宋國(guó)陽(yáng)，李斐然，王富江，汪 斌，葛海濤*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司 中藥室，江蘇 南京 210009；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床藥理科，江蘇 南京210029）

痔瘡（Hemorrhoids，HRD）是一種肛腸科疾病，多伴有為疼痛、出血、直腸脫垂等病理表現(xiàn)[1]。臨床上將內(nèi)痔分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四階段，當(dāng)痔瘡處于早期階段時(shí)，通常采用非手術(shù)治療手段如外用藥物減輕癥狀[2-3]。

痔瘺熏洗劑（ZLX）為江蘇省中醫(yī)院治療痔瘡腫痛的院內(nèi)制劑，由大黃、虎杖、五倍子、荔枝草、魚腥草所組成，具有清熱止痛、燥濕斂瘡的功效。臨床研究表明痔瘺熏洗劑能夠減輕炎癥、消除水腫并促進(jìn)創(chuàng)面愈合[4-6]。然而痔瘺熏洗劑研究?jī)H局限于臨床療效觀察，還未深入研究其發(fā)揮藥效的作用機(jī)制。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出痔瘺熏洗劑治療痔瘡的核心成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，并采用分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證，接著構(gòu)建痔瘡動(dòng)物模型評(píng)價(jià)痔瘺熏洗劑治療痔瘡的藥理作用并初步驗(yàn)證治療分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

痔瘺熏洗劑（批號(hào)：2106020，江蘇省中醫(yī)院）；金玄痔科熏洗散（批號(hào)：210507，馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；巴豆油（批號(hào)：Z01A10H84659，上海源葉生物科技有限公司）；乙醚（批號(hào)：210315636D）、吡啶（批號(hào)：10030210242），均購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司；水合氯醛（批號(hào)：B1826028，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠TNF-α 抗體（批號(hào)：ab109322）、大鼠MMP9 抗體（批號(hào)：ab283575），均購(gòu)自Abcam 公司。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量為（200±10）g，大鼠購(gòu)自南通大學(xué)［許可證號(hào)：SCXK（蘇）2019-0001］。動(dòng)物在溫度（25±1）°C、相對(duì)濕度（50±5）%的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，飼養(yǎng)于江蘇蘇中生物制藥有限公司動(dòng)物房［許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0059］，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過江蘇蘇中生物制藥有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（SZSW-2022041503）。

1.3 主要儀器

RM2016 型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；ST5010 型全自動(dòng)染色機(jī)(德國(guó)LEICA 公司)；JJ-12J 型脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）。

1.4 痔瘺熏洗劑活性成分及靶點(diǎn)收集

基于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（TTDs）藥物特點(diǎn)，采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/），結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以DL ≥0.18、AlgP ＞5、分子 量≤500 為篩選條件，收集大黃、虎杖、五倍子、魚腥草、荔枝草五味藥材的化學(xué)成分。將篩選出的成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://swisstargetprediction.ch/），以score ＞0 為篩選條件，獲得藥物相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)收集

以“hemorrhoids”為 關(guān) 鍵 詞，檢 索OMIM、GeneCards、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)，以score ＞0 為閾值，收集三種疾病數(shù)據(jù)庫(kù)交集靶點(diǎn)，通過Venny 工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）收集痔瘺熏洗劑與痔瘡的交集靶點(diǎn)。

1.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://stringdb.org/），設(shè)定物種為Homo sapiens，最小置信度＞0.4，PPI 網(wǎng) 絡(luò) 以TSV 格 式 導(dǎo) 入Cytoscape 軟 件，設(shè)置閾值為degree 二倍中位數(shù)、BC（Betweenness Centrality）中位數(shù)和CC（Closeness Centrality）中位數(shù)，收集滿足上述參數(shù)的核心靶點(diǎn)。

1.7 “成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的活性成分、潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置閾值為degree 二倍中位數(shù)、BC 中位數(shù)和CC 中位數(shù)，篩選滿足上述參數(shù)的核心成分。

1.8 KEGG 通路富集分析與GO 富集分析

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/），以P＜0.05 為條件，進(jìn)行KEGG 富集通路分析及GO 富集分析，獲得痔瘺熏洗劑治療痔瘡相關(guān)通路與生物過程、細(xì)胞組分、分子功能，并利用微生信網(wǎng)站對(duì)結(jié)果可視化分析。

1.9 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核心成分、核心靶點(diǎn)和相關(guān)通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)出痔瘺熏洗劑發(fā)揮治療作用的作用機(jī)制。

