丁輝,謝甲貝,李修嶺,韓雙印,周炳喜

(河南省人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 鄭州 450003)

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor-modified T cells,CAR-T)是腫瘤細(xì)胞免疫治療新方法。經(jīng)過基因改造后的T細(xì)胞獲得了多種功能表型,表現(xiàn)出良好的腫瘤特異殺傷作用,在白血病、淋巴瘤等血液腫瘤中表現(xiàn)出驚人效果,這促使研究者探索其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用前景[1-2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、黏蛋白1(mucin 1,MUC1)等分子靶點(diǎn)在腦膠質(zhì)瘤、肺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤中的體內(nèi)外試驗(yàn)取得了初步的進(jìn)展[3-4]。食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害大眾健康,盡管近年在早期診斷、手術(shù)切除及放化療等方面取得進(jìn)步,但預(yù)后仍差。本研究基于前期研制的CAR-T[5],以食管癌為研究對象、EGFR Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)為分子靶點(diǎn),探索其對食管癌細(xì)胞EC109的殺傷活性,旨在為食管癌細(xì)胞免疫治療提供試驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料限制性內(nèi)切酶EcoRI及BamHⅠ購自BioLabs公司,質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司。淋巴細(xì)胞Ficoll分離液購自TBD公司,pCDH慢病毒載體購于Novagen公司,重組人源化CD3單抗及CD28單抗購自Novoprotein公司。Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG F(ab)2抗體購自Jackson公司。p24蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自Abcam公司,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購自Beyotime公司,干擾素γ(interferon,IFN-γ)ELISA試劑盒購自NEOBIOSCIENCE公司。細(xì)胞株EC109、EC109-EGFRvⅢ由本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF級NSG小鼠購自上海南方模式生物。

1.2 pEGFRvⅢ/CAR表達(dá)載體的構(gòu)建前期構(gòu)建的二代CAR表達(dá)框EGFRvⅢ scFv-Hinge-TM-ICOS-CD3(1 314 bp)通過引物CAR-F(5’-GCGAATTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT-3’)和CAR-R(5’-CGGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCA-3’)擴(kuò)增后克隆入pCDH慢病毒轉(zhuǎn)移載體的MCS位點(diǎn)(EcoRI和BamHI,下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)),構(gòu)建pEGFRvⅢ/CAR。質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶片段分析(EcoRI/BamHI雙酶切、12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳)、核酸測序鑒定。

1.3 EGFRvⅢ/CAR-T制備健康成人外周血單個核細(xì)胞用Ficoll密度梯度法分離、提取,T淋巴細(xì)胞用自然沉降法純化。CD3/CD28mAb包被平板(5 mg·L-1)激活T細(xì)胞,輔以白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2(終濃度500 U·mL-1)培養(yǎng)擴(kuò)增。EGFRvⅢ/CAR慢病毒包裝:將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(pEGFRvⅢ/CAR)、包裝質(zhì)粒(pCMV-dR8.9)、包膜質(zhì)粒(pVSV-G)以磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T,病毒過濾、濃縮后用p24 ELISA試劑盒檢測病毒滴度,再用于轉(zhuǎn)染T細(xì)胞[5]。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞加入熒光抗體1 μL[Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG F(ab)2抗體],避光孵育30 min,PBS洗滌后,用流式細(xì)胞儀檢測EGFRvⅢ/CAR表達(dá)。

1.4 LDH細(xì)胞毒性試驗(yàn)和IFN-γ水平檢測以EC109-EGFRvⅢ為靶細(xì)胞,接種于96孔板(每孔1×104),效應(yīng)細(xì)胞EGFRvⅢ/CAR-T按效靶比(E∶T)5∶1、10∶1、20∶1、40∶1加入,混合培養(yǎng)24 h(37 ℃,CO2體積分?jǐn)?shù)5%)。收上清后,細(xì)胞加入150 μL LDH釋放試劑孵育1 h,分別取各孔上清120 μL上機(jī)檢測。設(shè)GFP慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞(GFP T)和未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞(NT T)為效應(yīng)細(xì)胞對照組,設(shè)EC109(未經(jīng)EGFRvⅢ穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)為靶細(xì)胞對照組。IFN-γ水平檢測:效應(yīng)細(xì)胞EGFRvⅢ/CAR-T與靶細(xì)胞EC109-EGFRvⅢ按 E∶T=5∶1在24孔板中混合培養(yǎng)24 h(37 ℃,CO2體積分?jǐn)?shù)5%),用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清IFN-γ含量。

