陳 旭,左 濤,周勝杰,楊 蕊,于 剛,秦傳新,馬振華

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心/三亞熱帶水產(chǎn)研究院,海南 三亞 572018; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510300 )

水環(huán)境作為魚(yú)類(lèi)生活的場(chǎng)所,其鹽度對(duì)魚(yú)類(lèi)的存活、生長(zhǎng)、代謝和非特異性免疫具有顯著的影響[1-3]。諸多人為因素和自然因素都會(huì)引起鹽度的變化,鹽度的變化迫使魚(yú)類(lèi)機(jī)體作出應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致活性氧自由基的增多,若不能夠及時(shí)清除會(huì)引起魚(yú)體氧化損傷。魚(yú)類(lèi)機(jī)體為防止這種傷害,保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡,形成了特定的抗氧化防御體系,其防御體系由酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化物構(gòu)成,過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等是其主要代表。另外,Na+/K+-ATP酶,是鰓部重要的離子調(diào)節(jié)酶[4]。

甘草(Radix Glycyrrhizae)又名“國(guó)老”,主要活性成分為甘草黃酮、甘草酸、甘草次酸、甘草多糖、生物堿、三萜類(lèi)化合物等[5],具有保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血糖以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用和生物學(xué)功能[6-10]。關(guān)于甘草及其活性成分對(duì)魚(yú)類(lèi)的作用,諸多學(xué)者通過(guò)伴飼投喂的方式,進(jìn)行了相關(guān)的研究,如:甘草次酸對(duì)團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[11]幼魚(yú)腸道消化酶活性和胴體組成的影響;甘草對(duì)黃金鱸(Percaflavescens)[12-13]的生長(zhǎng)、生化、免疫以及組織病理學(xué)特征的影響;亞硝酸鹽脅迫下,發(fā)酵甘草對(duì)斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)[14]幼魚(yú)成活率、血液指標(biāo)與抗氧化能力的影響。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中合理地運(yùn)用甘草,不僅可以避免病原菌的抗藥性問(wèn)題,還可以利用甘草純天然的特性避免養(yǎng)殖水體中藥物殘留超標(biāo)的問(wèn)題[15]。

尖吻鱸(Latescalcarifer)別名金目鱸或紅目鱸,屬鱸形目鱸亞目尖吻鱸科,原產(chǎn)于印度-太平洋地區(qū),為暖水廣鹽性魚(yú)類(lèi)。因其肉質(zhì)好、生長(zhǎng)快、抗逆強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)高,且飼料營(yíng)養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖的熱門(mén)魚(yú)種[16-19]。隨著無(wú)公害水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病害防治用藥要求越來(lái)越高,許多常用抗生素類(lèi)藥物被列為禁用藥物,因此替代藥物的研究已成為刻不容緩的課題[20]。甘草具有純天然的特性,對(duì)水體和魚(yú)體均污染較小,可以避免化學(xué)藥物以及抗生素等引發(fā)病原菌的抗藥性問(wèn)題。筆者之前的研究表明,飼料中添加甘草能提高尖吻鱸幼魚(yú)的免疫力和鰓Na+/K+-ATP酶活性,并提高在低溫脅迫下的生存能力[1]。為進(jìn)一步探明飼喂甘草后尖吻鱸應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的能力,筆者在飼料中添加甘草投喂尖吻鱸56 d,探討鹽度脅迫前后尖吻鱸幼魚(yú)相關(guān)酶活性的變化情況,以期為解析飼喂甘草后尖吻鱸對(duì)鹽度驟變的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料,促進(jìn)尖吻鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)與試劑

