袁露萍，方文秀，李夢穎，吳 優(yōu)，許曉瑩，秦路平，王小艷

中藥藥效物質(zhì)識別與作用靶標(biāo)的表征確證技術(shù)研究進(jìn)展

袁露萍，方文秀#，李夢穎，吳 優(yōu)，許曉瑩，秦路平*，王小艷*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000

中藥復(fù)雜體系中藥效物質(zhì)的識別及與作用靶標(biāo)相互作用的表征確證，是困擾中藥現(xiàn)代化研究的瓶頸難題。近年來，多種分子互作表征技術(shù)被成功應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域，用來識別和表征中藥的關(guān)鍵藥效物質(zhì)與疾病作用靶點(diǎn)的分子間相互作用。這些研究結(jié)果為探索疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)、詮釋中藥關(guān)鍵藥效物質(zhì)與其作用靶點(diǎn)精準(zhǔn)互作的藥效機(jī)制提供理論依據(jù)。通過對表面等離子體共振、等溫滴定量熱、生物膜干涉和微量熱泳動4種主要的分子互作表征技術(shù)的原理、優(yōu)勢特點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，為中藥現(xiàn)代化研究提供方法策略的參考依據(jù)。

中藥藥效物質(zhì)；藥物靶點(diǎn)；分子間相互作用；表面等離子體共振；等溫滴定量熱；生物膜干涉；微量熱泳動

中藥藥效物質(zhì)是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但由于中藥的藥效作用普遍具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，使得中藥藥效物質(zhì)的識別、作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)表征及確證異常困難。并且，臨床上常以多味中藥配伍形成復(fù)方后應(yīng)用于疾病的治療，這樣復(fù)雜的基質(zhì)體系，使其更具挑戰(zhàn)。中藥發(fā)展的難點(diǎn)在于[1]：（1）中藥的藥效物質(zhì)可能是通過介導(dǎo)體內(nèi)間接途徑發(fā)揮藥效作用，這些成分的體內(nèi)直接作用靶點(diǎn)較難明確；（2）中藥可能含有一些功效強(qiáng)但含量低的藥效物質(zhì)，這些微量藥效物質(zhì)的識別很難通過傳統(tǒng)的分離檢測手段得以實(shí)現(xiàn)；（3）中藥復(fù)方中的藥效物質(zhì)可能是由復(fù)方中多味藥材共同煎煮過程中經(jīng)多種成分相互作用發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生某些新物質(zhì)，這些新物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)較難明確。因此，如何準(zhǔn)確、靈敏、高效地從中藥的復(fù)雜基質(zhì)中識別出關(guān)鍵藥效物質(zhì)并確證其作用靶標(biāo)，是探討中藥作用機(jī)制、提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)中藥新穎用途等關(guān)乎中藥現(xiàn)代化研究與應(yīng)用的關(guān)鍵性瓶頸問題[2]。

藥物作用于機(jī)體發(fā)揮藥理效應(yīng)的本質(zhì)是藥物分子與靶標(biāo)受體間發(fā)生分子間相互作用。目前，隨著多學(xué)科知識技術(shù)的不斷交叉創(chuàng)新，陸續(xù)涌現(xiàn)出多種用于表征分子間相互作用的技術(shù)手段，如表面等離子體共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）、等溫滴定量熱技術(shù)（isothermal titration calorimetry，ITC）、生物膜層干涉技術(shù)（bio layer interferometry，BLI）、微量熱泳動技術(shù)（microscale thermophoresis，MST）等。本文通過對上述4種分子互作表征技術(shù)的原理、方法特點(diǎn)及在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，為中藥藥效物質(zhì)識別及與作用靶標(biāo)相互作用的表征確證，提供方法策略上的參考或啟示。

1 SPR技術(shù)

1.1 SPR的技術(shù)原理與方法特點(diǎn)

SPR是一種無需標(biāo)記的、表征分子間互作的光學(xué)檢測技術(shù)，能夠?qū)Ψ肿娱g相互作用的動態(tài)過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測、快速表征，并實(shí)現(xiàn)定量分析。

