姜樂樂,郝夢秋,顧小朵,郭晨宇,李富田,王洪斌

( 江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005 )

隨著工農(nóng)業(yè)快速發(fā)展,海洋環(huán)境污染已然是全球性的問題,自上世紀(jì)后期以來,多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)在各類工業(yè)產(chǎn)品中當(dāng)作阻燃劑被普遍使用,雖然它的應(yīng)用起始階段比較晚,急性毒性低,但其持久污染性導(dǎo)致的慢性毒性很嚴重,也可沿著食物鏈富集,光化學(xué)降解是環(huán)境中多溴聯(lián)苯醚的重要降解途徑之一[1]。五溴聯(lián)苯醚BDE-85性質(zhì)穩(wěn)定且難以降解,焚燒或浸泡含有PBDE-99的工業(yè)廢物,能使其通過蒸發(fā)和滲漏等進入環(huán)境中,在水體、大氣、土壤、海洋生物及人體等生物和非生物樣本中均能檢測到BDE-99[2-8],研究證明,多溴聯(lián)苯醚對乳腺癌細胞的相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有一定的影響[9]。李玉芳等[10]在沿海魚類體內(nèi)均檢出高含量的低溴代的PBDE-47和高溴代的PBDE-209,后者在某些水產(chǎn)品的檢出率和檢出劑量有逐年上升的趨勢。現(xiàn)已證實,多溴聯(lián)苯醚可以通過食物鏈在海洋生物的體內(nèi)富集并且產(chǎn)生毒性效應(yīng)[11]。海洋微藻作為初級生產(chǎn)者,多溴聯(lián)苯醚對它有更強的急性毒性和遺傳毒性,雖然由于微藻細胞壁結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致富集能力不同,但對其抗氧化防御系統(tǒng)的破壞作用也較強[12],并且微藻體內(nèi)的多溴聯(lián)苯醚的富集與氮磷比、營養(yǎng)鹽濃度、氮濃度等環(huán)境因子密切相關(guān)[13-17]。目前關(guān)于多溴聯(lián)苯醚對海洋微藻毒性脅迫效應(yīng)的研究鮮有報道,國內(nèi)研究也剛起步,主要分析微藻在受到多溴聯(lián)苯醚的脅迫后,其生長狀況、光合系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)在暴露后的響應(yīng)[18]。不同海洋微藻對多溴聯(lián)苯醚的響應(yīng)具有差異性[18]。

隨著人類活動的干預(yù),排放的大量CO2通過海氣界面進入海洋,打破海洋原有的碳酸鹽平衡進而造成海洋酸化。海洋酸化直接導(dǎo)致海洋中污染物的理化性質(zhì)改變與毒性效應(yīng)增強。如海洋酸化能夠影響重金屬的溶解并改變其離子形態(tài)與比例[19]、抑制有機污染物的降解[20],影響微塑料的吸附行為等[21],進而引發(fā)毒性效應(yīng)的改變。全球氣候變化下的污染物海洋生物效應(yīng)為當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的熱點和前沿問題,筆者聚焦不同pH條件下的多溴聯(lián)苯醚對海水小球藻(Chlorellavulgaris)的毒性效應(yīng),探討pH和污染物雙重脅迫對小球藻的生長、光合作用和氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響等,旨為海洋污染防控及管理決策提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗用海水小球藻為江蘇海洋大學(xué)海洋藻類生物學(xué)研究室保存藻種。小球藻培養(yǎng)采用人工海水,配方:NaCl 490.80 g,KBr 2.00 g,KCl 14.00 g,H3BO30.06 g,Na2SO481.80 g,NaHCO33.70 g,NaF 0.06 g,CaCl2·2H2O 30.80 g,MgCl2·6H2O 222.00 g,SrCl2·6H2O 0.34 g,ddH2O 20 L。小球藻培養(yǎng)基采用通用的f/2營養(yǎng)液。

1.2 試劑

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;五溴聯(lián)苯醚選取的試劑為BDE-85(C12H5Br5O),購于上海源葉生物科技有限公司,需溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中配制成母液(25 μg/mL)使用(已有研究表明,N,N-二甲基甲酰胺對藻類的生長沒有影響[22]);其他試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計