試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心(海南省陵水縣)開(kāi)展,尖吻鱸幼魚(yú)初始平均體長(zhǎng)(9.09±1.72) cm、平均體質(zhì)量(13.89±2.50) g。添加甘草的飼料飼養(yǎng)尖吻鱸56 d后,其終末平均體長(zhǎng)(11.49±1.39) cm、平均體質(zhì)量(28.51±3.47) g,鹽度脅迫試驗(yàn)開(kāi)始前24 h禁食。過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、溶菌酶、Na+/K+-ATP酶活性,丙二醛含量和總抗氧化能力采用微板法測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。試驗(yàn)淡水為曝氣24 h后的自來(lái)水,養(yǎng)殖過(guò)程中的水質(zhì)指標(biāo)為:pH 7.15、氨氮0 mg/L、亞硝態(tài)氮0 mg/L。飼養(yǎng)海水為經(jīng)過(guò)砂濾后的自然海水,主要水質(zhì)指標(biāo)為:pH 7.50、氨氮<0.01 mg/L、亞硝態(tài)氮<0.02 mg/L。

1.2 飼養(yǎng)飼料的配制

飼料中甘草粉的添加量分別為0(對(duì)照組)、10、30、50 g/kg,共4組。甘草粉購(gòu)自亳州市德永堂生物科技有限公司。飼養(yǎng)飼料自行制作,嚴(yán)格把控質(zhì)量。所有飼料原料粉碎過(guò)80目篩后,按配方比例加入各原料和水混勻,制成粒徑3.0 mm的顆粒,曬干后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料配方及成分參考文獻(xiàn)[1]。

1.3 試驗(yàn)方法與樣品采集

每組3個(gè)平行,每個(gè)平行40尾魚(yú),養(yǎng)殖采用500 L玻璃纖維桶。試驗(yàn)期間對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)進(jìn)行飽食投喂,日投喂2次(9:00、16:00),投喂1 h后吸出殘餌和糞便。每隔5 d換水1次,不間斷充氣,養(yǎng)殖周期為56 d。養(yǎng)殖結(jié)束后,依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,每桶選取體表光滑、無(wú)損傷、游動(dòng)活潑、反應(yīng)機(jī)敏、攝食良好的尖吻鱸幼魚(yú)10尾,由養(yǎng)殖玻璃纖維桶轉(zhuǎn)移至室內(nèi)100 L塑料桶內(nèi)進(jìn)行淡水脅迫試驗(yàn)。桶內(nèi)自來(lái)水體積約為40 L,脅迫時(shí)長(zhǎng)為24 h,不間斷充氣。試驗(yàn)水溫為自然水溫(28.5 ℃),玻璃纖維桶養(yǎng)殖海水鹽度為32.1。

試驗(yàn)結(jié)束后,為避免撈取應(yīng)激,直接滴入丁香酚至塑料桶中進(jìn)行短暫麻醉,斷尾取血,保存于離心管中,4 ℃靜置24 h。再取肝臟和鰓等部位,于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。解凍后用DREAMEL研磨儀研磨肝臟和鰓,再放入EXPERT 18K-R冷凍離心機(jī)于4 ℃、2500 r/min(離心半徑6.88 cm)離心10 min,取上清液用于酶活性的測(cè)定。所有測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定,分別為過(guò)氧化氫酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A007-1-1)、總超氧化物歧化酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A001-1-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A005-1-2)、過(guò)氧化物酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A084-1-1)、丙二醛試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A003-1-1)、溶菌酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A050-1-1)、總抗氧化能力試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A015-1-2)以及超微量Na+/K+-ATP酶試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)A070-2-1)。嚴(yán)格按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作。在多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰Biotek Synergy H1)中測(cè)定吸光值,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的計(jì)算公式換算成相應(yīng)含量或酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖,并進(jìn)行單因素方差分析,各試驗(yàn)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯多重比較,當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 血清過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、溶菌酶活性,丙二醛含量和總抗氧化能力

