湯春花,梁鳳友,高永堅,曾 杉,李秀嫻,陳雨平,李靜榮

(國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東 佛山 528305)

白塞病(Behcet’s disease,BD),又稱白塞綜合征,是一種累及多個系統(tǒng)的慢性炎癥性血管炎。典型特征為復發(fā)性潰瘍、生殖器潰瘍、眼部病變和皮膚病變[1-2]。流行病學調查發(fā)現(xiàn),白塞病平均發(fā)病年齡為20～30歲,男性發(fā)病率高于女性。目前BD的具體病因尚不明確,多數(shù)情況下被認為是一種自身免疫性疾病,具有遺傳易感性。

目前臨床上關于BD的治療包括糖皮質類固醇、免疫調節(jié)劑、免疫抑制劑和腫瘤壞死因子α(TNF-α)抑制劑等,主要通過抑制炎癥來減輕癥狀和預防并發(fā)癥。然而,長時間用藥可導致一系列問題,如副作用(高血壓、骨質疏松等)、耐藥或者停藥后復發(fā)等。因此,目前臨床上對于BD的治療方式非常有限。

臨床研究表明,傳統(tǒng)中草藥可提高機體免疫力,草藥中一些成分如類固醇、生物堿、糖苷、多酚、萜類、亞麻酸等,作為良好的抗炎劑,能很好緩解BD癥狀。與非甾體抗炎藥相比,副作用更少,成本更低。因此,中草藥得到越來越多關注。

當歸六黃湯(DGLHD)源于金代名醫(yī)李杲《蘭室秘藏》,由當歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃柏、黃連、黃芪等7味中草藥組成,有滋陰瀉火、固表止汗之功[3-4]。現(xiàn)代藥理學研究表明,當歸六黃湯對自身免疫性疾病有良好的治療功效[5]。國內臨床研究報道當歸六黃湯用于治療白塞病,具有較高緩解率[6]。白塞病患者(36例)每日服用加味當歸六黃湯水煎劑,治療14～15天后,總有效率達91.67%。肝腎陰虛型白塞病患者(29例)采用當歸六黃湯加減方治療,顯效率為89.66%[7]。由于當歸六黃湯成分復雜,目前治療白塞病作用機制尚不清楚,也未見有相關研究。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法,通過對DGLHD治療白塞病(BD)多組分、多靶點、多通路篩選、網(wǎng)絡可視化和網(wǎng)絡拓撲學分析,闡明藥物、靶點和疾病之間復雜的網(wǎng)絡關系,預測DGLHD治療白塞病(BD)的作用機制。

1 資料與方法

1.1 當歸六黃湯(DGLHD)活性成分和靶點基因的篩選

本研究在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),分別以當歸、黃芪、熟地黃、生地黃、黃芩、黃連、黃柏為關鍵詞檢索當歸六黃湯(DGLHD)全部活性成分,建立DGLHD化學成分數(shù)據(jù)庫。采用口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)兩項指標來評價DGLHD活性成分的成藥性。通過設置OB≥30%、DL≥0.18篩選活性成分,并獲取活性成分對應蛋白靶點。將蛋白靶點數(shù)據(jù)輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),選擇物種為人,進行歸一化和標準化命名,刪除沒有相應基因名稱的目標蛋白,獲得活性成分對應的靶點基因。與此同時,通過查閱文獻[8]完善生地黃的活性成分和靶點信息。

1.2 藥物-活性成分-靶點基因網(wǎng)絡構建

將“1.1”獲取活性成分和對應的靶點基因數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.1 軟件建立藥物-活性成分-靶點基因網(wǎng)絡圖,并采用軟件中的“Networkanalyze”功能進行網(wǎng)絡拓撲分析,篩選出關鍵活性成分和潛在的靶點基因。

1.3 白塞病(BD)靶點基因篩選及其與活性化合物交集靶點的分析

通過 GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫獲取與BD相關的靶點,把“1.1”獲取活性成分靶點和BD疾病靶點導入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線平臺,繪制韋恩圖,獲得活性成分-白塞病交集靶點基因。

1.4 蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建及拓撲分析

將上述“1.3”獲取的交集靶點導入STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,選擇“Multiple Proteins”選項,種屬設置為“Homo Sapiens”,Interaction Score設定為0.400,并選擇隱藏散在節(jié)點,獲取交集靶點基因的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡,用于BD發(fā)生和發(fā)展的機制分析。將PPI網(wǎng)絡結果導入Cytoscape軟件中進行可視化分析,通過“CytoNCA”插件進行拓撲學分析,分別以度值(Degree,表示某一節(jié)點與其他節(jié)點的鏈接性)、中間中心性值(Betweenness Centrality,BC,表示經(jīng)過某一節(jié)點的最短路徑數(shù)量)、接近中心性(Closeness Centrality,CC,表示某一節(jié)點與網(wǎng)絡中其他節(jié)點的平均距離)的中位值為條件,篩選確定核心靶點。