小球藻的培養(yǎng)條件:光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(GXZ-500C,寧波江南儀器廠),光照周期為12L∶12D,培養(yǎng)溫度為25 ℃,培養(yǎng)光照度為8300 lx。pH梯度設(shè)置:8.66、8.44、8.19、7.93,pH梯度通過HCl和NaOH調(diào)節(jié),pH計(Seven Easy, METTLER)測定。BDE-85含量梯度設(shè)置[22]:0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每個含量設(shè)置3個平行。人工海水經(jīng)高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50SH,上海博訊實業(yè)有限公司)105 ℃滅菌15 min,500 mL PC瓶100 ℃滅菌5 min,按1000∶1(體積比)加入過濾除菌的f/2營養(yǎng)液,藻種活化2～3 d達到指數(shù)生長期,接種密度約為2.5×104個/mL的小球藻藻液1 mL至500 mL的培養(yǎng)液中,接種密度達50個/mL,搖勻后置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后取樣觀察。向?qū)?yīng)的BDE-85含量梯度培養(yǎng)瓶中,分別加入BDE-85母液,使各組終含量分別為0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每隔24 h取樣進行測定分析(取100 mL培養(yǎng)藻液濃縮藻密度至約100×104個/mL),培養(yǎng)期間及時補充營養(yǎng)液,使小球藻生長始終保持在對數(shù)生長期,并且等比例加入BDE-85,調(diào)節(jié)并保持培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH不變,保持藻液密度約為3×104個/mL。在加入BDE-85的24 h后,開始持續(xù)3 d測定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性(試劑盒檢測,南京建成生物工程公司;全波長酶標(biāo)儀,ReadMax1900,上海閃譜生物科技有限公司),連續(xù)5 d測定生長量,第4天測定光合放氧速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等。小球藻培養(yǎng)期間,每天振搖數(shù)次,隨機調(diào)換培養(yǎng)瓶位置,并在固定時間取樣分析。試驗過程中所有操作均嚴格控制在無菌條件下進行(超凈工作臺,SW-CJ-ZF,蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.3.2 比生長速率測定

連續(xù)5 d測定生長量,取濃縮藻液2～3 mL,立刻加入魯哥試劑固定,保存于4 ℃冰箱中,便于后續(xù)計數(shù),計算比生長速率。將固定后的藻液充分搖勻后,取100 μL使用0.1 mL浮游計數(shù)板(DSJ-01,廈門登迅儀器設(shè)備有限公司)在顯微鏡下計數(shù),每個樣品每次計數(shù)重復(fù)3次,降低計數(shù)的試驗誤差。比生長速率按下式計算:

μ=( lnN1-lnN0)/(t1-t0)

式中,N1為當(dāng)天計數(shù)所得每毫升藻液中所含藻量,N0為前一天或前幾天計數(shù)所得每毫升藻液中所含藻量,t1-t0為兩次計數(shù)之間所隔時間。

1.3.3 超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性測定

無菌條件下取1 mL待測濃縮藻液,放置在1.5 mL的離心管中,4 ℃、5000 r/min離心(離心半徑7.5 cm)10 min,棄去上清液,沉淀物加1 mL生理鹽水,超聲波破碎法[23]破碎海水小球藻細胞(HD2200,寧波新芝生物科技股份有限公司;破碎條件:功率195 W,超聲波工作時間3 s,間歇時間7 s,破碎強度65%,工作時間10 min),顯微鏡下觀察到無完整藻細胞后,再次離心,離心參數(shù)同上,取上清液檢測超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性。按檢測試劑盒說明書進行。

1.3.4 凈光合放氧速率和暗呼吸速率測定

使用液相氧電極(17304,漢莎科學(xué)儀器有限公司)來測定海水小球藻的光合放氧和呼吸耗氧速率,注意8300 lx的光照度點及保持壓強在0.02 MPa以下,防止微藻破裂死亡,并且保證每次加入的測定藻樣液為2 mL,藻液的細胞密度要通過顯微鏡精準(zhǔn)計數(shù),以供計算速率時所需。

1.3.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

將濃縮的待測藻液3 mL放入葉綠素?zé)晒鉁y定儀(PAM,AP100,捷克)的比色皿中,光照度設(shè)置為8300 lx,先測定藻細胞活性(QY),再測定其快速光響應(yīng)曲線(RLC),利用公式計算相對電子傳遞速率(rETR):

rETR= PAR×Y×0.5

式中,PAR為光合有效輻射,Y為光系統(tǒng)Ⅱ的有效光化學(xué)量子產(chǎn)量。

快速光響應(yīng)曲線擬合使用的公式:

rETR=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

式中,a、b、c均表示擬合曲線中的常數(shù)。

通過a、b、c的值計算電子傳輸效率(α)、rETR的最大值(rETRmax)和飽和輻照點(Ik):

