楊瑜?王楠?李華?吳玲?王琪?謝貝?劉志輝?孟繁榮

【摘要】目的 比較不同耐藥型的結(jié)核分枝桿菌（MTB）熱休克蛋白基因hspX序列與表達(dá)，初步探討hspX與MTB的耐藥是否存在相關(guān)性。方法 選取4種一線抗結(jié)核藥物全部敏感株（S）、同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥（MDR）和一種耐藥［單耐利福平（MTBR+）、單耐異煙肼（MTBH+）、單耐鏈霉素（MTBS+）和單耐乙胺丁醇（MTBE+）］的菌株各10株，采用改良的十二烷基苯磺酸鈉裂解法和TRIzol法分別提取各組菌株的DNA和RNA，使用特異性引物進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定hspX基因的存在及其表達(dá)。對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以檢查正向和反向的多態(tài)性，并用DNAman軟件進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列比對(duì)。以敏感菌株（S）組為對(duì)照組進(jìn)行兩兩對(duì)比分析不同耐藥型的MTB菌株hspX表達(dá)的差異。結(jié)果 PCR成功獲得各組特異性的hspX基因，與H37Rv序列比對(duì)具有97%～99%的同一性，無(wú)存在明顯差異；以相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算獲得S、MDR、MTBR+、MTBH+、MTBS+和MTBE+菌株hspX的表達(dá)分別為0.98（0.89，1.23）、1.49（1.10，2.04）、1.41（0.55，2.80）、1.37（0.68，2.71）、0.91（0.59，1.62）和0.70（0.48，1.18）。

以敏感菌株（S）組為對(duì)照組，不同耐藥型菌株組與其比較，hspX表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。結(jié)論 hspX基因在MTB中是保守的。在自然狀態(tài)下，hspX基因在MTB的耐藥性方面無(wú)明顯相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；熱休克蛋白；hspX基因；耐藥性

Comparison of hspX gene sequence and expression in Mycobacterium tuberculosis with different drug resistance types Yang Yu， Wang Nan， Li Hua， Wu Ling， Wang Qi， Xie Bei， Liu Zhihui， Meng Fanrong. Institute of Pulmonary Diseases， Guangzhou Chest Hospital， State Key Laboratory of Respiratory Disease， Guangzhou 510095，China

Corresponding author，Meng Fanrong， E-mail： rendong.mfr@163.com

【Abstract】Objective To preliminarily explore whether there is a correlation between heat shock protein gene hspX and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis （MTB） by comparing the sequence and expression of hspX in MTB with different drug resistance types. Methods Ten strains sensitive to all four first-line anti-tuberculosis drugs （S）， one drug resistance （rifampicin-resistant MTBR+， isoniazid-resistant MTBH+， streptomycin-resistant MTBS+ and ethambutol-resistant MTBE+） and multidrug resistance （MDR） to isoniazid and rifampicin were selected， respectively. The DNA and RNA of strains in each group were extracted by modified SDS lysis method and TRIzol method， respectively. The existence and expression of hspX gene were determined by PCR and RT-PCR using specific primers. PCR products were sequenced to check the forward and reverse polymorphism， and DNAman software was employed to compare the sequence with the standard strain H37Rv. The difference in the expression of hspX among MTB strains with different drug resistance types was analyzed by pairwise with the sensitive strain group as the control group. Results The specific hspX gene was successfully obtained by PCR. The hspX gene sequence was 97%-99% identical with H37Rv， and there was no significant difference. The mean expression level of hspX through relative quantitation 2-ΔΔCt in S， MDR， MTBR+， MTBH+， MTBS+ and MTBE+ strains was calculated as 0.98（0.89， 1.23）， 1.49（1.10， 2.04）， 1.41（0.55， 2.80）， 1.37（0.68， 2.71）， 0.91（0.59， 1.62）

and 0.70（0.48， 1.18）， respectively. There was no significant difference in the expression of hspX among different drug-resistant strains groups when the sensitive strain group was regarded as the control group （all P > 0.05）. Conclusion The hspX gene is conserved in MTB. In natural state， there is no significant correlation between hspX gene and drug resistance of MTB.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis； Heat shock protein； hspX gene； Drug resistance

