuǎn)，提示TPG可能通過降血糖作用促進DKD大鼠腎組織病理損傷的恢復，并減輕纖維化進展。

氧化還原穩(wěn)態(tài)是維持正常生理的重要組成部分。MDA、SOD為氧化應(yīng)激標志物，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，SOD是一種清除氧自由基的金屬酶，兩者均可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低。二甲雙胍可通過降低血糖增強機體抗氧化狀態(tài)[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中MDA含量高于對照組，SOD活性低于對照組，提示機體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，且抗氧化能力較弱；經(jīng)低、高劑量TPG及二甲雙胍治療后，DKD大鼠腎組織中MDA含量降低，SOD活性升高，提示TPG可通過降低氧化應(yīng)激因子表達，提高抗氧化酶活性，進而提高DKD大鼠機體抗氧化能力。Nrf2是哺乳動物細胞響應(yīng)內(nèi)源性和外源性壓力的關(guān)鍵細胞保護調(diào)節(jié)劑。生理條件下，Nrf2被其抑制性胞質(zhì)蛋白即Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）滅活；氧化損傷時，Nrf2從Keap1釋放并轉(zhuǎn)移到細胞核中，Nrf2與細胞核中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合并調(diào)節(jié)抗氧化基因（如HO-1）的轉(zhuǎn)錄，HO-1誘導被認為是對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性細胞反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量低于對照組，而經(jīng)低、高劑量TPG及二甲雙胍治療后，DKD大鼠核Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均升高，提示TPG可能通過激活Nrf2/HO-1通路提高機體抗氧化水平。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號通路激活可減輕腎纖維化[7]，α-SMA為肌成纖維細胞標記物，肌成纖維細胞是ECM的主要來源[21]；ECM主要由FN、膠原蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖4組成，葡萄糖水平升高可導致FN基質(zhì)組裝顯著增加[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中α-SMA及FN蛋白相對表達量均高于對照組，提示腎纖維化嚴重；經(jīng)低、高劑量TPG及二甲雙胍治療后，DKD大鼠腎組織中α-SMA及FN蛋白相對表達水平均降低，提示TPG可能通過激活Nrf2/HO-1通路減輕DKD大鼠腎纖維化。

綜上所述，TPG可改善DKD大鼠機體狀態(tài)及組織病理損傷，減弱腎纖維化程度，降低血糖，增強腎功能，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路，提高DKD大鼠抗氧化能力有關(guān)。