王俊林，張 煒，尚宇欣，李文博，唐 璐，朱 怡，趙偉伊，蘇艷芳*

?化學(xué)成分 ?

藏藥肉果草中1對新的木脂素苷

王俊林1，張 煒2，尚宇欣1，李文博1，唐 璐1，朱 怡1，趙偉伊1，蘇艷芳1*

1. 天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072 2. 青海省藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810016

研究肉果草的化學(xué)成分。綜合應(yīng)用硅膠、Sephadex LH-20和制備液相等多種色譜方法進行分離純化，并根據(jù)化合物NMR譜、MS譜等數(shù)據(jù)進行結(jié)構(gòu)鑒定。采用斑馬魚炎癥模型進行抗炎活性評價。從肉果草乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中分離得到1對新的四氫呋喃型木脂素苷類化合物（1a和1b）和已知化合物肉果草苷（2）。化合物1a和1b為新化合物，是1對能發(fā)生差向異構(gòu)的、不可分的化合物，分別命名為肉果草苷A（1a）、肉果草苷B（1b），且具有抗炎活性。

肉果草；四氫呋喃型木脂素；肉果草苷A；肉果草苷B；抗炎

肉果草為玄參科（Scrophulariaceae）肉果草屬Hook. f. et Thoms.植物肉果草的干燥全草，別名蘭石草，藏文音譯名為巴雅巴、哇亞巴，主要分布于印度及我國西藏、青海、四川、云等地，生于海拔2000～4500 m的草地、疏林中或溝谷旁，在藏藥中被列為上品，其全草可清肺熱、止咳、消膿。肉果草作為藏族民間常用藥，多入丸、散劑，在上市品種二十五味肺病膠囊（丸）、回生甘露丸、二十五味竺黃散等藏成藥中均有應(yīng)用[1-4]。文獻報道其主要化學(xué)成分為木脂素苷類、黃酮類、萜類等[5-7]。為進一步明確其物質(zhì)基礎(chǔ)，對肉果草乙醇提取物醋酸乙酯萃取部位的成分進行了研究，分離并鑒定了3個四氫呋喃型木脂素，分別為肉果草苷A [(7,8, 8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，1a] 和肉果草苷B [(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，1b]、肉果草苷（tibeticoside，2）。其中，化合物1a和1b為1對新的木脂素苷類化合物，結(jié)構(gòu)見圖1；活性研究結(jié)果表明化合物1（1a和1b）具有抗炎活性。

圖1 化合物1a和1b的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker Avance III核磁共振譜儀（400 MHz，瑞士Bruker公司），Nikon SMZ800N體視顯微鏡（日本Nikon公司），Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia公司）；ZORBAX SB-C18HPLC制備柱（250 mm×21.2 mm，7 μm，美國Agilent公司）；ZORBAX SB-C18HPLC分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司）；薄層色譜硅膠（GF254，10～40 μm）和柱色譜硅膠（100～200、200～300目，青島海洋化工廠）。色譜甲醇（天津市康科德科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水；轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚[（：）]，由天津大學(xué)龐美俊課題組提供），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）試劑（美國Sigma-Aldrich公司），E3培養(yǎng)基（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4）。

肉果草于2021年8月采集于青海省黃南藏族自治州澤庫縣，經(jīng)青海省藥品檢驗檢測院駱桂法主任藥師鑒定為玄參科肉果草屬植物肉果草Hook. f. et Thoms的全草。標本（21258201）保存于青海省藥品檢驗檢測院中藏藥標本館。

2 方法

2.1 提取與分離

肉果草（7.8 kg）用95%乙醇于室溫冷浸2周，然后依次用95%、60%乙醇各加熱回流提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得到提取物2.9 kg，提取物用適量蒸餾水混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物（240 g）、醋酸乙酯萃取物（670 g）和正丁醇萃取物（1000 g）。取醋酸乙酯萃取物650 g，經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0→98∶2→94∶6→90∶10→84∶16→74∶26）梯度洗脫，每500毫升接收1個流分，共得到163個流分，合并Frs. 107～109（23 g），經(jīng)硅膠柱色譜進一步分離，二氯甲烷-甲醇（94∶6→92∶8→90∶10）梯度洗脫，得次級流分SubFrs. 1～116，合并SubFrs. 6～13（0.77 g），再經(jīng)2次Sephadex LH-20柱色譜分離純化，甲醇洗脫，得到化合物2（290 mg）；SubFr. 99（0.48 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離純化，甲醇洗脫，得到化合物1（80 mg）：化合物1經(jīng)HPLC分析（45%甲醇-水，Zorbax SB-C18柱，檢測波長254 nm）提示為2個化合物的混合物，其保留時間分別為7 min（1a）和16 min（1b），進一步經(jīng)HPLC制備后發(fā)現(xiàn)1a和1b是一對能發(fā)生互變異構(gòu)的、不可分的化合物。