目前，一般認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌（MTB）對(duì)一、二線抗結(jié)核藥物耐藥主要源自藥物靶基因的改變，但是目前所發(fā)現(xiàn)的基因不能全面解釋耐藥性，仍有耐藥株未測(cè)得相應(yīng)靶基因突變，機(jī)制未明［1-2］。抗菌素在許多水平上影響細(xì)菌的反應(yīng)，除了突變引起的獲得性耐藥性外，應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞壁不通透性、外排泵的活性、分枝桿菌酶對(duì)抗生素的修飾和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，這些都是有主導(dǎo)蛋白參與的耐藥可能機(jī)制［3-4］。對(duì)于應(yīng)激調(diào)控的熱休克蛋白（HSP）可能也影響到MTB的藥物敏感性［5］。HSP是一組結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白，它普遍存在于細(xì)菌、真核生物，屬于分子伴侶的超家族，是細(xì)胞蛋白質(zhì)量控制機(jī)制的組成部分，被認(rèn)為是抵御危害細(xì)胞蛋白質(zhì)組的第一道防線［6］。目前還沒(méi)有明確的研究表明熱休克蛋白是否直接或間接地在授予耐藥性方面發(fā)揮了作用。本研究旨在通過(guò)比較不同耐藥型MTB的HSP16.3基因hspX序列的表達(dá)，初步探討hspX與MTB的耐藥相關(guān)性。

材料與方法

一、材 料

1.菌 株

實(shí)驗(yàn)所用的MTB菌株均源于我院的MTB菌株庫(kù)。菌株均已通過(guò)生化和分子方法鑒定為結(jié)核桿菌以及通過(guò)臨床藥敏診斷實(shí)驗(yàn)鑒定為“敏感株（S）”“耐多藥（同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥）株（MDR）”“單耐利福平株（MTBR+）”“單耐異煙肼株（MTBH+）”“單耐鏈霉素株（MTBS+）”和“單耐乙胺丁醇株（MTBE+）”。

2.試劑與儀器

TRIzol（200 mL）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits）、熒光定量PCR試劑盒為美國(guó)Thermo有限公司產(chǎn)品。Middlebrook 7H9/7H10培養(yǎng)基由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。細(xì)菌超聲分散儀BACspreaderTM 1100（體必康）、微量分光光度計(jì)（Thermo）、MP快速樣品制備儀、熒光定量PCR儀ABI Vin7、凝膠成像系統(tǒng)儀（BioRad）、細(xì)菌培養(yǎng)箱等。

二、方 法

1.菌株復(fù)蘇

-80 ℃冰箱里取出上述各類(lèi)型的凍存菌各10株，置水浴箱快速解凍，吸取1 mL轉(zhuǎn)接于約7 mL新鮮配置的7H9液體培養(yǎng)基1周，而后取200 ?L菌液涂布于自制的斜面7H10固體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱2～3周。后續(xù)刮取斜面培養(yǎng)物各接種培養(yǎng)3管用于實(shí)驗(yàn)研究。

2. DNA提取與鑒定

于斜面固體培養(yǎng)基中刮取濕重約20 mg的菌苔，置于1 mL磷酸鹽緩沖液打散重懸，室溫以10 000 r/min離心1 min，棄上清，加入600 ?L含有蝸牛酶的反應(yīng)液，37 ℃水浴過(guò)夜。菌壁裂解充分后，按試劑盒的說(shuō)明步驟依次加樣進(jìn)行，包括去除菌蛋白、洗脫雜質(zhì)、異丙醇沉淀DNA，最后50 ?L TE緩沖液溶解DNA。取1 ?L DNA樣品進(jìn)行濃度檢測(cè)。使用針對(duì)hspX全基因片段的引物（上游：5′-TCAAAGGCATCCGTTTCCATCG-3′；下游：5′-GGTGGACCGGATCTGAATGTGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶鑒定。