SPR檢測系統(tǒng)的核心元件、檢測原理與表征方法[3-4]見圖1。傳感芯片是以表面涂有一層薄金膜的玻璃片為載體，通常金膜上覆蓋有葡聚糖基質(zhì)用于固定分子。光在棱鏡與金屬膜表面形成的消逝波會擾動等離子波，兩波相遇則發(fā)生共振，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，導(dǎo)致檢測到的反射光強(qiáng)會大幅度減弱，能量幾乎為零。在反射光強(qiáng)的響應(yīng)曲線中，可以看到一個小的尖峰，此時對應(yīng)的入射光波長為共振波長，對應(yīng)的入射角為SPR角。當(dāng)光波長一定時，SPR角會隨著傳感芯片表面的折射率變化而變化，而此折射率的變化與芯片表面結(jié)合的相對分子質(zhì)量成正比。因此，可以通過監(jiān)測SPR角的動態(tài)變化獲得在芯片表面發(fā)生的分子間相互作用的特異信號。表征時，將靶點(diǎn)蛋白受體通過氨基偶聯(lián)等方式固定在傳感芯片表面；將藥物分子配制成一定濃度的溶液作為分析物，通過微射流卡盤流通到傳感芯片表面。隨著藥物分子開始與靶點(diǎn)蛋白受體發(fā)生結(jié)合，SPR信號會迅速增加；當(dāng)分析物連續(xù)輸送到傳感芯片上，受體上結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量減少，結(jié)合效應(yīng)趨于飽和時，SPR信號趨于穩(wěn)態(tài)平衡；當(dāng)不再將分析物引入分析系統(tǒng)時，結(jié)合復(fù)合物發(fā)生解離，SPR信號降低。由此，通過監(jiān)測SPR角信號的動態(tài)變化，從結(jié)合、解離反應(yīng)的表征中得到兩分子間的結(jié)合常數(shù)（association constant，a）和解離常數(shù)（dissociation constant，d），二者之比即為兩分子間的平衡解離常數(shù)（dissociation equilibrium constant，KD），該值反映出藥物與靶點(diǎn)的分子間相互作用力大小及特異性等信息。

A-SPR技術(shù)的檢測原理 B-SPR技術(shù)的表征方法

1.2 SPR技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)識別與作用靶標(biāo)表征確證中的應(yīng)用

1.2.1 中藥單味藥研究中SPR技術(shù)的應(yīng)用 王岱東等[5]和Mohanan等[6]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)，程序性死亡-1受體（programmed death-1，PD-1）是由程序性細(xì)胞死亡蛋白1基因編碼的268個氨基酸殘基組成的膜蛋白。PD-1和其配體PD-L1結(jié)合，啟動T細(xì)胞的程序性死亡，使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸。而PD-1抑制劑則可通過克服患者體內(nèi)的免疫抑制，重新激活患者自身的免疫細(xì)胞殺傷腫瘤，是一種全新的抗腫瘤免疫治療策略。因此，以PD-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等具有重要意義。中藥為尋找有效的PD-1抑制劑提供了重要的線索和巨大的化合物寶庫。王岱東等[5]通過液質(zhì)聯(lián)用分析從人參中鑒定出人參皂苷Rc、人參皂苷Ro等9個皂苷類成分，并運(yùn)用SPR技術(shù)從中識別出人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re，且這3個成分均具有與PD-1靶點(diǎn)結(jié)合活性，進(jìn)一步分別表征出它們的結(jié)合能力，即KD大小由高到低依次為人參皂苷Rb1＞人參皂苷Re＞人參皂苷Rg1；以此為基礎(chǔ)，對活性化學(xué)成分進(jìn)行細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為闡釋人參調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤的藥效機(jī)制提供依據(jù)。