1.10 分子對(duì)接

在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www1.rcsb.org/）中下載靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，利用Chimera 去除蛋白原有配體，并用Pymol 與Autodock 對(duì)蛋白去水加氫，對(duì)主要活性成分加氫、電荷、質(zhì)子化確認(rèn)，利用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接。

1.11 造模及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為空白組、模型組、金玄痔科熏洗散組、痔瘺熏洗劑組，每組各10 只，雌雄各半。參考文獻(xiàn)[7]方法建立巴豆油大鼠肛周腫脹模型，取蒸餾水、吡啶、乙醚和6%巴豆油溶液按照 1 ∶4 ∶5 ∶10 比例混合，配制造模劑。大鼠注射0.1 mL10%水合氯醛麻醉，取吸入0.10 mL 造模劑的棉簽置入大鼠肛門直腸2 cm 處，維持時(shí)間10 s，造模后7 h 觀察大鼠肛周組織是否出現(xiàn)充血、水腫，用以評(píng)價(jià)造模是否成功。

1.12 給藥及取材

模型組給予生理鹽水浸泡肛周部位10 min，給藥組基于大鼠與人臨床給藥劑量換算為6.3 ∶1，痔瘺熏洗劑組每日給藥量為18 mL/kg（相當(dāng)于生藥量8.64 g/kg），金玄痔科熏洗散組每日給藥量為9.9 g/kg，1 次/d。造模成功大鼠在造模后7、24、48 h 給藥。在末次給藥后1 h 處死大鼠，沿肛周分離肛門，剪出2 cm 直腸，固定于10%多聚甲醛中。

1.13 痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠肛周腫脹的影響

各給藥組于造模后7、24、48 h 將藥物浸泡于肛門腫脹處10 min, 每次給藥0.5 h 后, 用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠肛周上下、左右兩直徑，取均值，計(jì)算肛周腫脹面積。

1.14 HE 染色觀察大鼠直腸病理學(xué)變化

末次給藥1 h 后處死, 取2 cm 直腸組織, 10%多聚甲醛固定, 做病理組織學(xué)檢查,觀察分析各組大鼠直腸病理組織形態(tài)變化。

1.15 免疫組化法檢測(cè)直腸中TNF-α、MMP9 蛋白的表達(dá)情況

切片脫蠟后修復(fù),隨后阻斷封閉,加一抗孵育過夜,加二抗孵育 1 h，PBS 沖洗三次后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染,脫水封片，在顯微鏡下觀察并拍片。每張照片取四個(gè)不重疊視角，使用Image-Pro Plus 計(jì)算平均光密度（IOD/ AREA）比值并平行計(jì)算三次，分析直腸組織中TNF-α、MMP9 蛋白的表達(dá)情況。

1.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痔瘺熏洗劑活性成分及靶點(diǎn)收集

篩選出32 種活性成分結(jié)果見表1。其中，大黃9個(gè)，虎杖11 個(gè)，荔枝草6 個(gè)，魚腥草9 個(gè)，五倍子2 個(gè)。通過Swiss Target Prediction 平臺(tái)篩選相關(guān)靶點(diǎn)，獲得藥物靶點(diǎn)510 個(gè)。

表1 痔瘺熏洗劑潛在活性成分Tab.1 Potential active ingredients of Zhilou Lotion

2.2 疾病靶點(diǎn)及潛在作用靶點(diǎn)獲取

基于OMIM、GeneCards、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)共收集492個(gè)疾病靶點(diǎn)。將510 個(gè)藥物靶點(diǎn)與492 個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 作圖網(wǎng)站，得到77 個(gè)交集靶點(diǎn)并繪制Venny 圖，見圖1。這77 個(gè)交集靶點(diǎn)作為痔瘺熏洗劑治療痔瘡的重要靶點(diǎn)。

圖1 痔瘺熏洗劑與痔瘡交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection target of Zhilou Lotion and hemorrhoids

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將77 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共有67 個(gè)節(jié)點(diǎn)與664 條邊，degree 值表示節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)程度，degree值越大說明在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中越重要，以degree ≥12、BC ≥0.006、CC ≥0.413 為篩選條件，篩選出23 個(gè)核心靶點(diǎn)。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)篩選流程Fig.2 Screening process of core targets of PPI network

2.4 “成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將32 種活性成分與23 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建“成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。以degree ≥8、BC ≥0.005、CC ≥0.385 為篩選條件，篩選出7 個(gè)核心成分見表2，推測(cè)這7 種成分可能是痔瘺熏洗劑治療痔瘡的核心成分。

