吳 媛, 蘇世賢, 尤春生, 張永平, 汪 淘,2, 龍 茶,韋金江,2, 江蘇燕, 祝洪江, 王婭珠, 鄧代信, 李 偉

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025; 2.貴州大學(xué)辣椒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 貴陽 550025;3.貴定縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 貴州 貴定 551300; 4.貴州省果樹蔬菜工作站, 貴陽 550001;5.貴州省高等學(xué)校設(shè)施蔬菜工程研究中心, 貴陽 550025)

TIFY家族基因是植物中的一類特異性轉(zhuǎn)錄因子,首次在擬南芥中進(jìn)行鑒定,屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族,所有TIFY基因均含有高度保守結(jié)構(gòu)域(TIF[F/Y]XG),所以將其命名為TIFY基因家族[1-2]。根據(jù)TIFY中保守結(jié)構(gòu)域的不同,將其分為4個(gè)亞族:TIFY、JAZ、PPD和ZML。TIFY亞族中僅含有TIFY保守結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有28個(gè)氨基酸和一個(gè)保守基序TIF[F/Y]XG,該結(jié)構(gòu)域二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測形成α-α-β折疊[3]。JAZ亞家族中除TIFY結(jié)構(gòu)域之外,在序列C端還存在一個(gè)Jas保守結(jié)構(gòu)域,可以與bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC 2和MYC 3相互作用,抑制茉莉酸反應(yīng)[4-5]。PPD亞家族含有TIFY結(jié)構(gòu)域、PDD結(jié)構(gòu)域以及PY基序缺失的Jas結(jié)構(gòu)域,在擬南芥中PPD 1和PPD 2可以協(xié)調(diào)組織生長,調(diào)節(jié)葉片大小和葉片邊緣的彎曲程度[6],ZML 蛋白除含有TIFY結(jié)構(gòu)域外,還包含有CCT基序和GATA鋅指結(jié)構(gòu)域[1]。

TIFY基因家族已經(jīng)在多個(gè)物種進(jìn)行鑒定,如在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) heynh.)中有18個(gè)TIFY成員[7],水稻(OryzasativaL.)中20個(gè)[8],番茄(SolanumlycopersicumL.)中有21個(gè)[9],馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)中有21個(gè)[9],核桃(JuglansregiaL.)中有21個(gè)[10],茶樹(Camelliasinensis)中有16個(gè)[11],毛果楊(Populustrichocarpa)中有25個(gè)[12]。較多研究表明,植物中TIFY成員對維持植物正常生長發(fā)育有重要作用。擬南芥中AtTIFY1可促進(jìn)葉柄和下胚軸的生長[2]。在水稻中過表達(dá)OsTIFY11b增加了株高和籽粒重,與未轉(zhuǎn)化植株相比,植株在抽穗期長葉,并且葉鞘和莖穗中的蔗糖含量更高[13]。研究發(fā)現(xiàn),PpTIFY基因與花青素積累和JA信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān),時(shí)空表達(dá)模式表明,其在葉片中表達(dá)水平較高,而在成熟期間表達(dá)水平顯著降低[14]。部分研究表明,TIFY在植物對非生物脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)蘋果(MaluspumilaMill.)TIFY基因和葡萄(VitisviniferaL.)中多個(gè)TIFY基因?qū)γ撀渌岷蛙岳蛩峒柞サ扔许憫?yīng),但對水楊酸和乙烯沒有響應(yīng)[15-16]。熒光定量PCR顯示,CsTIFYs在鹽脅迫、冷脅迫、干旱脅迫和茉莉酸甲酯處理后反應(yīng)強(qiáng)烈[17]。水稻中幾乎所有的OsTIFY基因都對一種或多種非生物脅迫有反應(yīng),包括干旱、鹽和低溫等脅迫,過表達(dá)OsTIFY11a導(dǎo)致對鹽和干旱脅迫的耐受性顯著增加[8]。據(jù)報(bào)道,TaJAZ1的C末端區(qū)域與TaABI5相互作用,可以調(diào)節(jié)小麥(TriticumaestivumL.)的種子萌發(fā)和ABA反應(yīng)[18]。