3. RNA提取與擴(kuò)增表達(dá)

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)菌液10 mL，調(diào)整濃度約為1麥?zhǔn)蠞岫?，室溫?0 000 r/min離心1 min，棄上清，加1 mL TRIzol液體，上下顛倒混勻，全部轉(zhuǎn)移至裂解介質(zhì)管中，并置于MP快速樣品制備儀，快速振蕩30 s，冰浴2 min，重復(fù)2次。在4℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清至RNase-free 1.5 mL EP管，加入200 ?L 氯仿，混勻，室溫靜置5 min。在4℃下以13 000 r/min離心15 min， 將上層液體轉(zhuǎn)移至另一RNase-free 1.5 mL EP管中，加入600 ?L異丙醇，60 ?L的3 mol/L NaAc （pH 5.3），10 ?L的glogen，-70 ℃條件過(guò)夜。在4℃下以13 000 r/min離心15 min， 棄上清，加入1 mL 75% 乙醇重懸，在4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，小心去除液滴，自然干燥5 min， 加入40 ?L RNase-free 水溶解。取1 ?L RNA樣品進(jìn)行濃度檢測(cè)。調(diào)整濃度，各樣品取10 ?L進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用針對(duì)hspX的特異性引物（上游：5′-TTATGGTCCGCGATGGTCAG-3′；下游：5′-AATGCCCTTGTCGTAGGTGG-3′）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以rrs為內(nèi)參基因，測(cè)得各組菌株hspX的Ct值，并進(jìn)行相對(duì)定量2-ΔΔCt法表達(dá)分析，以“敏感菌株（S）”hspX基因表達(dá)為“1”標(biāo)準(zhǔn)，超過(guò)“1”兩倍的為過(guò)表達(dá)，低于“1” 的1/2為低表達(dá)。

4. hspX基因序列測(cè)序與比對(duì)

以DNA為模板的hspX全基因片段長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物送至廣州華大科技生物有限公司進(jìn)行正、反向測(cè)序，獲得的所有序列與NCBI基因庫(kù)中存在的H37Rv

株的hspX基因（Gene ID：887579）序列進(jìn)行比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。根據(jù)各組菌株的hspX基因的Ct值相對(duì)表達(dá)值（2-ΔΔCt）。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)）即［M（P25，P75）］表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，多組比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、hspX全基因片段的鑒定

共提取了60株菌的總DNA，hspX基因全長(zhǎng)為435 bp，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定：條帶清晰，無(wú)雜帶，大小位于500 bp附近。見(jiàn)圖1。

二、各組菌株hspX基因序列與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列比對(duì)

經(jīng)華大基因測(cè)序獲得各組菌株hspX基因序列，并與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因序列比對(duì)，各組序列與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因序列無(wú)差異，具有97%～99%的同一性。見(jiàn)圖2。

三、各組菌株hspX表達(dá)差異

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)各組菌株hspX基因與內(nèi)參基因rrs的Ct值，測(cè)得以敏感菌株（S）組為對(duì)照的相對(duì)表達(dá)值（2-ΔΔCt）。不同耐藥型MTB各組菌株hspX基因的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1.830，P = 0.122）。見(jiàn)表1

討論

近年來(lái)，HSP功能和特性的復(fù)雜性和多樣性以及它們對(duì)人類(lèi)疾病的影響受到廣泛關(guān)注。在細(xì)菌中，HSP不僅能保護(hù)細(xì)胞免受非生物威脅，充當(dāng)分子伴侶，還參與細(xì)菌多種生物功能，增強(qiáng)細(xì)菌自身毒力，是細(xì)菌抵御非生物威脅的重要蛋白［7］。HSP在藥物抵抗方面也是研究熱點(diǎn)。白色念珠菌HSP90蛋白協(xié)調(diào)細(xì)胞壁的補(bǔ)償修復(fù)機(jī)制，響應(yīng)抗真菌引起的應(yīng)激，參與了抗真菌耐藥性的快速發(fā)展［8-9］。Zhou等［10］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較敏感與耐藥的白色念珠菌，發(fā)現(xiàn)多個(gè)HSP相關(guān)基因（HSP12和HSP90）在抗耐藥菌株中表達(dá)上調(diào)。在MTB中，HSP70是一種 ATP 依賴(lài)性分子伴侶蛋白，針對(duì)HSP70的變構(gòu)抑制劑能夠提高氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的療效并降低對(duì)一線結(jié)核病藥物利福平的耐藥性［11］。

在MTB被巨噬細(xì)胞吞噬后，HSP16.3暴露于應(yīng)激（低氧）壓力下，由兩個(gè)傳感器激酶（如DOSS和DOST）組成的雙組分系統(tǒng)被激活，調(diào)節(jié)劑DOSR磷酸化，HSP16.3表達(dá)上調(diào)［12］。與其他HSP一樣，HSP16.3是MTB重要生存毒力蛋白，低氧休眠時(shí)其高表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞功能以至于MTB在細(xì)胞內(nèi)存活，同時(shí)細(xì)胞壁增厚，是抗結(jié)核藥物抵抗的可能通路［13］。Hu等［14］用hspX缺失突變菌株（ΔhspX株）與野生菌株感染正常的BALB/C小鼠3周后，給予利福平、異煙肼和吡嗪酰胺治療14周，通過(guò)器官細(xì)菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)感染ΔhspX株的小鼠進(jìn)行抗菌藥物治療后，體內(nèi)細(xì)菌清除更快，提示hspX基因缺失，可能提高了體內(nèi)細(xì)菌的藥物敏感性。