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清過(guò)氧化氫酶活性的影響見(jiàn)圖1a。脅迫前、后相比,脅迫后除30 g/kg添加組差異不顯著外,其他各組過(guò)氧化氫酶活性均顯著高于脅迫前各組(P<0.05);脅迫后,10 g/kg添加組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照組和50 g/kg添加組,30 g/kg添加組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05);脅迫前,30 g/kg添加組過(guò)氧化氫酶活性為最高,均顯著高于其他各組(P<0.05),10 g/kg添加組和50 g/kg添加組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清總超氧化物歧化酶活性的影響見(jiàn)圖1b。脅迫后對(duì)照組和10 g/kg添加組總超氧化物歧化酶活性顯著低于脅迫前,而30 g/kg添加組和50 g/kg添加組差異不顯著(P>0.05);脅迫后,除50 g/kg添加組血清總超氧化物歧化酶活性顯著高于30 g/kg添加組外,其他各組間均差異不顯著(P>0.05);脅迫前各組總超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響見(jiàn)圖1c。脅迫后血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性均顯著低于脅迫前(P<0.05);脅迫后,10 g/kg添加組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著高于其他各組,其他各組間差異均不顯著(P>0.05);脅迫前,30 g/kg添加組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶為最高,與50 g/kg添加組差異不顯著,顯著高于對(duì)照組和10 g/kg添加組(P<0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清丙二醛含量的影響見(jiàn)圖1d。脅迫后血清丙二醛含量均顯著低于鹽度脅迫前(P<0.05);脅迫后,30 g/kg添加組與50 g/kg添加組差異不顯著,均顯著低于對(duì)照組和10 g/kg添加組(P<0.05);脅迫前,10 g/kg添加組丙二醛含量最高,顯著高于30 g/kg添加組和50 g/kg添加組(P<0.05),對(duì)照組顯著高于30 g/kg添加組(P<0.05)。

圖1 甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、溶菌酶活性和丙二醛以及總抗氧化能力的變化Fig.1 Changes in activities of serum catalase, total superoxide dismutase, glutathione peroxidase and lysozyme, contents of malondialdehyde, and total antioxidant capacity of juvenile Asian seabass L. calcarifer fed diets containing Radix Glyeyrrhizae and exposed to low salinity stress不同字母表示各組間存在顯著差異(P<0.05),星號(hào)表示脅迫前后存在顯著差異(P<0.05);下同.Means with different letters are significant differences among groups (P<0.05), and asterisks indicate significant differences under stress (P<0.05); et sequentia.

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清溶菌酶活性的影響見(jiàn)圖1e。脅迫后除50 g/kg添加組差異不顯著外,其他各組血清溶菌酶活性均顯著低于脅迫前(P<0.05);脅迫后,50 g/kg添加組溶菌酶活性為最高,均顯著高于其他各組(P<0.05),10 g/kg添加組與30 g/kg添加組差異不顯著,均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);脅迫前,10 g/kg添加組與50 g/kg添加組差異不顯著,均顯著低于對(duì)照組和30 g/kg添加組(P<0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后血清總抗氧化能力的影響見(jiàn)圖1f。除10 g/kg添加組差異不顯著外,脅迫后血清總抗氧化能力均顯著高于脅迫前各相應(yīng)組(P<0.05);脅迫前后,總抗氧化能力變化基本一致,均隨著甘草含量的增加逐漸升高;脅迫后,50 g/kg添加組總抗氧化能力顯著高于其他各組,30 g/kg添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05);脅迫前,50 g/kg添加組總抗氧化能力顯著高于對(duì)照組和10 g/kg添加組,10 g/kg添加組與30 g/kg添加組差異不顯著,均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 肝臟過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶活性,丙二醛含量和總抗氧化能力