近年來,TIFY的鑒定分析已經(jīng)在多個(gè)物種中進(jìn)行,但是目前很少有關(guān)于辣椒(CapsicumannuumL.)TIFY基因家族成員的相關(guān)信息,并且辣椒中TIFY家族成員進(jìn)行鑒定及基因表達(dá)模式的研究較少。辣椒是主要的蔬菜之一,富含辣椒素和維生素C等物質(zhì),廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、制藥和食品加工等多個(gè)領(lǐng)域[19]。因此闡明辣椒TIFY基因?qū)苯飞L發(fā)育的調(diào)控具有重要意義。基于辣椒全基因組信息,鑒定辣椒TIFY基因,利用生物信息學(xué)方法對CaTIFYs的理化性質(zhì)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件和系統(tǒng)發(fā)育以及基因表達(dá)模式進(jìn)行可視化分析,為解析TIFY基因家族在辣椒生長發(fā)育和逆境脅迫中的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 辣椒TIFY基因家族成員的鑒定

于茄科植物全基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)下載辣椒基因組文件,擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下載已報(bào)道的擬南芥18個(gè)TIFY轉(zhuǎn)錄因子序列。在TBtools軟件中Blast Compare Two Seq進(jìn)行Blastp比對,設(shè)定E值為10-5,進(jìn)行第一次比對[20]。使用NCBI中BlastP功能進(jìn)行第二次比對。在Pfam數(shù)據(jù)庫[21](https://pfam.xfam.org/)下載原始隱馬爾可夫模型(HMM)數(shù)據(jù)TIFY(PF 06200)文件,采用HMMER3.0查詢含有TIFY保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列,設(shè)定E值為10-5。使用NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫和SMART在線網(wǎng)站(http://smart.embl.de/)進(jìn)行驗(yàn)證是否含有該結(jié)構(gòu)域,去除冗余的基因,含有該結(jié)構(gòu)域的基因最終確定為辣椒TIFY基因家族成員。

1.2 辣椒TIFY染色體定位、蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征分析

采用TBtools軟件進(jìn)行染色體定位分析;在Expasy (https://www.expasy.org/)中對理化性質(zhì)分析[22];使用在線軟件PSORT Ⅱ prediction (https://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析;利用SOMPA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)[23];SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)[24];TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)[25]。

圖1 CaTIFYs基因的染色體定位Fig.1 Location of CaTIFYs gene on chromosome

1.3 辣椒TIFY家族蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)和順勢作用元件分析

利用MEME在線軟件(https://meme-suite.org/meme/index.html)挖掘CaTIFYs蛋白的保守基序[26];運(yùn)用CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;采用DSDS(http://gsds.gao-lab.org/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析;采用TBtools軟件提取辣椒TIFY家族成員起始密碼子上游2 kb的序列,然后在PlantCare網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順勢作用元件預(yù)測[27],最后用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 辣椒TIFY基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

對擬南芥、番茄、水稻和辣椒中TIFY蛋白序列使用MEGA X軟件進(jìn)行多序列比對,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap值設(shè)置為1 000[28]。

1.5 辣椒TIFY基因在不同組織、非生物脅迫和激素處理后表達(dá)模式分析

使用PepperHub[29](http://pepperhub.hzau.edu.cn/index.php)下載‘6421’辣椒CaTIFYs基因在不同組織發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量數(shù)據(jù),以及在多種非生物脅迫如冷脅迫、熱脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫,多種激素處理如茉莉酸、脫落酸、水楊酸和赤霉素處理后,根和葉0～24 h(在0,0.5,1,3,6,12,24 h取樣)內(nèi)CaTIFYs基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)。將CaTIFYs的表達(dá)量值取對數(shù)log2(FPKM)進(jìn)行轉(zhuǎn)換,采用TBtools軟件繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaTIFYs家族成員鑒定、染色體定位、蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征分析