α=1/c

rETRmax=1/[b+2(a×c)1/2]

Ik=c/[b+2(a×c)1/2]

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Origin 2018軟件分析處理作圖,用不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著,即t檢驗中P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻的比生長速率

不同pH條件下BDE-85含量的比生長速率見圖1。在4種pH梯度(8.66、8.44、8.19、7.93)下,3.04 μg/g和6.08 μg/g試驗組的比生長速率相較于對照組均明顯升高,經(jīng)單因素方差分析,可知每個pH條件下的6.08 μg/g試驗組與其對照組間差異顯著(P<0.05),分別高出對照組22.87%、9.29%、18.94%、19.77%;pH 8.66、pH 8.44和pH 7.93這3個梯度的24.32 μg/g試驗組和對照組之間差異顯著(P<0.05),比對照組分別低39.06%、30.45%、14.93%;在4種pH梯度下,24.32 μg/g試驗組的比生長速率始終處于較對照組小的趨勢,說明BDE-85含量過高,對小球藻的生長產(chǎn)生明顯抑制作用;當(dāng)pH為8.19時,只有6.08 μg/g試驗組的比生長速率相較于對照組有顯著差異(P<0.05),促進小球藻的生長,24.32 μg/g試驗組的比生長速率較對照組低15.83%;pH 7.93時的多個含量BDE-85處理組比生長速率較pH 8.19時普遍偏高。分析認為,酸化條件促進海水小球藻生長的同時,也在一定程度上抑制了BDE-85的致毒脅迫效應(yīng)。結(jié)論與凈光合放氧速率和暗呼吸速率的結(jié)果相符合(待發(fā)表)。

圖1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的比生長速率Fig.1 Specific growth rate of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同.Different superscipts represent significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.2 小球藻的凈光合放氧速率和暗呼吸速率

不同pH條件下6組含量BDE-85的凈光合放氧速率和暗呼吸速率見圖2和圖3。試驗結(jié)果表明,相較于pH 8.19時,其他3個pH條件下的凈光合放氧速率均明顯呈現(xiàn)上升趨勢,特別是pH 7.93時的凈光合放氧速率,在6個BDE-85含量組中分別比pH 8.19時高出283.33%、136.65%、594.98%、1879.35%、535.16%、1585.23%;而暗呼吸速率則呈下降趨勢,與pH 8.19時相比,pH 7.93各組中除對照組高出23.9%,其他5組分別降低46.57%、66.95%、12.32%、31.28%、43.15%。這表明低pH條件增強了對照組的暗呼吸速率和凈光合放氧速率。海水小球藻有機物的積累增加,且這個過程中所消耗的能量也隨之增加,總體上呈現(xiàn)出比生長速率上升趨勢,但BDE-85的加入使暗呼吸速率下降的同時,凈光合放氧速率上升,這種相反的趨勢表現(xiàn)出有機污染物的毒性在某種程度上被低pH條件減輕,生長加速,特別是6.08 μg/g試驗組存在顯著性差異。在pH 7.93條件下的組間的單因素方差分析中,6.08 μg/g試驗組的凈光合放速率與其他組均差異顯著(P<0.05),其暗呼吸速率與3.04、12.16、24.32 μg/g試驗組存在顯著差異,6.08 μg/g試驗組在低pH條件水平下凈光合放氧速率比對照組高出18.43%,24.32 μg/g試驗組則比對照組低39.98%。結(jié)合其比生長速率可以得出,在低pH條件下及本試驗設(shè)置的6種BDE-85含量梯度中,BDE-85含量為6.08 μg/g時對小球藻的緩解毒性效果最強。在低pH條件下的24.32 μg/g試驗組中,凈光合放氧速率和暗呼吸速率相較于對照組均存在顯著性差異,呈下降趨勢,推測原因是毒性過高使藻細胞受損,細胞活力減弱。

2.3 小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)