2.2 酸水解實驗

化合物1（1a和1b）的水解薄層色譜分析[8]：將化合物1（1a和1b）點樣在硅膠TLC板上，置于裝有濃鹽酸的密閉容器中，室溫HCl蒸氣水解30分鐘，取出薄層板，室溫晾至無酸味，將葡萄糖標準品點樣在同一硅膠TLC板上，二氯甲烷-甲醇-水- 冰醋酸（3.5∶1.5∶3滴∶3滴）展開，鄰苯二甲酸苯胺顯色，結(jié)果表明化合物1（1a和1b）酸水解產(chǎn)物中的糖為葡萄糖（R值為0.41）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1a的氫譜中，H6.75～7.09有2組苯環(huán)氫信號，分別為[H6.87 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2), 6.85 (1H, dd,= 8.0, 1.3 Hz, H-6), 6.75 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5)] 和[H6.93 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2′), 6.91 (1H, dd,= 8.0, 1.3 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′)]，結(jié)合12個芳香碳信號(C149.2, 149.0, 148.5, 148.1, 139.3, 139.1, 121.6, 119.9, 109.0, 108.9, 108.4, 107.3)，提示存在2個1,2,4-三取代苯環(huán)；氫譜信號H5.91, 5.91 (4H, s, H-10, 10′)，結(jié)合碳譜信號(C102.37, 102.33)，表明1a結(jié)構(gòu)中有2個亞甲二氧基；氫譜信號[H4.44 (1H, t-like,= 8.9 Hz, H-9a), 4.15 (1H, dd,= 8.9, 3.9 Hz, H-9b)]，結(jié)合碳譜信號C70.8，表明1a結(jié)構(gòu)中有1個氧化亞甲基；氫譜信號[H5.26 (1H, d,= 2.1 Hz, H-7), 4.69 (1H, d,= 10.1 Hz, H-7′), 4.91 (1H, d,= 4.3 Hz, H-9′)]，結(jié)合碳譜信號(C85.0, 71.5, 99.6)，表明1a結(jié)構(gòu)中有3個氧化次甲基，與化合物2相比，化合物1的H-9′低場位移約H1，C-9′低場位移約C28，提示化合物2的C-9′位連接羥基；氫譜中H4.41 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′′）為六碳糖的端基氫信號，結(jié)合碳信號(C104.2, 78.3, 78.2, 75.3, 71.7, 62.9)，結(jié)合酸水解結(jié)果表明化合物1a為1個β--葡萄吡喃糖苷（1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1）。以上信息提示化合物1a為1個四氫呋喃型木脂素葡萄糖苷。

由1H-1H COSY譜（圖2），可觀察到H-7/H-8/H-9、H-7′/H-8′/H-9′以及H-8/H-8′之間存在明顯相關(guān)，結(jié)合H-7 (H5.26)/C-2 (C107.3), C-6 (C119.9), C-9 (C70.8)、H-7′ (H4.69)/C-2′ (C108.4), C-6′ (C121.6), C-9′ (C99.6) 的HMBC相關(guān)，進一步確證該化合物1a母核為7--9′四氫呋喃型木脂素（圖2）；H-9 (H4.44, 4.15)/C-1′′ (C104.2) 的HMBC相關(guān)，確定C-9連接葡萄糖形成氧苷，H-10, 10′ (H5.91)/C-3 (C148.1), C-4 (C149.0), C-3′ (C148.5), C-4′ (C149.2) 的HMBC相關(guān)，確定2個亞甲二氧基分別與苯環(huán)的C-3, 4和C-3′, 4′相連。

表1 化合物1a和1b的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(400/100 MHz CD3OD)

a, b, c, d, e 表示可分別互換

a, b, c, d, e may be interchanged in each column.