1.2.2 中藥復(fù)方研究中SPR技術(shù)的應(yīng)用 He等[7]研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯在傳統(tǒng)中醫(yī)典籍記載中具有活血祛瘀、行氣止痛之功效，臨床上可用于治療以氣滯血瘀證導(dǎo)致的斑禿病。該復(fù)方由桃仁、紅花、當(dāng)歸等11味中藥組成；方中含有苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、山柰素、阿魏酸、梓醇、馬鞭草苷、β-蛻皮酮、桔梗皂苷D、芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷、甘草酸、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D等豐富的化學(xué)成分，并聯(lián)合運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬分子對接和SPR技術(shù)，預(yù)測并表征獲得了方中所含化學(xué)成分馬鞭草苷、甘草苷、山柰素和苦杏仁苷分別與斑禿病相關(guān)靶點(diǎn)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α和骨橋蛋白的藥靶兩分子間相互作用的親和力大小，為識別血府逐瘀湯中關(guān)鍵藥效物質(zhì)、闡釋其干預(yù)斑禿病的藥效作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

此外，有大量研究將系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)挖掘、計(jì)算機(jī)分子對接、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等多種技術(shù)與SPR聯(lián)合，成功地應(yīng)用于防治新型冠狀病毒肺炎、惡性腫瘤等疾病的相關(guān)中藥藥效物質(zhì)識別與其作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、表征及確證[8-11]。

2 ITC技術(shù)

2.1 ITC的技術(shù)原理與方法特點(diǎn)

ITC是一種無需標(biāo)記的、高靈敏度、高自動化操作的微量量熱儀，可連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測出分子間相互作用過程發(fā)生的熱量變化，表征出結(jié)合過程的量熱曲線，提供親和力和熱力學(xué)的全面信息，有助于了解分子間相互作用力的性質(zhì)、探索其熱力學(xué)驅(qū)動因素。

ITC檢測系統(tǒng)的核心元件、檢測原理與表征方法[12-13]見圖2，在微量量熱儀中有2個加樣池（參比池和樣品池），2池以絕熱裝置隔開。在完全相同的溫度下，將靶蛋白受體溶液加入到樣品池中，再將藥物分子配體溶液連續(xù)滴加到樣品池中；配體與受體兩分子的結(jié)合量與儀器檢測到的熱量變化成正比；隨著配體和受體間摩爾比逐漸增加，受體的結(jié)合位點(diǎn)越來越被飽和，配體結(jié)合的次數(shù)也隨之減少，導(dǎo)致結(jié)合產(chǎn)生的熱量變化也趨于緩和，直到最終樣品池中的配體相對于受體達(dá)到過量，結(jié)合反應(yīng)趨于飽和。表征時，從以時間尺度記錄熱量變化的量熱曲線，和以配體和受體的摩爾比作為橫坐標(biāo)、熱量變化為縱坐標(biāo)繪制出的熱量積分圖中，擬合獲得2分子的結(jié)合模型、a、結(jié)合焓變（Δ）、熵變（Δ）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（）、反應(yīng)吉布斯自由能（Δ）等熱力學(xué)和KD等全面信息。

2.2 ITC技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)識別與作用靶標(biāo)表征確證中的應(yīng)用

苦參具有清熱利濕、利尿解毒、改善肝功能等多種藥效[14]，其主要成分氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)尚不明晰。血清白蛋白是脊椎動物血漿中含量豐富的蛋白質(zhì)之一，具有結(jié)合、運(yùn)輸內(nèi)源與外源性物質(zhì)、維持血液膠體滲透壓、清除自由基、抑制血小板聚集等重要生理功能[15]。徐香玉等[16]運(yùn)用ITC技術(shù)表征發(fā)現(xiàn)OMT和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）可發(fā)生分子間相互作用時有2類主要結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)2分子在第1類位點(diǎn)結(jié)合時，宏觀熱力學(xué)表現(xiàn)為以熵驅(qū)動為主的焓-熵協(xié)同驅(qū)動過程，微觀上是以分子間疏水相互作用為主要驅(qū)動力，并且通過分析獲得第1類結(jié)合過程的平衡常數(shù)1＝（2.14±0.31）×105、標(biāo)準(zhǔn)摩爾Δ1＝（?1.07±0.50）kJ/mol、標(biāo)準(zhǔn)摩爾Δ1＝（?30.4±0.4）kJ/mol和最大1＝10.0±0.2等具體信息；當(dāng)2分子在第2類位點(diǎn)相結(jié)合時，宏觀熱力學(xué)則表現(xiàn)為熵驅(qū)動過程，微觀上則是以靜電相互作用力為主要驅(qū)動力，第2類結(jié)合過程的平衡常數(shù)2＝（6.84±0.32）×103，標(biāo)準(zhǔn)摩爾Δ2＝（1.91±0.03）kJ/mol，標(biāo)準(zhǔn)摩爾Δ2＝（?21.9±0.4）kJ/mol，最大2＝25.0±0.3。根據(jù)得出的不同結(jié)合位點(diǎn)相互作用的熱力學(xué)差異，進(jìn)一步結(jié)合圓二色譜結(jié)果分析，明確這2類結(jié)合過程中OMT與BSA的相互作用均可影響靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、并導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)單元相對含量變化等微觀機(jī)制。