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟過(guò)氧化氫酶活性的影響見(jiàn)圖2a。脅迫后各組肝臟過(guò)氧化氫酶活性均顯著高于脅迫前(P<0.05);脅迫后,各組過(guò)氧化氫酶活性無(wú)顯著性差異(P>0.05);脅迫前,10 g/kg添加組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照組和50 g/kg添加組(P<0.05),30 g/kg添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟總超氧化物歧化酶活性的影響見(jiàn)圖2b。脅迫后除50 g/kg添加組差異不顯著外,其他各組肝臟總超氧化物歧化酶活性均顯著高于脅迫前(P<0.05);脅迫后,對(duì)照組總超氧化物歧化酶活性顯著高于30 g/kg添加組和50 g/kg添加組,10 g/kg添加組與30 g/kg添加組差異不顯著,均顯著高于50 g/kg添加組(P<0.05);脅迫前,各組總超氧化物歧化酶活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響見(jiàn)圖2c。脅迫后各組肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性均顯著低于脅迫前(P<0.05);脅迫后,各組肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性差異不顯著(P>0.05);脅迫前,除對(duì)照組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著高于其他各組外,其他各組間差異均不顯著(P>0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟過(guò)氧化物酶活性的影響見(jiàn)圖2d。脅迫后各組肝臟過(guò)氧化物酶活性均顯著高于脅迫前(P<0.05);脅迫后,除50 g/kg添加組過(guò)氧化物酶活性顯著低于對(duì)照組外,其他各組間均差異不顯著(P>0.05);脅迫前,除10 g/kg添加組過(guò)氧化物酶活性顯著高于對(duì)照組和50 g/kg添加組外,其他各組間均差異不顯著(P>0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟丙二醛含量的影響見(jiàn)圖2e。脅迫后各組肝臟丙二醛含量均顯著高于脅迫前(P<0.05);脅迫后,除10 g/kg添加組丙二醛含量顯著高于對(duì)照組外,其他各組間均差異不顯著(P>0.05);脅迫前,除50 g/kg添加組丙二醛含量顯著低于其他各組外,其他各組間差異均不顯著(P>0.05)。

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟總抗氧化能力的影響見(jiàn)圖2f。脅迫后肝臟總抗氧化能力均顯著高于脅迫前(P<0.05);脅迫后,總抗氧化能力隨甘草含量的增加均顯著逐漸降低(P<0.05);脅迫前,30 g/kg添加組總抗氧化能力為最高,均顯著高于其他各組,10 g/kg添加組與50 g/kg添加組差異不顯著,均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后肝臟過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量以及總抗氧化能力的變化Fig.2 Changes in activities of liver catalase, total superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and peroxidase, malondialdehyde content and total antioxidant capacity of juvenile Asian seabass L. calcarifer fed diets containing Radix Glyeyrrhizae and exposed to low salinity stress

2.3 鰓Na+/K+-ATP酶活性

甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后鰓Na+/K+-ATP酶活性的影響見(jiàn)圖3。脅迫后,除10 g/kg添加組差異不顯著外,其他各組鰓Na+/K+-ATP酶活性均顯著低于脅迫前各相應(yīng)組(P<0.05);脅迫后,除50 g/kg添加組Na+/K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組外,其他各組間差異均不顯著(P>0.05);脅迫前,30 g/kg添加組Na+/K+-ATP酶活性為最高,與50 g/kg添加組相比差異不顯著,顯著高于對(duì)照組和10 g/kg添加組(P<0.05),50 g/kg添加組與對(duì)照組相比,差異不顯著,顯著高于10 g/kg添加組(P<0.05)。

圖3 甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)鹽度脅迫前后鰓Na+/K+-ATP酶活性的變化Fig.3 Changes in activity of Na+/K+-ATPase in gill of juvenile Asian seabass L. calcarifer fed diets containing Radix Glyeyrrhizae and exposed to low salinity stress