4個不同pH條件下BDE-85含量的葉綠素?zé)晒鈪?shù)見表1。4個pH條件下均出現(xiàn)了光抑制作用,24.32 μg/g試驗組較其他5組的光抑制作用更明顯,α、Ik、rETRmax參數(shù)值波動較大。pH 8.44和pH 8.19時的α、Ik、rETRmax參數(shù)值不存在顯著性差異。由表1可見,比較對應(yīng)BDE-85含量梯度的rETRmax參數(shù)值,pH 7.93時各BDE-85含量的rETRmax比pH 8.19時的rETRmax分別高出57.17%、64.30%、56.90%、46.71%、57.14%和66.30%。pH 7.93時的rETRmax偏高表明光系統(tǒng)Ⅱ的效率更高,光合作用增強,BDE-85的致毒效應(yīng)被低pH條件緩解,但在低pH條件下,高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比受光抑制作用更加明顯,這也反映出高含量BDE-85對藻細胞光合系統(tǒng)穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的損害作用。

表1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Tab.1 Chlorophyll fluorescence parameters of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.4 小球藻的過氧化氫酶活性

在4個不同pH條件下,6個BDE-85含量組的過氧化氫酶活性變化趨勢見圖4。除pH 8.44條件下,其他3個pH條件下小球藻的過氧化氫酶活性在連續(xù)3 d的檢測中整體均呈上升趨勢,pH 8.66時3 d的上升趨勢顯著(P<0.05)。pH 8.19時,6.08 μg/g試驗組和24.32 μg/g試驗組與對照組相比差異顯著(P<0.05),pH 7.93時也存在相同結(jié)果,表明中含量6.08 μg/g及以上的BDE-85均能顯著刺激藻細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),以抵抗BDE-85的損傷脅迫。同時pH 8.19條件下和pH 7.93條件下對比可知,連續(xù)3 d測定后者6.08 μg/g試驗組的過氧化氫酶活性比前者分別降低42.82%、36.81%和27.30%,說明低pH條件在該含量下顯著地緩解了BDE-85對藻細胞的毒害作用。試驗證實,24 h和48 h時藻細胞可能處于誘導(dǎo)激活酶活的反應(yīng)過程,而且在低pH條件下,中、低含量的BDE-85的毒性可以被不同程度的緩解,24.32 μg/g試驗組的被緩解效果不佳,應(yīng)該歸因于BDE-85含量太高,對藻細胞的損傷過強已經(jīng)難以通過低pH條件緩解。

圖4 不同pH和BDE-85含量下小球藻的過氧化氫酶活性Fig.4 Catalase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.5 小球藻的超氧化物歧化酶活性

4個pH條件下6個BDE-85含量組的小球藻超氧化物歧化酶活性變化趨勢見圖5。整體來看,隨著培養(yǎng)時間的增加,4個pH條件下的海水小球藻超氧化物歧化酶活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢。4個pH條件下的48 h和72 h時,6.08 μg/g試驗組的超氧化物歧化酶活性始終維持最高,與多個組存在顯著性差異(P<0.05),其中48 h時,6.08 μg/g試驗組相較對照組分別高出76.05%、37.59%、20.90%和39.45%,其在整體趨勢中超氧化物歧化酶活性最高。pH 8.19和pH 7.93條件下相比,后者整體活性比前者要高約10%,表明低pH條件促進了藻細胞產(chǎn)生超氧化物歧化酶,從而激活抗氧化系統(tǒng)清除氧自由基,以對抗BDE-85的毒性。但隨著時間的增加,BDE-85對藻細胞的超氧化物歧化酶調(diào)節(jié)系統(tǒng)應(yīng)該存在某種程度的損傷,特別是4個pH條件下高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比分別降低了23.52%、29.29%、29.46%和16.35%,說明高含量BDE-85對藻細胞的損傷更嚴重。pH 7.93條件下的24.32 μg/g試驗組的超氧化物歧化酶活性在72 h呈現(xiàn)下降趨勢,并且超氧化物歧化酶活性始終不如6.08 μg/g試驗組的高,但二者的超氧化物歧化酶活性均顯示增強,分析認為,BDE-85和低pH條件的耦聯(lián)對超氧化物歧化酶的生理調(diào)節(jié)機制受BDE-85含量的影響較小。

圖5 不同pH和BDE-85含量下小球藻的超氧化物歧化酶活性Fig.5 Superoxide dismutase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