A-ITC技術(shù)的檢測原理 B-ITC技術(shù)的表征方法

丹參是活血化瘀之良藥，但其藥效物質(zhì)及作用靶點(diǎn)仍需深入挖掘。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，可催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，使血液凝固而止血，是現(xiàn)代藥物研究中抗凝防栓的關(guān)鍵靶點(diǎn)[17]。王佳宇[18]運(yùn)用ITC技術(shù)表征發(fā)現(xiàn)丹參中的丹酚酸A、丹酚酸D、異阿魏酸、阿加曲斑與凝血酶發(fā)生分子間相互作用時Δ＜0，提示這些分子間的相互作用均可以自發(fā)發(fā)生；其中阿加曲斑與凝血酶的a最高，丹酚酸A次之；此外，通過結(jié)合Δ與Δ的數(shù)據(jù)分析，提示這5個化學(xué)成分與凝血酶的結(jié)合以離子鍵的形式發(fā)生。值得注意的是，丹酚酸D與異阿魏酸混合時與受體蛋白的a大于各自單獨(dú)滴定的a之和，且ITC表征曲線不符合Independent模型，提示丹酚酸D與異阿魏酸分別與凝血酶的不同位點(diǎn)發(fā)生相互作用。

此外，雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多種藥理作用，Peng等[19]應(yīng)用ITC技術(shù)深入探討活性成分雷公藤紅素與熱休克蛋白90相互作用的分子基礎(chǔ)，解釋了雷公藤紅素在治療癌癥和改善退行性神經(jīng)疾病方面的作用機(jī)制。這些研究結(jié)果為揭示中藥藥效物質(zhì)與其作用靶標(biāo)的藥靶互作機(jī)制提供了信息豐富的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

3 BLI技術(shù)

3.1 BLI的技術(shù)原理與方法特點(diǎn)

BLI通過實(shí)時監(jiān)測生物傳感器表面的光干涉信號，將其轉(zhuǎn)化為響應(yīng)信號，以表征獲得2分子結(jié)合過程中發(fā)生相互作用的參數(shù)信息，具有耐受粗樣品、非標(biāo)記、快速簡便、數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點(diǎn)。

BLI檢測系統(tǒng)的核心元件、檢測原理與表征方法[20]見圖3，生物傳感器由末端外添加特殊光學(xué)層的玻璃光纖制成，為分子的固定提供表面化學(xué)基質(zhì)。當(dāng)分析物與固定在生物傳感器表面上的分子結(jié)合時，會引起光學(xué)層厚度增加，反射光的路徑長度增長，導(dǎo)致干涉光譜曲線發(fā)生改變，并產(chǎn)生向右的位移。同理，當(dāng)2分子解離時，分析物從生物傳感器表面解離到溶液中，使得干涉光譜曲線向左位移。2分子發(fā)生結(jié)合，引起光干涉信號的改變。表征時，以干涉光譜曲線的偏移距離和反應(yīng)發(fā)生的時間繪制得出BLI傳感圖。通過BLI傳感圖，可在各種結(jié)合模型的基礎(chǔ)上擬合出2分子相互作用的a、d、KD和起始結(jié)合速率等數(shù)值。