3 討 論

3.1 飼喂甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)在低鹽脅迫下血清抗氧化能力的影響

魚(yú)類(lèi)屬于低等脊椎動(dòng)物,當(dāng)受到鹽度環(huán)境刺激時(shí),其非特異性免疫系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)逆環(huán)境應(yīng)激時(shí)起主導(dǎo)作用,魚(yú)類(lèi)相關(guān)抗氧化酶活性會(huì)發(fā)生改變,以響應(yīng)鹽度應(yīng)激反應(yīng)。這些酶在一定程度上能夠反映動(dòng)物在不同環(huán)境條件下的生理狀況,可以作為衡量動(dòng)物是否受到外界環(huán)境脅迫的重要生理指標(biāo)[21-23]。過(guò)氧化氫酶可以通過(guò)催化機(jī)體中的H2O2分解為H2O和O2,從而減輕和防止自由基對(duì)細(xì)胞的毒害[24];總抗氧化能力則包含了組織或體液中非酶和酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的總抗氧化水平[25];總超氧化物歧化酶是一種抗氧化金屬酶,在平衡機(jī)體氧化反應(yīng)中起到重要作用;丙二醛為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物,該物質(zhì)水平增加可加劇膜損傷等[26]。同時(shí),血清生化水平是反映動(dòng)物對(duì)環(huán)境應(yīng)激時(shí)體內(nèi)機(jī)能狀態(tài)變化的一個(gè)重要指標(biāo),在魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)研究中被廣泛采用。鹽度突變脅迫下,駝背鱸(Cromilepptesaltivelis♀)×鞍帶石斑魚(yú)(Epinepheluslanceolatus♂)雜交子代幼魚(yú)血清中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶在第3、7天活性均顯著高于其他同時(shí)期各組,丙二醛在第7天顯著升高[27];鹽度脅迫后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),鹽度9組黃姑魚(yú)(Nibeaalbiflora)幼魚(yú)血清丙二醛含量增加后逐漸降低,鹽度16組血清丙二醛含量呈降低后逐漸恢復(fù)趨勢(shì)[28];在不同鹽度水平中飼養(yǎng)56 d后,卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)幼魚(yú)血清丙二醛含量和溶菌酶活性無(wú)明顯差異[29];隨著鹽度脅迫時(shí)間的增加,鹽度5組黃條(Seriolaaureovittata)幼魚(yú)血清超氧化物歧化酶活性逐漸降低,而鹽度10組卻逐漸升高[30]。這些研究表明,魚(yú)類(lèi)幼魚(yú)血清各相關(guān)抗氧化酶活性隨著鹽度脅迫方式和程度的不同而發(fā)生相應(yīng)的變化,這些變化間不存在明顯的線(xiàn)性關(guān)系。

本試驗(yàn)中,溶菌酶活性和丙二醛含量在低鹽脅迫前變化無(wú)規(guī)則,脅迫后溶菌酶活性隨甘草添加量的增加而升高;無(wú)論是否存在鹽度脅迫,對(duì)照組過(guò)氧化氫酶活性和總抗氧化能力均隨甘草添加量的增加有不同程度升高;同時(shí),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性在脅迫前也有不同程度升高。這說(shuō)明飼料中添加甘草投喂尖吻鱸對(duì)幼魚(yú)血清抗氧化酶活性和抗氧化能力有增強(qiáng)作用。

從鹽度脅迫前后指標(biāo)變化情況看,幼魚(yú)血清過(guò)氧化氫酶活性和總抗氧化能力均有不同程度升高,而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量顯著降低,同時(shí),除30 g/kg添加組和50 g/kg添加組總超氧化物歧化酶活性及50 g/kg添加組溶菌酶活性脅迫前后差異不顯著外,其他各組在脅迫后顯著降低。添加甘草后,低鹽脅迫下尖吻鱸幼魚(yú)血清過(guò)氧化氫酶活性升高以清除過(guò)多活性氧自由基,避免低鹽脅迫對(duì)機(jī)體造成損傷;而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、溶菌酶活性和丙二醛含量降低的原因是低鹽的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生了大量的活性氧自由基,機(jī)體為清除這些活性氧自由基,消耗了血清中大量的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛和溶菌酶。同時(shí)說(shuō)明,低鹽脅迫下添加甘草能增強(qiáng)尖吻鱸幼魚(yú)血清抗氧化能力。