基于辣椒基因組信息中共鑒定出15個(gè)TIFY成員,CaTIFYs位于8條染色體上,依據(jù)其在染色體的位置,分別命名為CaTIFY1～CaTIFY15(圖 1)。對CaTIFYs成員的理化性質(zhì)分析顯示(表1),氨基酸數(shù)目在153～411個(gè)之間,分子量在17 108.52～45 694.75 kD之間,等電點(diǎn)在4.92～10.07個(gè)之間,平均親水性介于-0.147～-0.744之間,脂肪系數(shù)介于55.50～80.92之間,不穩(wěn)定系數(shù)在33.34～62.70之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示,CaTIFYs均定位于細(xì)胞核中。預(yù)測所有成員均無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示,辣椒TIFY成員蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相似,各二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例排序?yàn)?無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角。無規(guī)則卷曲占比最高,為46.63%～73.37%,β-轉(zhuǎn)角含量最少,為2.68%～7.14%。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖 2)顯示,無規(guī)則卷曲及α-螺旋在三級(jí)結(jié)構(gòu)中占主要部分,與預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)相同。

表1 CaTIFYs基因理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 1 Physical and chemical properties and secondary structure analysis of CaTIFYs gene

2.2 辣椒TIFY基因家族保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

對CaTIFYs的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化分析(圖 3),顯示Motif 2存在于所有TIFY成員中,Motif 3和Motif 5僅存在于CaTIFY6、CaTIFY12、CaTIFY13中,CaTIFY1成員僅有Motif 2成員,Motif 6僅存在于CaTIFY15和CaTIFY8中。所有成員均含有TIFY保守結(jié)構(gòu)域,屬于TIFY superfamily,CaTIFY6、CaTIFY7、CaTIFY12、CaTIFY13含有CCT保守結(jié)構(gòu)域,其他成員含有CCT-2保守結(jié)構(gòu)域,分別屬于CCT superfamily和CCT-2 superfamily。ZnF-GATA結(jié)構(gòu)域僅存在于CaTIFY12和CaTIFY13,GATA僅存在于CaTIFY6中。

圖2 辣椒TIFY蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of the tertiary structure of pepper TIFY protein

對CaTIFYs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖 4),CaTIFY14僅含有2個(gè)外顯子1個(gè)內(nèi)含子,CaTIFY7和CaTIFY11含有3個(gè)外顯子兩個(gè)內(nèi)含子,CaTIFY3和CaTIFY15含有5個(gè)外顯子,CaTIFY1、CaTIFY9、CaTIFY10含有6個(gè)外顯子,CaTIFY2、CaTIFY4、CaTIFY6、CaTIFY12含有7個(gè)外顯子,CaTIFY5和CaTIFY8含有9個(gè)外顯子,CaTIFY13含有10個(gè)外顯子。

2.3 不同物種TIFY家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

對擬南芥、水稻、番茄和辣椒74個(gè)TIFY蛋白序列進(jìn)行多重比較,構(gòu)建進(jìn)化樹(圖 5),結(jié)果表明,TIFY蛋白分為Ⅰ～Ⅷ共八個(gè)大類群,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類群中不含CaTIFY成員,第Ⅱ類群中均為單子葉植物水稻中的TIFY成員。第Ⅰ類群中含有15個(gè)TIFY成員,其中CaTIFY15、CaTIFY3、CaTIFY11、CaTIFY1分別于SlTIFY9、SlTIFY15、SlTIFY13、SlTIFY12聚集在一起,處于一個(gè)分支中。第Ⅴ類群含有6個(gè)成員,其中CaTIFY8和CaTIFY5分別于SlTIFY3、SlTIFY10聚集在一個(gè)分支。第Ⅵ類群含有19個(gè)成員,其中CaTIFY10、CaTIFY13、CaTIFY7、CaTIFY12分別于SlTIFY16、SlTIFY8、SlTIFY18、SlTIFY4聚集在一個(gè)分支,而CaTIFY6與AtTIFY1聚為一個(gè)分支。第Ⅶ類群含有7個(gè)成員,CaTIFY1與SlTIFY20、SlTIFY5聚集為一分支。第Ⅷ類群含有11個(gè)TIYF成員,其中CaTIFY4、CaTIFY9、CaTIFY2分別與SlTIFY14、SlTIFY21、SlTIFY6聚集一個(gè)分支。