3.2 BLI技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)識別與作用靶標(biāo)表征確證中的應(yīng)用

BLI技術(shù)耐受粗樣品的優(yōu)勢，更適于中藥復(fù)方提取液等這類復(fù)雜粗放樣品的藥效物質(zhì)識別與靶點(diǎn)互作機(jī)制的研究。開心散是由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓4味中藥配伍組成，主要用于治療痰阻導(dǎo)致的老年性癡呆等癥狀[21]。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是通過淀粉樣前體蛋白經(jīng)β-和γ-分泌酶裂解而成的多肽。人體中常見的亞型是Aβ1-40和Aβ1-42，其中Aβ1-42的神經(jīng)毒性更強(qiáng)，容易聚集成纖維化的沉淀，最終在腦中形成老年斑。Guo等[22]應(yīng)用BLI結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)，實(shí)時監(jiān)測出開心散提取液（依次增加質(zhì)量濃度為125～4000 μg/mL）與被生物素標(biāo)記的Aβ1-42的結(jié)合及解離能力，并表征獲得二者的a＝115 L/(mol·s)、d＝2.60×10?21/s、KD＝170 μg/mL。進(jìn)而，取BLI得到的解離液進(jìn)行液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Aβ具有很強(qiáng)結(jié)合能力的中藥成分主要有來源于茯苓的豬苓酸C、去氫土莫酸和土莫酸。

組分復(fù)方是現(xiàn)代中藥的一種新穎形式。BLI技術(shù)也同樣適用于這類相對粗放分析物的研究。丹參-人參組分復(fù)方是由丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖這3種有效組分配伍而成。該組分復(fù)方對人肺癌A549細(xì)胞具有選擇性抑制其增殖的作用，能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡和降低肺癌細(xì)胞骨架面積，但可保護(hù)正常細(xì)胞的作用[23]。為進(jìn)一步明確該組分復(fù)方的作用靶點(diǎn)，李變英等[24]應(yīng)用BLI技術(shù)平行表征了組分復(fù)方及3種單獨(dú)組分與通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的目標(biāo)多肽的親和力，結(jié)果表明與目標(biāo)多肽相互作用的親和力，組分復(fù)方最高（KD＝4.57×10?8mol/L），人參多糖（KD＝7.23×10?8mol/L）和丹參總酚酸（KD＝7.66×10?8mol/L）次之，而人參總皂苷沒有典型的結(jié)合和解離效應(yīng)，該研究結(jié)果表明丹參-人參組分復(fù)方與目標(biāo)多肽結(jié)合的主要貢獻(xiàn)成分是人參多糖和丹參總酚酸，這為現(xiàn)代中藥靶向治療肺癌的研究提供了更精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

此外，BLI技術(shù)也被應(yīng)用于從復(fù)雜分析物中垂釣出靶點(diǎn)蛋白的研究。人參皂苷作為中藥人參的主要有效成分，對腦神經(jīng)起保護(hù)作用，具有減輕興奮性毒性反應(yīng)、抗氧化和抗神經(jīng)炎癥、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化以及維持線粒體穩(wěn)定等方面的作用[25]，但該中藥成分在腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)尚不清楚。陳飛燕等[26]以直接親和法用人參總皂苷“垂釣”出了腦內(nèi)靶點(diǎn)蛋白14-3-3，該蛋白是機(jī)體內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等重要細(xì)胞生命過程的物質(zhì)基礎(chǔ)；進(jìn)而采用BLI技術(shù)分別表征“垂釣”出的蛋白14-3-3與人參總皂苷和人參皂苷單體間的相互作用，結(jié)果確認(rèn)的靶蛋白14-3-3與人參總皂苷存在明確的分子相互作用，且僅有原人參二醇（KD＝7.8×10?4mol/L）和原人參三醇（KD＝5.62×10?4mol/L）2個人參皂苷單體與“垂釣”出的腦內(nèi)靶點(diǎn)蛋白14-3-3有一定程度的相互作用，為人參總皂苷藥效作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及后續(xù)的確認(rèn)提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 MST技術(shù)

4.1 MST的技術(shù)原理與方法特點(diǎn)

MST是一種實(shí)時監(jiān)測在有溫度梯度的環(huán)境中的分子定向泳動，用于表征獲得生物分子發(fā)生結(jié)合的KD等參數(shù)，具有樣品無需固定化、檢測時間短、檢測靈敏度高、操作方便簡單等優(yōu)點(diǎn)。