圖2 化合物1a的主要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)

在NOESY譜圖中，1a的NOE相關(guān)信號（圖3）：H-7 (H5.26)/H-9′ (H4.91), H-8 (H2.59)/H-9′ (H4.91), H-7′ (H4.69)/H-9 (H4.44, 4.15)，說明化合物1a的H-7，H-8，H-8′和H-9′位于四氫呋喃環(huán)同側(cè)，同時，在ECD譜中250 nm 和300 nm處均顯示負Cotton效應(yīng)（圖4），結(jié)合參考文獻數(shù)據(jù)[9-10]推測化合物1a的絕對構(gòu)型為7,8,8′,9′，鑒定為(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside?；衔?a的結(jié)構(gòu)見圖1，經(jīng)Sci-Finder檢索為新化合物，命名為肉果草苷A。

圖3 化合物1a和1b的主要NOESY相關(guān)

圖4 化合物1a的ECD圖

化合物1b：化合物1b的氫譜和碳譜與化合物1a非常相似（表1），仔細分析1b的HSQC、COSY和HMBC譜，提示化合物1a和1b均為葡萄糖苷，且苷元的平面結(jié)構(gòu)相同，進一步分析其NOESY譜（圖3），化合物1b的H-7′ (H4.73)/H-9′ (H4.99) 有NOE，說明化合物1b的H-9′與H-7、H-8、H-8′處于四氫呋喃環(huán)的異側(cè)。最后鑒定定化合物1b的結(jié)構(gòu)為(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，見圖1，經(jīng)Sci-Finder檢索為新化合物，命名為肉果草苷B。

化合物1a和1b的C-9′位連接半縮醛羥基，易發(fā)生差向異構(gòu)，不能分離純化，是一對不可分的化合物，因此只能混合鑒定其結(jié)構(gòu)[9-10]。

4 抗炎活性篩選

在體視顯微鏡（Nikon SMZ800N）下，隨機選擇受精后3 d（dpf）發(fā)育正常的斑馬魚胚胎移入24孔板中。將斑馬魚分為以下3組：空白組、模型組和實驗組。對于空白組，3 dpf的胚胎繼續(xù)在E3培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)。對于模型組，將3 dpf 的胚胎暴露于LPS（10 μg/mL）4 h，構(gòu)造斑馬魚的炎癥模型。對于實驗組，先將3 dpf的胚胎暴露于LPS（10 μg/mL）4 h，再用不同濃度（50、100和200 μmol/L）的化合物1（1a和1b）處理斑馬魚4 h，接著換為E3培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對4 dpf的斑馬魚進行麻醉，從每組中隨機選取不少于6條進行圖像采集。

a-熒光面積統(tǒng)計 b-熒光強度統(tǒng)計 與空白組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

5 討論

本實驗從肉果草中分離鑒定了1對新的四氫呋喃型木脂素苷類化合物，分別命名為肉果草苷A和肉果草苷B，是一對不可分的差向異構(gòu)體，且該化合物具有抗炎活性，為肉果草進一步研究開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A pair of new lignan glycosides from Tibetan medicine

WANG Jun-lin1, ZHANG Wei2, SHANG Yu-xin1, LI Wen-bo1, TANG Lu1, ZHU Yi1, ZHAO Wei-yi1, SU Yan-fang1

1. School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2. Qinghai Institute of Medicinal Product Inspection and Detection, Xining 810016, China

To study the chemical constituents of.The chemical constituents were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 column chromatography and preparative RP-HPLC. Their structures were elucidated by analysis of NMR and HR-ESI-MS spectroscopic data. Zebrafish model was used to evaluate the anti-inflammatory activity of compounds.A pair of new tetrahydrofuran-type lignan glycosides (1a and 1b) and a known compound (tibeticoside) were isolated from theEtOAc-soluble partition of the aqueous ethanolic extract of.Compounds 1a and 1b are new compounds, a pair of epimeric and indivisible compounds, named (7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside and (7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside, respectively. And compound 1 shows anti-inflammation activity.

Hook. f. et Thoms; tetrahydrofuran-type lignans; (7,8, 8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside; (7,8,8′,9′)- 9′-hydroxyl tibeticoside; anti-inflammation

R284.1

A

0253 - 2670(2023)10 - 3049 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.001

2023-02-21

天津市科技計劃項目（20ZXGBSY00050）

王俊林，女，碩士研究生，研究方向為天然藥物化學(xué)。E-mail: wangjunlin_001@tju.edu.cn

蘇艷芳，教授，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: suyanfang@tju.edu.cn

[責任編輯 王文倩]