1.5 交集靶點的GO功能注釋和KEGG富集分析

將“1.3”獲得交集靶點導入Metascape在線數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/),進行基因本體(GO)功能注釋和KEGG通路富集分析。其中,GO富集分析通過3個維度來解釋和注釋基因,包括細胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)分析;而KEGG通路富集主要進行路徑分析。分析物種為“Human”,每條通路至少包含3個基因,P值小于0.05以下具有統(tǒng)計學意義。

1.6 “藥物成分-核心靶點”分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016軟件對DGLHD關鍵活性成分與核心靶點結合能力進行對接預測,以目標蛋白與配體之間氫鍵、靜電相互作用、π-π鍵或范德華力等各種鍵能來計算兩者結合能。結合能表示為負數(shù),數(shù)值越高表示結合能力越強,結合越穩(wěn)定。受體蛋白和小分子之間相互作用以2D結構表示。

2 結果

2.1 當歸六黃湯(DGLHD)活性成分和靶點基因篩選結果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫并設置OB≥30%、DL≥0.18,共檢索到當歸六黃湯主要活性化合物111個,其中當歸2個、黃芪20個、熟地黃2個、黃芩36個、黃連14個、黃柏37個,以及活性成分對應的蛋白靶點,刪除無蛋白靶點活性成分。將蛋白靶點數(shù)據(jù)輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進行比較和矯正,刪除無對應靶點基因的靶蛋白,輸出對應靶點基因。與此同時,通過查閱文獻[8]完善生地黃的活性成分1個和靶點基因38個。綜上,共獲得活性成分86個和對應靶點基因216個?；钚猿煞衷斠姳?。

表1 當歸六黃湯主要活性成分

(續(xù)表1)

2.2 當歸六黃湯(DGLHD)活性成分-靶點基因網(wǎng)絡的構建與分析

將86個活性化合物和對應的216靶點基因導入Cytoscape 3.7.1軟件,構建DGLHD活性成分-靶點基因網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡有292個節(jié)點,共1 478條邊,見圖1,圓形代表藥物,正八邊形代表活性成分,菱形代表靶點基因。采用軟件中的“Networkanalyze”插件對網(wǎng)絡進行拓撲分析和計算。其中,度值和BC是測量網(wǎng)絡節(jié)點的關鍵參數(shù)。通過分析,度值和BC值均在前10位活性成分分別為槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、黃芩素(Baicalein)、芒柄花黃素(Formononetin),詳見表2。

注:圓形代表藥物、正八邊形代表活性成分、菱形代表靶點基因。

表2 度值和BC均在前10的活性成分

2.3 白塞病(BD)靶點基因和活性化合物交集靶點分析

按照“1.3”的方法,獲取BD相關的1 189個靶點基因,將其與DGLHD活性化合物的216個靶點基因一并導入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線平臺,繪制韋恩圖,取交集得到活性成分與疾病交集靶點基因共59個,如圖2所示,這些基因被認為是當歸六黃湯治療BD潛在作用靶點。

圖2 藥物靶點和疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點基因篩選結果

將上述59個交集靶點導入STRING網(wǎng)站構建PPI網(wǎng)絡,將獲得PPI網(wǎng)絡TSV格式文件導入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化分析,得到含59個節(jié)點、1 682條邊網(wǎng)絡圖,見圖3A。利用“NetworkAnalyzer”對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析和計算后,進行第一輪篩選,取度值≥29(中位數(shù))、BC≥0.005(中位數(shù))、CC≥0.66(中位數(shù))的基因,得到含有21個節(jié)點、410條邊的網(wǎng)絡圖,見圖3B。第兩輪篩選,取度值≥41(中位數(shù))、BC≥0.015(中位數(shù))、CC≥0.76(中位數(shù))基因,得到含有8個節(jié)點、56條邊的網(wǎng)絡圖,見圖3C。經(jīng)過二輪篩選最終得到8個核心靶點基因,分別為IL6、TNF、IL1B、PTGS2、VEGFA、CXCL8、CCL2、HMOX1,詳見表3。

2.5 交集靶點的GO功能注釋和KEGG富集分析結果

對59個交集靶點的GO功能注釋分析共得到1 156個條目(P<0.05),包括BP 1 041個、CC 40個、MF 75個。其中BP主要涉及對脂多糖反應、對無機物反應、對活性氧反應、細胞遷移正向調節(jié)、對異種刺激反應、凋亡信號通路負調控等;CC涉及膜筏、絲氨酸蛋白酶抑制劑復合物、囊泡腔、質膜、細胞器外膜等;MF主要集中于細胞因子受體結合、血紅素結合、蛋白質同源二聚化活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合等。見圖4A。

注:A.交集靶點PPI網(wǎng)絡;B.度值≥29、BC≥0.005、CC≥0.66;C.度值≥41、BC≥0.015、CC≥0.76。

表3 核心靶點基因

KEGG富集分析主要集中在脂質和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤通路等。KEGG富集分析結果如圖4B所示。