圖3 “成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Component-potential target”network

表2 核心成分參數(shù)篩選表Tab.2 Screening table of core ingredient parameters

2.5 KEGG 通路富集分析與GO 富集分析

將21 個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，富集到92 條通路。以基因數(shù)≥6 為篩選條件共收集出5條與痔瘡相關(guān)的通路，包括PI3K-Akt 通路、TNF 通路、IL-17 通路、HIF-1 通路、MAPK 通路，這5 條通路可能作為痔瘺熏洗劑治療痔瘡的重要通路，選取基因數(shù)排名前20 的條目展示見圖4。GO 富集分析到607 條生物過程涉及MAPK 級(jí)聯(lián)正向調(diào)節(jié)、血管生成調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；富集到20 個(gè)細(xì)胞組分涉及膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、囊泡腔；富集到33 種分子功能涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性等。各選取P值前10 條目展示見圖5。

圖4 痔瘺熏洗劑治療痔瘡排名前20 KEGG 通路Fig.4 Top 20 KEGG pathway of Zhilou Lotion in the treatment of hemorrhoids

圖5 痔瘺熏洗劑治療痔瘡靶點(diǎn)GO 富集分析結(jié)果Fig.5 GO function enrichment analysis of hemorrhoids target treated with Zhilou Lotion

2.6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

結(jié)果分析可知痔瘺熏洗劑通過大黃酚、大黃素甲醚、沒食子酸、甲基正壬酮、高車前素、大黃酸、白藜蘆醇等核心成分，作用于TNF、IL-6、IL-1β、MMP9、VEGFA 等核心靶點(diǎn)，介導(dǎo)PI3K-Akt、TNF、IL-17、HIF-1、MAPK 相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮治療作用，見圖6。

圖6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.6 ＂Component-target-pathway＂ network

2.7 分子對(duì)接分析

選擇degree 值較高的白藜蘆醇、大黃酚、高車前素、甲基正壬酮、沒食子酸與VEGFA、TNF-α、MMP9、IL-6 進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果顯示5 種核心成分與 4 個(gè)核心靶點(diǎn)結(jié)合能均低于-5 kJ/mol，結(jié)果見表3。其中大黃酚與VEGFA、TNF-α、IL-6 等蛋白及白藜蘆醇與MMP9 蛋白具有較好結(jié)合能力，對(duì)接模式見圖7。

表3 核心成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能表（kJ/mol）Tab.3 Binding energy table of core component and core target （kJ/mol）

2.8 痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠肛周腫脹的影響

與空白組比較，模型組大鼠肛周腫脹面積明顯增加（P＜ 0.01），顯示造模成功。痔瘺熏洗劑組與金玄痔科熏洗散組大鼠較模型組大鼠腫脹面積均明顯減少（P＜ 0.01），金玄痔科熏洗散組與痔瘺熏洗劑組相比，大鼠腫脹面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。結(jié)果表明痔瘺熏洗劑與金玄痔科熏洗散均可改善巴豆油引起的大鼠肛周腫脹。

表4 痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠肛周腫脹面積的影響（±s，n = 8）Tab.4 Effect of Zhilou Lotion on perianal swelling in rats（±s，n = 8）

表4 痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠肛周腫脹面積的影響（±s，n = 8）Tab.4 Effect of Zhilou Lotion on perianal swelling in rats（±s，n = 8）

注：模型組與空白組比較，**P ＜0.01；給藥組與模型組比較，##P ＜0.01。

組別 7.5 h 24.5 h 48.5 h空白組 1.41±0.10 1.41±0.10 1.41±0.10模型組 2.41±0.28** 2.83±0.24** 2.55±0.24**痔瘺熏洗劑組 1.78±0.17## 1.55±0.15## 1.46±0.11##金玄痔科熏洗散組 1.74±0.15## 1.56±0.17## 1.44±0.16##F 38.980 119.900 93.720 P 0.000 0.000 0.000

2.9 HE 染色觀察大鼠直腸病理學(xué)變化

空白組直腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層未見充血、水腫等病變，見圖8A。模型組腺體大量缺失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層發(fā)生充血并伴有輕微水腫，見圖8B。與模型組比較，痔瘺熏洗劑組與金玄痔科熏洗散組。腺體排列均相對(duì)完整，水腫、充血等病理性改變也相對(duì)減輕但仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，見圖8C、8D。

圖8 各組大鼠直腸組織病理情況（HE 染色，100×）Fig.8 Rectal tissue pathology in rats（HE staining，100×）