MST檢測系統(tǒng)的核心元件、檢測原理與表征方法[27-28]見圖4，目標(biāo)分析物被置于薄毛細(xì)管腔中。紅外激光聚焦到毛細(xì)管中心，產(chǎn)生溫度梯度。當(dāng)粒子在具有溫度梯度的氣體中時，處于較高溫度的分子要比處于較低溫度的分子以更高的動能與粒子發(fā)生碰撞，導(dǎo)致粒子在熱流力的作用下從高溫部分向低溫部分移動。并且，這種在微觀溫度梯度場中的定向移動，受分子大小、水化層、電荷改變等因素的影響。在這種熱泳現(xiàn)象中，儀器探測到熱泳動的特性改變，而產(chǎn)生高度敏感的MST信號變化。表征時，首先將受體經(jīng)熒光標(biāo)記后，和目標(biāo)分析物同時放入到薄毛細(xì)管中；隨后，MST儀器內(nèi)部發(fā)出紅外激光引起局部溫差致使管內(nèi)分子發(fā)生定向移動；熒光標(biāo)記受體的熒光強(qiáng)度在溫度梯度中隨時間發(fā)生變化，當(dāng)依次將配體的系列濃度與標(biāo)準(zhǔn)化的熒光強(qiáng)度擬合成曲線，即可獲得分子間相互作用的KD值。

4.2 MST技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)識別與作用靶標(biāo)表征確證中的應(yīng)用

二氫楊梅素主要存在于顯齒蛇葡萄、苦蕎麥、北非雪松等中藥中，可用于治療酒精中毒、非酒精性脂肪肝病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等[29]。楊梅素則具有緩解焦慮和提高認(rèn)知能力的作用，并可能預(yù)防阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病[30]。而運(yùn)輸藥物小分子的牛乳鐵蛋白常被認(rèn)為是靶向腦病、肝病及肺病的靶點(diǎn)蛋白。Huang等[31]應(yīng)用MST技術(shù)結(jié)合多光譜和分子對接分析，表征出牛乳鐵蛋白靶點(diǎn)分別與這2個中藥活性成分相互作用的KD [與二氫楊梅素KD＝（109.80±4.96）μmol/L，與楊梅素KD＝（17.65±0.34）μmol/L]，提示牛乳鐵蛋白對較大親和力的楊梅素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)于較小親和力的二氫楊梅素，導(dǎo)致楊梅素在機(jī)體內(nèi)的吸收和生物利用度更高。此外，MST技術(shù)成功應(yīng)用于現(xiàn)代中藥的研究案例也多見其他報(bào)道[32-34]，豐富了可用于中藥藥效物質(zhì)與其靶標(biāo)分子間相互作用研究的方法策略。

A-MST技術(shù)的檢測原理 B-MST技術(shù)的表征方法

5 結(jié)語與展望

本文介紹了SPR、ITC、BLI、MST等用于表征分子間相互作用的分析技術(shù)。這4種技術(shù)分別基于不同的檢測原理，可提供多個角度的數(shù)據(jù)信息，各具特色、優(yōu)點(diǎn)與不足（表1）。SPR技術(shù)的生物傳感器特異性高、靈敏度高，因此，更適合于通常與靶點(diǎn)蛋白親和力較低的中藥成分小分子化合物的分析表征；BLI技術(shù)對分析樣本的純度要求較低，因此，更適合于耐受中藥復(fù)方提取液、中藥組分溶液等這類粗放樣品的分析表征；ITC技術(shù)最大的優(yōu)勢在于提供親和力和熱力學(xué)信息，因此，更適合全面深入地解析藥靶分子間發(fā)生相互作用的力學(xué)及熱力學(xué)等機(jī)制；MST技術(shù)最大的優(yōu)勢在于，分析樣品的用量少，因此，更適合于微量樣品的分析表征。