1.5 NSG小鼠異種移植模型建立6周齡雌性NSG小鼠皮下接種5×106個EC109-EGFRvⅢ細(xì)胞,建立異種腫瘤皮下移植模型。細(xì)胞接種后10～14 d,腫瘤體積約500 mm3時,將建模成功小鼠分為3組:EGFRvⅢ/CAR-T組、未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞組(NT T)、PBS組,后2組為對照組,每組4只。效應(yīng)細(xì)胞通過尾靜脈注射(每100 μL 1×107個細(xì)胞)。動物實(shí)驗(yàn)方案通過河南省人民醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查。

2 結(jié)果

2.1 pEGFRvⅢ/CAR載體構(gòu)建EGFRvⅢ/CAR結(jié)構(gòu)如圖1A、B所示,信號肽引導(dǎo)穿膜表達(dá),胞外區(qū)負(fù)責(zé)抗原識別結(jié)合(EGFRvⅢ scFv,Hinger),跨膜區(qū)錨定受體(TM)和胞內(nèi)信號區(qū)激活T細(xì)胞(ICOS,CD3),全長942個氨基酸。重組載體EGFRvⅢ/CAR經(jīng)EcoRI和BamHⅠ雙酶切鑒定、12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳,基因片段大小一致。經(jīng)DNA測序和NCBI/Blast軟件核酸序列同源性分析,各基因片段序列和連接無誤,pEGFRvⅢ/CAR表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A為EGFRvⅢ/CAR各基因片連接示意圖;B為CAR功能結(jié)構(gòu)示意圖;C為流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFRvⅢ/CAR-T細(xì)胞表達(dá)效率,a為設(shè)門,b為EGFRvⅢ在T細(xì)胞表達(dá)率。

2.2 EGFRvⅢ/CAR-T慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染效率檢測采用三質(zhì)粒慢病毒包裝細(xì)胞體系(pEGFRvⅢ/CAR、pVSV-G、pCMV-dR8.9),磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T,病毒滴度為(4～9)×106TU·mL-1。慢病毒感染后,流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFRvⅢ/CAR表達(dá)率約為82%(圖1C),轉(zhuǎn)染效率可。

2.3 EGFRvⅢ/CAR-T靶向殺傷活性效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合培養(yǎng),設(shè)效靶比(E∶T)為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1,混合培養(yǎng)24 h后,LDH檢測結(jié)果顯示:隨著效靶比的不斷增加,EGFRvⅢ/CAR-T細(xì)胞殺傷EC109-EGFRvⅢ的作用逐漸提高,E∶T為5∶1時,靶細(xì)胞裂解死亡,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而效應(yīng)細(xì)胞對照組(GFP T,NT T)和靶細(xì)胞對照組(EC109)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2A、2B。ELISA法檢測混合培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ水平,結(jié)果顯示:EGFRvⅢ/CAR-T組(E∶T為5∶1,24 h)IFN-γ為(2 100.6±85)ng·L-1,高于對照組(GFP T,NT T),而對照組細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2C。

A為EGFRvⅢ/CAR-T細(xì)胞對EC109-EGFRvⅢ細(xì)胞殺傷活性;B為對照組EC109細(xì)胞;C為IFN-γ釋放情況,GFP T和NT T為效應(yīng)細(xì)胞對照組,EC109為靶細(xì)胞對照組;*P<0.05。

2.4 NSG小鼠移植瘤模型腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)NSG小鼠腫瘤模型分3組,EGFRvⅢ/CAR-T組小鼠在細(xì)胞注射3周后腫瘤生長得到抑制,而對照組(NT T,PBS)腫瘤繼續(xù)生長。遵循動物倫理要求,小鼠腫瘤體積超過1 500 mm3時終止觀察,安樂處死。腫瘤生長曲線顯示,EGFRvⅢ/CAR-T組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注:實(shí)驗(yàn)組為EGFRvⅢ/CAR-T細(xì)胞;對照組為未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞(NT T)和PBS;**P<0.01。