2.10 免疫組化法檢測(cè)直腸中TNF-α、MMP9 蛋白的表達(dá)情況

與空白組比較、模型組大鼠直腸組織 TNF-α、MMP9 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較,痔瘺熏洗劑組大鼠直腸組織TNF-α、MMP9 蛋白表達(dá)顯著（P＜0.05），結(jié)果見圖9。

圖9 痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠直腸組織TNF-α、MMP9 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，200×）Fig.9 Expression of TNF-α、MMP9 in the rectal tissue of mice in each group（Immunohistochemistry，200×）

3 討論

痔瘡發(fā)病發(fā)病時(shí)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α 引發(fā)炎癥反應(yīng)作用于血管壁、細(xì)胞外基質(zhì)等，從而使肛墊出現(xiàn)靜脈擴(kuò)張、新血管形成、彈性纖維的退變性變化[8]。

本研究篩選出7 種核心成分即大黃酚、大黃酸、白藜蘆醇、沒食子酸、高車前素等。大黃酚促使NF-κB失活，下調(diào)TNF-α、IL-1β 表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[9]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，常伴有疼痛產(chǎn)生，白藜蘆醇抑制PGE2 表達(dá),緩解炎性痛[10]。沒食子酸對(duì)蛋白質(zhì)有沉淀作用，凝固潰瘍面組織蛋白，加速創(chuàng)面愈合[11]。VEGFR2 參與血管生成多個(gè)關(guān)鍵步驟。高車前素通過靶向 VEGFR2 介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路抑制血管生成[12]。

痔瘡病變過程中主要涉及三類細(xì)胞因子即炎癥因子、生長(zhǎng)因子、間質(zhì)因子[13]。TNF-α 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，致使血管通透性增加，從而導(dǎo)致痔組織出現(xiàn)炎性水腫癥狀[14]。血管新生是痔瘡發(fā)病機(jī)制之一，活化的VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合后誘導(dǎo)Akt 磷酸化，加速血管新生[15]。洪藝云等[16]發(fā)現(xiàn)MMP9 與VEGF 相互協(xié)同促進(jìn)血管通透性增加。MMP9 表達(dá)水平與內(nèi)痔的嚴(yán)重程度、病程的發(fā)展具有相關(guān)性[17]。

通過KEGG 分析篩選出五條治療相關(guān)通路：HIF-1 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路。當(dāng)痔瘡發(fā)病時(shí)炎癥因子分泌增加導(dǎo)致機(jī)體耗氧量增多從而形成低氧環(huán)境，低氧環(huán)境誘導(dǎo) HIF-1a 過度表達(dá)，激活下游VEGFA 蛋白表達(dá)，VEGFA 又與VEGFAR2 結(jié)合介導(dǎo)下游的PI3K/Akt 和 MAPK 等信號(hào)通路從而參與血管生成過程[18-19]。IL-17 信號(hào)刺激下游NF-κB 活化，進(jìn)一步分泌IL-6、TNF-α 與促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，從而引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織結(jié)構(gòu)破壞[20]。分子對(duì)接結(jié)果表明核心成分與核心靶點(diǎn)能夠自主結(jié)合。

巴豆油應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞遷移，并釋放前列腺素、白三烯、緩激肽等炎癥脂質(zhì)代謝物而從而引起炎癥反應(yīng)[21]。痔瘺熏洗劑對(duì)巴豆油所致肛周腫脹具有治療作用，結(jié)合大鼠直腸組織病理結(jié)果，證實(shí)痔瘺熏洗劑能夠減輕巴豆油誘導(dǎo)大鼠模型的水腫、出血癥狀。針對(duì)與痔瘡發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子（TNF-α、MMP9）進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示痔瘺熏洗劑能夠明顯下調(diào)TNF-α、MMP9 表達(dá)，且與其發(fā)揮抗炎機(jī)制有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究觀察痔瘺熏洗劑對(duì)大鼠肛周腫脹模型的作用，結(jié)果表明痔瘺熏洗劑治療作用與下調(diào)TNF-α、MMP9 的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎、消腫作用有關(guān)。研究不足之處在于本研究選用的巴豆油誘導(dǎo)大鼠肛周腫脹模型為經(jīng)典近似痔瘡模型。此外，篩選出的化學(xué)成分僅考慮成分活性，未考慮實(shí)際給藥后的入血情況。后續(xù)將建立多種抗炎、鎮(zhèn)痛模型綜合評(píng)估痔瘺熏洗劑抗炎、鎮(zhèn)痛作用，并深入研究治療過程中起到調(diào)控作用的作用機(jī)制。