3 討 論

3.1 不同pH條件下五溴聯(lián)苯醚BDE-85對小球藻光合特性的影響

高坤山[24]指出,藻類的二氧化碳濃縮機制(CCMs)會受到環(huán)境酸化的影響而下調(diào),因此藻細胞獲得的光能量增多,這有利于增強光合作用,增加有機物的積累和細胞活力從而抵抗BDE-85的毒害作用。酸化條件下的海水小球藻的最大電子傳遞速率較對照組顯著性增加,但光抑制現(xiàn)象也同樣加劇,二氧化碳濃縮機制會使酸化條件下的小球藻更易受到高光脅迫,而高含量的BDE-85加劇了光抑制效應(yīng)。在低pH條件下及設(shè)置的6種含量梯度中,BDE-85含量為6.08 μg/g時對小球藻的緩解毒性效果最強,高含量24.32 μg/g試驗組中,凈光合放氧速率和暗呼吸速率相較于對照組均存在顯著差異,呈下降趨勢。筆者認為,是由BDE-85含量過高、毒性過強使藻細胞受損嚴重,細胞活力嚴重減弱所致。pH 7.93 時各BDE-85含量相對應(yīng)的最大電子傳遞速率普遍高于pH 8.16、8.66時,而pH 7.93時的最大相對電子傳遞速率偏高表明光系統(tǒng)Ⅱ的效率更高,說明光合作用增強,BDE-85的致毒效應(yīng)被酸化緩解;但在低pH條件下,高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比,受光抑制作用更加明顯,這也反映出高含量BDE-85對藻細胞的光合系統(tǒng)的穩(wěn)定性產(chǎn)生了一定的損害。試驗結(jié)果表明,低pH條件促進了小球藻生長的同時也在一定程度上緩解了BDE-85的毒性效應(yīng),小球藻的比生長速率、凈光合放氧速率和暗呼吸速率以及最大電子傳遞速率的結(jié)果均能驗證,但當(dāng)BDE-85含量過高時,低pH條件的緩解效果弱于毒害作用。

3.2 不同pH條件下BDE-85對小球藻抗氧化系統(tǒng)的影響

高坤山[24]提到,酸化會影響藻類的生理調(diào)節(jié)機制、膜的氧化還原作用及其離子透過性。本試驗結(jié)果表明,低pH條件能顯著緩解BDE-85對藻細胞的毒害作用。試驗證實,24 h和48 h時藻細胞可能處于誘導(dǎo)激活酶活的反應(yīng)階段,而且在低pH條件下,中、低含量BDE-85的毒性可以被不同程度的緩解,24.32 μg/g試驗組的被緩解效果不佳,應(yīng)該歸因于BDE-85含量太高,對藻細胞的損傷過強已經(jīng)難以通過低pH條件緩解。李卓娜等[25]研究發(fā)現(xiàn),BDE-49對多種微藻的抗氧化特性、光合特性有影響,BDE-49對海洋微藻具有毒性,并且驗證了微藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)、電子傳遞速率和過氧化物酶活性等是判定BDE-49污染水平的標(biāo)志性依據(jù)。本試驗結(jié)果顯示,低pH條件和高含量BDE-85的耦聯(lián)對過氧化氫酶的生理調(diào)節(jié)機制影響顯著,而BDE-85和低pH條件的耦聯(lián)對超氧化物歧化酶的生理調(diào)節(jié)機制受BDE-85含量的影響較小。筆者僅做了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶兩種酶活性的檢測,可能具有一定的局限性,還需進一步研究探討。

筆者僅對單一藻種和單種多溴聯(lián)苯醚污染物進行了致毒脅迫效應(yīng)的測定,下一步可以深入研究多種多溴聯(lián)苯醚污染物對某一種藻的致毒脅迫效應(yīng),從而模擬海水中的藻類生長狀況,為多溴聯(lián)苯醚污染的防治與管控提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)不同pH條件下,中、低含量的BDE-85對小球藻的生長有一定的促進作用,高含量的BDE-85對小球藻的生長有顯著抑制作用。

(2)低pH條件使經(jīng)過中、低含量BDE-85處理的小球藻的抗氧化作用和光合作用增強,在一定程度上緩解了BDE-85的細胞毒性,穩(wěn)定并促進小球藻的生長,但在高含量的BDE-85處理中,二者交互作用不明顯。