圖3 辣椒TIFY基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(A)、保守基序(B)和保守結(jié)構(gòu)域(C)分析Fig.3 Phylogenetic tree (A), conservative motif (B) and conservative domain (C) analysis of pepper TIFY gene family

圖4 辣椒TIFYs基因結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of TIFYs gene structure in pepper

圖5 不同物種TIFY家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of TIFY family genes in different species

2.4 辣椒TIFY基因家族成員順式作用元件分析

使用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析顯示(圖6),CaTIFYs除了含有大量的CAAT-box和TATA-box等基因元件外,還含有大量的調(diào)控作用元件。除CaTIFY8外,其余成員均含有較多的光響應(yīng)元件(GT 1-motif、G-box、ACE、G-Box、Sp 1和3-AF 1 binding site),僅有CaTIFY5具有參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBSI)。僅有CaTIFY5和CaTIFY6含有參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元件(HD-Zip 1)和參與胚乳表達(dá)的順式調(diào)控元件(GCN4-motif)。CaTIFYs含有大量激素響應(yīng)元件,如茉莉酸響應(yīng)元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element),所有CaTIFYs均含有赤霉素響應(yīng)元件(ABRE),CaTIFY1、CaTIFY3、CaTIFY12、CaTIFY13含有生長素響應(yīng)元件(TGA-element)。還有大量的響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)元件,除CaTIFY2、CaTIFY3、CaTIFY4、CaTIFY13外,其他成員均含有無氧誘導(dǎo)相關(guān)元件(ARE),CaTIFY1和CaTIFY8含有1個(gè)創(chuàng)傷響應(yīng)元件(WUN-motif),還具有響應(yīng)干旱脅迫(MBS)元件、低溫響應(yīng)元件(LTR)和參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeats)等。

注:L 1～L 9表示生長2～50 d的葉片;F 1～F 9表示花蕾出現(xiàn)后的2～50 d;P 10、O 10和STA 10分別為花蕾出現(xiàn)后60 d采集的花瓣;子房和雄蕊;FST 0與FST 1為第3天和第7天采集的整個(gè)果實(shí);G 1～G 11為10～60 d的果皮;S 3～S 11為20～60 d的種子;ST 1和ST 2為10～15 d的胎座和種子混合;T 3～T 11分別代表花后20～60 d的胎座。圖7 CaTIFY基因在果實(shí)(A)、葉片(B)和花(C)中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化Fig.7 Expression of CaTIFY gene in fruits(A), leaves(B) and flowers(C) at different development stages