3.2 飼喂甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)在低鹽脅迫下肝臟抗氧化能力的影響

在魚(yú)類(lèi)正常的生命活動(dòng)中,有機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基處于一種不斷產(chǎn)生,又不斷被清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)魚(yú)類(lèi)受到外界環(huán)境刺激時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基增多,過(guò)量的活性氧自由基可損傷DNA、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)等在水生動(dòng)物中的功能。為了清除細(xì)胞中過(guò)多活性氧自由基,魚(yú)類(lèi)抗氧化防御體系作出反應(yīng),通過(guò)氧化還原反應(yīng)進(jìn)行多層次應(yīng)激性調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其相關(guān)抗氧化酶活性發(fā)生相應(yīng)改變,以消除體內(nèi)過(guò)多活性氧自由基[31-33]。肝臟作為重要的代謝器官,是魚(yú)類(lèi)解毒的主要場(chǎng)所[34]。如克氏雙鋸魚(yú)(Amphiprionclarkii)幼魚(yú)在鹽度脅迫24 h內(nèi)肝臟過(guò)氧化氫酶活性呈上升趨勢(shì),且鹽度變化幅度越大酶活性增強(qiáng)的幅度越大[35]。花鱸(Lateolabraxmaculatus)幼魚(yú)在鹽度脅迫下,肝組織中過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性隨鹽度的增加而逐漸下降[36];相同鹽度脅迫下,大鱗鲃(Luciobarbuscapito)肝組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先升后降再趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)[37];隨著低鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),黃姑魚(yú)幼魚(yú)肝臟超氧化物歧化酶活性先升后降,而過(guò)氧化氫酶活性呈降低-升高-降低的變化,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性出現(xiàn)了顯著增強(qiáng),且鹽度越低變化越劇烈,總抗氧化能力在鹽度16組呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)后減弱變化,而鹽度9組總抗氧化能力顯著減弱后維持在較低水平[28]。

本試驗(yàn)中,低鹽脅迫前,幼魚(yú)肝臟各抗氧化指標(biāo)總體表現(xiàn)為:丙二醛含量在甘草最高添加組(50 g/kg添加)顯著降低,過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和總抗氧化能力隨甘草添加量的增加均有不同程度升高。說(shuō)明飼料中添加甘草投喂尖吻鱸對(duì)幼魚(yú)肝臟抗氧化酶活性和抗氧化能力有增強(qiáng)作用。脅迫后,10 g/kg添加組丙二醛含量顯著高于對(duì)照組,過(guò)氧化物酶、總超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力均不同程度低于對(duì)照組。說(shuō)明投喂甘草后,由海水轉(zhuǎn)移至淡水時(shí),尖吻鱸幼魚(yú)肝臟抗氧化酶活性和抗氧化能力面對(duì)脅迫表現(xiàn)能力不足。

由鹽度脅迫前后指標(biāo)變化情況可知,除甘草最高添加組(50 g/kg添加組)總超氧化物歧化酶活性差異不顯著及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著降低外,脅迫后的其他指標(biāo)均顯著高于脅迫前。這說(shuō)明投喂甘草后,尖吻鱸幼魚(yú)面對(duì)低鹽脅迫時(shí),迫使機(jī)體抗氧化系統(tǒng)作出反應(yīng),提高肝臟過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量以及總抗氧化能力,以清除過(guò)多的活性氧自由基,避免低鹽脅迫對(duì)機(jī)體造成損傷;而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性降低是由清除過(guò)多的活性氧自由基消耗了大量的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶所致。