表1 SPR、ITC、BLI、MST4種技術(shù)的比較

綜上所述，根據(jù)不同分析樣本的特點(diǎn)和研究目的，選擇一種或幾種適宜的分子互作技術(shù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，全面表征及確證中藥藥效物質(zhì)與靶標(biāo)蛋白兩分子間發(fā)生的藥靶相互作用，以期闡明中藥的藥效作用機(jī)制、揭示中藥的藥效科學(xué)內(nèi)涵、促進(jìn)中藥的現(xiàn)代新藥研發(fā)，這是中醫(yī)藥守正創(chuàng)新研究的關(guān)鍵路徑。

志謝：浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院科研中心提供的平臺支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 馬清林, 杜麗東, 臧凱宏, 等. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方中藥研究中的應(yīng)用及其存在的問題 [J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥, 2019, 26(26): 21-24.

[2] 易歡, 段龍強(qiáng), 耿炤. 中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2021, 17(8): 210-213.

[3] Nguyen H H, Park J, Kang S,. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications [J]., 2015, 15(5): 10481-10510.

[4] 李鋒, 陳園園, 魏佳韻, 等. 表面等離子共振技術(shù)在毒品研究中的應(yīng)用及展望 [J]. 中國藥物依賴性雜志, 2020, 29(6): 406-410.

[5] 王岱東, 屠鵬飛, 黃亞卓, 等. 人參中PD-1小分子抑制劑的篩選及活性驗(yàn)證 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(10): 2428-2434.

[6] Mohanan P, Subramaniyam S, Mathiyalagan R,. Molecular signaling of ginsenosides Rb1, Rg1, and Rg3and their mode of actions [J]., 2018, 42(2): 123-132.

[7] He X, Duan X L, Liu J S,. The antiinflammatory effects of Xuefu Zhuyu Decoction on C3H/HeJ mice with alopecia areata [J]., 2021, 81: 153423.

[8] Pan B Y, Fang S B, Zhang J,. Chinese herbal compounds against SARS-CoV-2: Puerarin and quercetin impair the binding of viral S-protein to ACE2 receptor [J]., 2020, 18: 3518-3527.

[9] Letko M, Marzi A, Munster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses [J]., 2020, 5(4): 562-569.

[10] Wang Q H, Zhang Y F, Wu L L,. Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human ACE2 [J]., 2020, 181(4): 894-904.e9.

[11] Chen L D, Lv D Y, Chen X F,. Biosensor-based active ingredients recognition system for screening STAT3 ligands from medical herbs [J]., 2018, 90(15): 8936-8945.

[12] 余丹丹, 鄔瑞光. 等溫滴定量熱技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2018, 49(22): 5463-5467.

[13] 孫小婷, 靳嵐, 凌沛學(xué). 表面等離子共振和等溫滴定量熱技術(shù)及其在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用 [J]. 藥物生物技術(shù), 2012, 19(6): 540-545.

[14] 馬雪寧, 楊素清, 張君成, 等. 苦參藥理作用研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 25(1): 152-156.

[15] Arques S. Human serum albumin in cardiovascular diseases [J]., 2018, 52: 8-12.

[16] 徐香玉, 孫祥軍, 劉敏, 等. 氧化苦參堿與牛血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)研究 [J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 67(18): 2155-2158.

[17] 韓彥琪, 武琦, 林娟, 等. 丹紅化瘀口服液對視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用 [J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1634-1642.

[18] 王佳宇. 柱后活性篩選丹參中直接抗凝血酶有效成分的研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[19] Peng B, Gu Y J, Wang Y,. Mutations Y493G and K546D in human HSP90 disrupt binding of celastrol and reduce interaction with Cdc37 [J]., 2016, 6(7): 729-734.

[20] Wallner J, Lhota G, Jeschek D,. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions [J]., 2013, 72: 150-154.

[21] 王瑾, 周小江, 胡園, 等. 開心散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2020, 51(18): 4780-4788.

[22] Guo M S, Zhu F D, Qiu W Q,. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS [J]., 2022, 12(4): 1723-1739.

[23] 顏曉靜, 楊燁, 畢蕾, 等. 丹參-人參組分配伍對肺癌A549增殖、凋亡和骨架的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(22): 4436-4441.