2.5 辣椒TIFY基因家族成員組織表達(dá)特征分析

由圖7可知,在葉片、花朵、果皮、種子和胎座發(fā)育過程中CaTIFY2表達(dá)量一直處于較高的表達(dá)水平,在葉片發(fā)育過程中CaTIFY3、CaTIFY11和CaTIFY14表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢。在花朵發(fā)育過程中CaTIFY3、CaTIFY4、CaTIFY11、CaTIFY14在花朵發(fā)育20～40 d的表達(dá)量較高,CaTIFY4在雄蕊中表達(dá)量較高。在果實(shí)發(fā)育過程中,CaTIFY11和CaTIFY3在果皮發(fā)育的前期上調(diào),在35～45 d表達(dá)量明顯下調(diào),然后逐漸上調(diào)。CaTIFY14表達(dá)量果皮發(fā)育前15 d較高,CaTIFY4和CaTIFY7在果皮發(fā)育的后期表達(dá)量逐漸上調(diào)。種子發(fā)育過程中,CaTIFY11的表達(dá)量較高,在種子發(fā)育55～60 d明顯下調(diào)。CaTIFY12在種子發(fā)育的前15 d表達(dá)量較高,然后下調(diào)。在胎座發(fā)育過程中,CaTIFY11基因表達(dá)量較高,CaTIFY3、CaTIFY4和CaTIFY7基因表達(dá)水平隨著胎座的發(fā)育逐漸上調(diào),在發(fā)育60 d達(dá)到最大值,CaTIFY10和CaTIFY14在胎座發(fā)育的前35 d表達(dá)量較高,然后明顯下調(diào)。

注:A、B、C、D分別為高溫、低溫、干旱和鹽脅迫處理;E、F、G、H分別為赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯和水楊酸處理;C為對照;L為葉片;R為根系;0～6分別表示處理0～24 h。圖8 CaTIFYs基因在非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)情況Fig.8 Expression of CaTIFYs genes in response to abiotic stress and hormone treatment

2.6 辣椒TIFY基因家族成員非生物脅迫和激素處理后表達(dá)特征分析

研究非生物脅迫和激素處理后CaTIFYs家族成員基因的表達(dá)模式(圖 8)?？偟膩碚f,通過多種非生物脅迫和激素處理后,辣椒葉片和根系中CaTIFY2基因的相對表達(dá)量一直處于較高的表達(dá)水平,沒有明顯地下調(diào),而CaTIFY6、CaTIFY8、CaTIFY15、CaTIFY1、CaTIFY13基因的表達(dá)水平一直較低,處理后沒有明顯地上調(diào)。葉片中CaTIFY9基因的表達(dá)量處理明顯下調(diào),而CaTIFY3的表達(dá)量上調(diào),CaTIFY11的表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。根系中CaTIFY4、CaTIFY9、CaTIFY11、CaTIFY14基因的表達(dá)量明顯上調(diào)。

高溫處理后,葉片中CaTIFY14處理前1 h上調(diào)然后下調(diào),CaTIFY5前期下調(diào),處理6～24 h逐漸上調(diào)。根系中CaTIFY10在處理0.5 h表達(dá)量上調(diào),而CaTIFY5在處理6～24 h表達(dá)量明顯上調(diào)。通過低溫脅迫處理,葉片中CaTIFY14處理后0.5～24 h表達(dá)量逐漸上調(diào);根系中CaTIFY3在處理1 h和24 h表達(dá)量明顯上調(diào);CaTIFY10基因的相對表達(dá)量在處理后上調(diào)。干旱處理結(jié)果表明,葉片中CaTIFY4和CaTIFY14在處理3 h表達(dá)量上調(diào),CaTIFY3在處理1～6 h表達(dá)量上調(diào);根系中CaTIFY10在處理0.5 h和6 h表達(dá)量明顯上調(diào),CaTIFY12在處理后表達(dá)量明顯上調(diào)。使用NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理,葉片中CaTIFY3和CaTIFY14在處理1～3 h表達(dá)量上調(diào)。根系中,CaTIFY14在處理前1 h表達(dá)量明顯上調(diào),然后逐漸下調(diào)。