3.3 飼喂甘草對(duì)尖吻鱸幼魚(yú)在低鹽脅迫下鰓 Na+/K+-ATP酶活性的影響

鰓不僅是魚(yú)類(lèi)的呼吸器官,還參與機(jī)體的氨氮排泄、滲透壓調(diào)節(jié)等。Na+/K+-ATP酶是鰓組織泌氯細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上存在的一種蛋白酶,其特征是參與細(xì)胞內(nèi)外Na+與K+的主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+和滲透壓平衡。Na+/K+-ATP酶在魚(yú)體滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中起非常重要的作用,是研究廣鹽性魚(yú)類(lèi)滲透調(diào)控能力的一個(gè)重要指標(biāo)[38-40]。因物種、脅迫方式、持續(xù)時(shí)間等的不同,魚(yú)類(lèi)鰓組織Na+/K+-ATP酶活性在鹽度脅迫下的變化存在較大差異。花鱸在淡水化養(yǎng)殖階段,鰓組織中Na+/K+-ATP酶活性呈先降后升的趨勢(shì),在鹽度降到0之后的適應(yīng)階段,Na+/K+-ATP酶活性緩慢回升并趨于穩(wěn)定[40];海水鹽度由25突降至21、17和13后,大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)鰓絲Na+/K+-ATP酶活性呈先升后降的變化趨勢(shì)且降低幅度與鹽度突降幅度正相關(guān)[41];采用逐步過(guò)渡法對(duì)大麻哈魚(yú)(Oncorhynchusketa)幼魚(yú)進(jìn)行不同鹽度馴化42 d后發(fā)現(xiàn),鰓組織Na+/K+-ATP酶活性隨著鹽度的升高呈先升后降的趨勢(shì),且酶活性最高為鹽度8組、最低為鹽度24組[38]。

本試驗(yàn)中,除脅迫前10 g/kg甘草添加組低于對(duì)照組外,無(wú)論是否存在鹽度脅迫,其他各甘草添加組的Na+/K+-ATP酶活性均高于對(duì)照組。說(shuō)明在飼料中添加小劑量(10 g/kg)甘草抑制了尖吻鱸幼魚(yú)鰓Na+/K+-ATP酶活性,而大劑量(30～50 g/kg)甘草則起增強(qiáng)作用。同時(shí),面對(duì)低鹽脅迫,在飼料中添加甘草能提高鰓Na+/K+-ATP酶活性。

從鹽度脅迫前后指標(biāo)變化情況看,除10 g/kg甘草添加組脅迫前后差異不顯著外,其他組脅迫后鰓Na+/K+-ATP酶活性均顯著低于脅迫前。說(shuō)明低鹽對(duì)飼喂甘草后的尖吻鱸幼魚(yú)鰓Na+/K+-ATP酶活性具有顯著的影響,低鹽脅迫導(dǎo)致鰓ATP酶活性升高,增加鰓上皮細(xì)胞膜的通透性,加快Na+、Cl-等離子的外排,并將體內(nèi)多余的鹽離子排出體外,維持細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+和滲透壓平衡,從而保證生命活動(dòng)和能量代謝的正常進(jìn)行[42-43]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中,飼喂甘草后,無(wú)論是否存在鹽度脅迫,尖吻鱸幼魚(yú)血清過(guò)氧化氫酶活性和總抗氧化能力對(duì)初始值(對(duì)照組)均有不同程度的升高;同時(shí),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性在脅迫前也有不同程度升高;從脅迫前后各指標(biāo)變化情況看,除總超氧化物歧化酶活性在最高組(50 g/kg添加組)差異不顯著和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著降低外,尖吻鱸幼魚(yú)肝臟脅迫后其他指標(biāo)均顯著高于脅迫前以及50 g/kg添加組,鰓Na+/K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明飼料中添加甘草可以顯著增強(qiáng)尖吻鱸抗氧化、維持離子調(diào)節(jié)酶活性及抗環(huán)境脅迫的能力。但采用甘草原粉作為研究對(duì)象具有一定局限性,主要表現(xiàn)在其含有大量的無(wú)效成分,導(dǎo)致藥效不穩(wěn)定、結(jié)果難以重復(fù)等。同時(shí),需要對(duì)甘草展開(kāi)深入研究,探明是否存在其他物質(zhì)參與調(diào)節(jié),進(jìn)一步深入探究物質(zhì)與能量的運(yùn)輸機(jī)制以及分子信號(hào)的通路機(jī)制等。