[24] 李變英, 陳飛燕, 陳建平, 等. T7噬菌體展示人肺癌cDNA文庫篩選丹參-人參組分復(fù)方靶點(diǎn)研究 [J]. 中成藥, 2016, 38(4): 745-750.

[25] Selkoe D J, Hardy J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years [J]., 2016, 8(6): 595-608.

[26] 陳飛燕, 歐陽柳鳳, 江玉翠, 等. 人參總皂苷親和“垂釣”腦內(nèi)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2016, 32(3): 41-45.

[27] Wang Q, Wang J, Song S X,. Microscale thermophoresis in the investigation of biomolecular interactions [J]., 2020, 29(9): 656-665.

[28] El Deeb S, Al-Harrasi A, Khan A,. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters [J]., 2022, 10(4): 042001.

[29] 周海云, 王文清, 施春陽, 等. 二氫楊梅素藥理及藥物相互作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2018, 49(14): 3411-3418.

[30] 王潞, 周云英. 楊梅素抗感染、抗炎及抗氧化活性研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2019, 50(3): 778-784.

[31] Huang J Y, He Z Y, Cheng R Q,. Assessment of binding interaction dihydromyricetin and myricetin with bovine lactoferrin and effects on antioxidant activity [J]., 2020, 243: 118731.

[32] Zhang S J, Zhang J X, Wei D F,. Dengzhan Shengmai Capsules and their active component scutellarin prevent cognitive decline in APP/PS1 mice by accelerating Aβ aggregation and reducing oligomers formation [J]., 2020, 121: 109682.

[33] Gu M J, Zhou Y F, Liao N K,. Chrysophanol, a main anthraquinone fromL. (rhubarb), protects against renal fibrosis by suppressing NKD2/ NF-κB pathway [J]., 2022, 105: 154381.

[34] Deng Y, Guo W J, Li G C,. Protocatechuic aldehyde represses proliferation and migration of breast cancer cells through targeting C-terminal binding protein 1 [J]., 2020, 23(1): 20-35.

Research progress on technologies of characterization and identification on active substances and targets of traditional Chinese medicine

YUAN Lu-ping, FANG Wen-xiu, LI Meng-ying, WU You, Xu Xiao-ying, QIN Lu-ping, WANG Xiao-yan

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310000, China

The identification of active substances in complex system of traditional Chinese medicine (TCM) and the characterization and confirmation of the interaction with the targets are the bottleneck problems plaguing the modernization research of TCM. In recent years, a variety of molecular interaction characterization techniques have emerged and been successfully applied to identify and characterize the intermolecular interactions between key active substances and their disease targets in field of TCM research. These research results will provide a theoretical basis for exploring the pathological basis of the occurrence and development of the disease and interpreting the pharmacodynamic mechanism of accurate interaction between the key pharmacodynamic substances of TCM and their action targets. The principles, advantages, and application advances of four major molecular interaction characterization techniques, such as surface plasmon resonance, isothermal titration calorimetry, bio layer interferometry and microscale thermophoresis, were reviewed, to provide reference for methodological strategies in research of TCM modernization.

traditional Chinese medicinal active substance; drug target; intermolecular interaction; surface plasmon resonance; isothermal titration calorimetry; bio layer interferometry; microscale thermophoresis

R284

A

0253 - 2670(2023)10 - 3370 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.033

2022-12-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973571）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)遠(yuǎn)志優(yōu)青（2019）

袁露萍，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)與疾病靶點(diǎn)蛋白互作表征及功效驗(yàn)證。E-mail: ylp0528208254@163.com

王小艷（1981—），博士，副研究員，從事中藥藥效物質(zhì)識別與靶標(biāo)挖掘及確證研究。E-mail: xy.wang@zcmu.edu.cn

秦路平（1966—），博士，教授，從事中藥資源開發(fā)利用研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

#共同第一作者：方文秀，碩士研究生，研究方向?yàn)榧膊“悬c(diǎn)蛋白的重組表達(dá)純化及分子互作表征。E-mail: fwx55068305@163.com

[責(zé)任編輯 趙慧亮]