赤霉素處理后,根系中CaTIFY10和CaTIFY12的表達(dá)量明顯上調(diào),CaTIFY3呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。通過脫落酸處理后,根系中CaTIFY3在處理1 h后明顯上調(diào),CaTIFY12在處理1.5 h～24 h表達(dá)量明顯上調(diào)。茉莉酸甲酯處理后,葉片中CaTIFY3的表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。水楊酸處理后,葉片中CaTIFY9的表達(dá)量明顯下調(diào),處理6 h明顯上調(diào),CaTIFY4、CaTIFY3、CaTIFY11、CaTIFY14基因的相對表達(dá)量在處理12～24 h明顯上調(diào),處理24 h達(dá)到最大值。根系中CaTIFY3的表達(dá)量在處理3 h和處理24 h明顯上調(diào)。CaTIFY12和CaTIFY10處理前1 h表達(dá)量明顯上調(diào)。

3 討論與結(jié)論

TIFY基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育和抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用[30]。在模式植物中TIFY基因的鑒定和功能方面取得了重要進(jìn)展,但是在辣椒中研究較少。本研究從辣椒中共鑒定到15個(gè)TIFY基因家族成員,與擬南芥中18個(gè)、大麥中15個(gè)[31]相似。15個(gè)TIFY成員分布于8條染色體上,不同CaTIFYs長度差異很大,意味著TIFY基因的復(fù)雜性較高。等電點(diǎn)位于4.92～10.07之間,CaTIFY1、CaTIFY6、CaTIFY7、CaTIFY12、CaTIFY13等電點(diǎn)均小于7,均翻譯為酸性蛋白,其余成員均為堿性蛋白,與甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar. )TIFY研究結(jié)果相似,既有酸性蛋白又有堿性蛋白且堿性蛋白偏多[32]。辣椒TIFYs平均親水性均小于0,且不穩(wěn)定系數(shù)均小于40,說明CaTIFY均為不穩(wěn)定親水性蛋白,與毛果楊和西瓜(Citrulluslanatus)中TIFYs研究結(jié)果相似[12,33]。所有CaTIFYs亞細(xì)胞定位預(yù)測均位于細(xì)胞核中,前人研究黃瓜(CucumissativusL.)中TIFY均定位于細(xì)胞核[34],而在毛果楊[12]和核桃[10]等物種中TIFYs大部分定位于細(xì)胞核,也有部分TIFY定位于葉綠體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。CaTIFYs蛋白保守基序數(shù)目較少,只有Motif 2存在于所有CaTIFY蛋白中,不同TIFYs基序呈現(xiàn)較高的多樣性,推測在進(jìn)化過程中存在較大分化。通過對TIFY基因結(jié)構(gòu)分析顯示外顯子數(shù)目在3～10個(gè)之間,基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,同一分組基因的結(jié)構(gòu)相似,而不同分組中差異較大,與前人在水稻[8]和西瓜[33]中研究結(jié)果相似,根據(jù)其TIFY基因結(jié)構(gòu)的多樣性推測CaTIFY基因功能的多樣性。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,CaTIFY家族蛋白分為八大類群,其中第Ⅱ類群中僅含有OsTIFYs成員,說明第Ⅱ類群起源于雙子葉植物和單子葉植物分化之后。其中第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群中不含CaTIFYs成員,其他類群中,與單子葉植物水稻相比,辣椒與雙子葉植物番茄和擬南芥的親緣關(guān)系更近,多數(shù)CaTIFYs成員均與SlTIFYs聚集為一分支,進(jìn)而推測辣椒與擬南芥和番茄這些雙子葉植物具有相同的祖先。在甘藍(lán)的研究中,將91個(gè)TIFY蛋白分為10個(gè)分支[32]。擬南芥中TIFY1不僅與花序的發(fā)育有關(guān),而且還促進(jìn)葉柄和下胚軸的延伸[1-2],其中CaTIFY6和AtTIFY1聚集同一分支,推測其與AtTIFY1具有相同的功能。