注:A.GO功能注釋;B.KEGG富集分析。

2.6 當歸六黃湯關鍵活性成分與核心靶點蛋白的分子對接結果

將“2.2”中所得關鍵活性成分和“2.4”所得8個核心靶點進行分子對接驗證,并算配體與受體結合能。結果顯示當歸六黃湯活性成分能夠與不同核心靶基因活性口袋中一個或多個氨基酸殘基結合,形成氫鍵、π-π鍵或范德華力等,從而形成穩(wěn)定的對接模式,各活性化合物與核心靶基因結合能見表4。結合能最低的構象2D可視化展示,見圖5A-I。

表4 DGLHD活性化合物與核心靶基因結合能

注:A:槲皮素-IL6;B:槲皮素-TNF;C:山柰酚-IL1B;D:山柰酚-PTGS2;E:槲皮素-VEGFA;F:山柰酚-CXCL8;G:槲皮素-CCL2;H:山柰酚-HMOX1;I:不同顏色所代表不同作用力。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接相結合的方法,研究DGLHD治療白塞病(BD)潛在活性成分、靶點基因和作用機制。通過對當歸、黃芪、熟地黃、生地黃、黃芩、黃連、黃柏化學成分分析,確定當歸六黃湯中關鍵活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和芒柄花黃素。分子對接結果證明,這些成分可以與大多數(shù)核心靶基因形成很好對接模式。研究表明,槲皮素和山柰酚可通過抑制 NF-κB 和 MAPK信號通路,來抑制 IL-6、IL-10、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎作用[9-10],槲皮素還具有免疫抑制作用,可抑制初級人類T淋巴細胞增殖,山柰酚具有抑制T 淋巴細胞過度活化和增殖等作用[11-13]。β-谷甾醇和豆甾醇是常見的植物甾醇,被用于治療各種炎癥性疾病[14],兩者均可發(fā)揮抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤等生物活性[15]。黃芩素進入血液后迅速轉化為黃芩苷等代謝物,黃芩苷已被證實具有顯著抗炎和免疫調控作用[16]。研究表明,漢黃芩素具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[17],可通過增加免疫細胞浸潤、調節(jié)免疫細胞表型,以及促進相關細胞因子分泌來增強免疫功能[18]。芒柄花黃素具有抗炎作用,清除機體內代謝廢物,向正常細胞提供適宜代謝的良好微環(huán)境,提高機體免疫力[19]。

對DGLHD和BD的59個交集靶點基因進行PPI分析,篩選確定DGLHD治療BD的8個核心靶基因,即IL-6、TNF、IL-1B、PTGS2、VEGFA、CXCL8、CCL2和HMOX1,與炎癥反應和免疫應答密切相關。

KEGG富集分析結果表明,脂質和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤通路等可能是DGLHD治療BD主要途徑。BD的病理基礎為血管炎,全身大小血管均可累及。而動脈粥樣硬化是一種動脈壁慢性炎癥性疾病,炎癥已被證明在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用,促炎細胞因子IL-1B、IL-6、TNFα等深度參與相關炎癥發(fā)生發(fā)展,且IL-1B被證實為動脈粥樣硬化最有效驅動因素之一。而大量氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在血管內壁積聚(脂質積累),募集巨噬細胞通過吞噬oxLDL,誘導炎性介質局部產(chǎn)生[20-21]。有研究表明,BD組TG(甘油三酯)較對照組顯著升高,而HDL-C(高密度脂蛋白)水平低于對照組,高TG和低HDL-C水平是心血管疾病的強烈風險因素,BD患者動脈硬化的風險增加[22],據(jù)此推測當歸六黃湯通過脂質和動脈粥樣硬化通路調節(jié)脂質代謝和抑制炎性因子釋放,發(fā)揮抗炎和免疫調節(jié)作用[23],進而來防治BD患者心血管疾病。AGE-RAGE信號通路與炎癥密切相關,該通路可激活MAPK和NF-κB途徑,干預免疫和氧化應激反應[20]。BD還有伴發(fā)惡性腫瘤風險,以惡性血液病居多[24],提示DGLHD可能通過腫瘤通路調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

4 結語

本研究采用網(wǎng)絡藥理學分析DGLHD治療BD潛在有效活性成分、靶點基因和作用途徑。共獲取112個有效活性成分,經(jīng)篩選得到8個關鍵活性成分,分別為槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、黃芩素(Baicalein)、芒柄花黃素(Formononetin),主要發(fā)揮抗炎和免疫調節(jié)作用。得到59交集靶點基因并篩選獲取8個核心靶點基因,分別是IL-6,TNF,IL-1B,PTGS2,VEGFA,CXCL8,CCL2和HMOX1,這些靶點基因與炎癥反應和免疫應答密切相關。KEGG富集分析結果提示DGLHD治療BD主要通過脂質和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤通路等發(fā)揮作用。此外,通過分子對接驗證DGLHD關鍵活性成分可以與核心靶點蛋白形成穩(wěn)定的對接模型。綜上所述,DGLHD治療BD通過多成分、多靶點、多途徑作用機制,在抗炎和免疫調節(jié)中發(fā)揮協(xié)同作用。