3 討論

近年,腫瘤免疫治療取得了可喜的進(jìn)步,從免疫檢測點(diǎn)抑制劑(例如細(xì)胞程序化死亡受體-1/programmed death-1,PD-1)到CAR-T,都展示出良好的抗腫瘤作用,免疫治療進(jìn)入了快速發(fā)展的時代[6]。CAR將單鏈抗體、T細(xì)胞激活基因片段和共刺激分子嵌合于一體,發(fā)揮抗體的特異識別結(jié)合和T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入T細(xì)胞(CAR-T),使其獲得腫瘤殺傷活性[7-8]。然而,實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞免疫治療面臨諸多挑戰(zhàn),特異靶點(diǎn)缺乏、分子異質(zhì)性、抗原遞呈不足、免疫抑制微環(huán)境等因素影響其抗腫瘤作用[9]。食管癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率高,預(yù)后差,CAR-T免疫治療食管癌仍在實(shí)驗(yàn)室和臨床探索中[10],所選分子靶點(diǎn)有EGFR、肝配蛋白A型受體2(ephrin type-A receptor 2,EphA2)、CD276等。

EGFRvⅢ是為數(shù)不多的腫瘤特異性抗原之一,在多種人類惡性腫瘤中有高表達(dá)率,其作為腫瘤靶向治療、免疫治療的分子靶點(diǎn)廣受關(guān)注。靶向EGFRvⅢ的各種策略在積極探索中,包括治療性抗體、疫苗、小分子藥物、CAR-T等[11-13]。CliniTrial網(wǎng)站顯示多個EGFRvⅢ CAR-T在國內(nèi)外進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段,初步的結(jié)果顯示其有良好的治療作用[14-15]。本研究前期通過抗體工程技術(shù)獲得EGFRvⅢ單鏈抗體(scFv),基于此研制了重組抗體及嵌合抗原受體[5,16]。本試驗(yàn)驗(yàn)證了EGFRvⅢ CAR-T細(xì)胞(EGFRvⅢ scFv-Hinge-TM-ICOS-CD3)對表達(dá)EGFRvⅢ食管癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng),在效靶比5∶1時即表現(xiàn)出良好的殺傷作用,而對照組細(xì)胞沒有裂解死亡,說明了EGFRvⅢ CAR-T細(xì)胞的特異性殺傷作用。

CAR有多種結(jié)構(gòu)組合,胞內(nèi)T細(xì)胞活化區(qū)有CD28、CD134、CD137、ICOS等共刺激分子和T細(xì)胞活化基序(CD3),新一代CAR嵌入有調(diào)控、遷移、持久等功能的分子[17]。本研究所用CAR以ICOS(inducible costimulator,ICOS)為共刺激分子,制備慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞,以EC109-EGFRvⅢ為靶細(xì)胞(人食管鱗癌細(xì)胞株EC109穩(wěn)轉(zhuǎn)EGFRvⅢ)進(jìn)行體外試驗(yàn),無論是LDH釋放試驗(yàn)或IFN-γ分泌檢測,效應(yīng)細(xì)胞EGFRvⅢ/CAR-T都表現(xiàn)出對靶細(xì)胞的特異殺傷作用,且隨著效靶比的增加,細(xì)胞毒性作用提高,而對照組細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì)胞對照組)無細(xì)胞裂解或死亡變化。NSG異種移植小鼠模型EGFRvIII/CAR-T輸注后,實(shí)驗(yàn)組腫瘤得到有效抑制,而對照組小鼠多數(shù)由于腫瘤負(fù)荷過重而處死。

CAR-T細(xì)胞免疫治療的問世揭開了腫瘤免疫治療的新篇章,已有8款CAR-T細(xì)胞獲得美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用,我國也有2款細(xì)胞獲得批準(zhǔn),更多的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究為食管癌的CAR-T細(xì)胞免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ),旨在為消化道腫瘤免疫治療探索新方法。然而,體外試驗(yàn)和動物模型與人類腫瘤的體內(nèi)環(huán)境存在差別,研究結(jié)果還需要臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著研究的不斷深入,新的分子靶點(diǎn)、完善的嵌合結(jié)構(gòu)、安全的細(xì)胞、有效的治療方案會進(jìn)入人們的視線,必將為廣大腫瘤患者帶來益處[18-19]。