啟動(dòng)子順式作用元件對調(diào)節(jié)基因表達(dá)至關(guān)重要,研究啟動(dòng)子中的順式作用元件有助于基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控的研究[35]。CaTIFYs啟動(dòng)子中存在4種激素響應(yīng)元件(生長素、茉莉酸甲酯、赤霉素和水楊酸),不同CaTIFYs中含有的元件類型不同且數(shù)量不等,表明CaTIFY基因?qū)に仨憫?yīng)的程度不同,所以推測CaTIFYs間存在功能差異。多數(shù)CaTIFYs均含有非生物脅迫響應(yīng)元件,在CaTIFYs中鑒定出多個(gè)非生物脅迫響應(yīng)元件如厭氧誘導(dǎo)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件等,表明CaTIFYs在厭氧誘導(dǎo)、防御和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CaTIFY12含有兩個(gè)低溫響應(yīng)元件,表明該基因可能在低溫脅迫中起關(guān)鍵作用。值得注意的是,CaTIFY4、CaTIFY9、CaTIFY12、CaTIFY14并不含有響應(yīng)干旱的誘導(dǎo)元件,但是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,通過干旱脅迫后這4個(gè)基因在根中強(qiáng)烈誘導(dǎo),因此推測,它們可能與其他基因相互作用,來應(yīng)對干旱脅迫。在研究中,CaTIFYs至少含有一個(gè)脅迫或激素響應(yīng)元件,表明其對外源植物激素和環(huán)境脅迫有反應(yīng)。

在植物生命周期中,不可避免地受到多種生物和非生物脅迫,對其生長發(fā)育造成影響。非生物脅迫如干旱、高溫、低溫和鹽脅迫以及重要的植物激素等,在植物的生命周期中對其生長和發(fā)育造成一定傷害[36]。一些研究表明,TIFY基因家族在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[37]。在本研究中,CaTIFY2、CaTIFY4、CaTIFY9、CaTIFY11、CaTIFY14在多種非生物脅迫以及激素處理后,表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平,表明CaTIFYs在這些脅迫中具有重要功能。CaTIFY9在不同處理后,在葉片中表達(dá)量明顯下調(diào),而在根系中表達(dá)量明顯上調(diào),表明CaTIFY9在不同組織中具有不同的生理生化功能來適應(yīng)各種環(huán)境脅迫。研究表明,JAs在植物生長發(fā)育中有作用,包括根系的生長發(fā)育以及葉片的衰老[38]。OsJAZ1可以通過水稻中的JA信號(hào)與OsMYC2相互作用來調(diào)節(jié)根系發(fā)育[39]。本研究中,通過MeJA處理后,根系中CaTIFY4、CaTIFY3、CaTIFY7、CaTIFY9、CaTIFY11、CaTIFY14基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào),表明CaTIFYs成員可能通過JA信號(hào)通路參與辣椒根系生長和發(fā)育。

為研究CaTIFYs在辣椒生長發(fā)育中的作用,對其不同組織及發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,在果實(shí)發(fā)育過程中,CaTIFY2、CaTIFY4、CaTIFY11在果皮、胎座和種子中表達(dá)量較高,而CaTIFY3、CaTIFY7、CaTIFY12僅在果皮和胎座中有一定的表達(dá),在種子中表達(dá)量很低。CaTIFY2、CaTIFY3、CaTIFY11、CaTIFY14在葉片發(fā)育過程中表達(dá)量較高,CaTIFY2、CaTIFY3、CaTIFY4、CaTIFY11、CaTIFY14、CaTIFY15在花發(fā)育過程中表達(dá)量較高。表明CaTIFYs對辣椒生長過程、花芽分化及果實(shí)成熟過程中均發(fā)揮一定作用。通過芯片數(shù)據(jù)顯示,玉米中TIFYs基因參與玉米不同發(fā)育階段,具有組織特異性表達(dá)模式[40]。TIFY基因家族在植物生長發(fā)育和抗逆性中具有多重調(diào)控作用,該家族中含有大量與植物生命活動(dòng)和抗逆反應(yīng)相關(guān)的基因,因此對這些基因的挖掘及鑒定具有重要意義。