因此，本研究初步通過(guò)比較不同耐藥型的MTB hspX序列與表達(dá)，初步探討hspX與MTB的耐藥相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hspX基因序列在所有結(jié)核分離株中均較為保守，在各類(lèi)型臨床分離耐藥MTB中發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異，與Seyed Majidi等［15］的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示單耐利福平和單耐異煙肼的菌株組hspX表達(dá)比敏感組高接近2倍，利福平和異煙肼耐藥可能跟hspX有關(guān)，盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明不同耐藥型菌株與敏感株的hspX的表達(dá)量比較無(wú)明顯差異，然而該基因在藥物刺激下的表達(dá)情況未知，這也是我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)的內(nèi)容，我們將進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間不同抗結(jié)核藥物刺激下MTB hspX的表達(dá)情況，同時(shí)還探討標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在不同抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的作用下為耐藥株的過(guò)程中hspX的表達(dá)。相似工作也有同行在進(jìn)行，Nachappa等［16］通過(guò)研究暴露于抗結(jié)核藥物HSP-DnaK/ClpB分子伴侶網(wǎng)絡(luò)中選擇基因的表達(dá)，以評(píng)估它們?cè)诋悷熾潞屠Ｆ奖┞镀陂gMTB臨床分離株的應(yīng)激反應(yīng)中的作用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果因樣本量不足未能充分驗(yàn)證。

總之，HSP維持細(xì)胞蛋白功能方面至關(guān)重要，它們?cè)诳菇Y(jié)核藥物引起宿主細(xì)胞的應(yīng)激壓力的影響尚不清楚。關(guān)于MTB的HSP對(duì)抗結(jié)核藥物的適應(yīng)性反應(yīng)的研究將有助于我們更好地了解抗結(jié)核藥物的作用機(jī)制和耐藥性。這些知識(shí)可以為治療MTB提供新的靶點(diǎn)，并用于開(kāi)發(fā)新藥或增強(qiáng)劑，以提高現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物的敏感性。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Nguyen Q H， Contamin L， Nguyen T V A， et al. Insights into the processes that drive the evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Evol Appl， 2018， 11（9）： 1498-1511.

［2］ 陳昕昶，陳嘉臻，張文宏.抗結(jié)核藥物及其耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的研究進(jìn)展.微生物與感染， 2019， 14（2）： 106-112.

［3］ Briffotaux J， Liu S， Gicquel B. Genome-wide transcriptional responses of Mycobacterium to antibiotics. Front Microbiol，2019， 10： 249.

［4］ Nasiri M J， Haeili M， Ghazi M， et al. New insights in to the intrinsic and acquired drug resistance mechanisms in mycobacteria. Front Microbiol， 2017， 8： 681.

［5］ Jee B， Kumar S， Yadav R， et al. Ursolic acid and carvacrol may be potential inhibitors of dormancy protein small heat shock protein16.3 of Mycobacterium tuberculosis. J Biomol Struct Dyn，2018， 36（13）： 3434-3443.

［6］ Carra S， Alberti S， Benesch J L P， et al. Small heat shock proteins： multifaceted proteins with important implications for life. Cell Stress Chaperones， 2019， 24（2）： 295-308.

［7］ Weidmann S， Maitre M， Laurent J， et al. Production of the small heat shock protein Lo18 from Oenococcus oeni in Lactococcus lactis improves its stress tolerance. Int J Food Microbiol， 2017， 247： 18-23.

［8］ Lamoth F， Juvvadi P R， Steinbach W J. Heat shock protein 90 （Hsp90）： a novel antifungal target against Aspergillus fumigatus. Crit Rev Microbiol， 2016， 42（2）： 310-321.

［9］ Lee Y， Puumala E， Robbins N， et al. Antifungal drug resistance： molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev， 2021， 121 （6）： 3390-3411.

［10］ Zhou W， Li X， Lin Y， et al. A comparative transcriptome between anti-drug sensitive and resistant Candida auris in China. Front Microbiol， 2021， 12： 708009.

［11］ Hosfelt J， Richards A， Zheng M， et al. An allosteric inhibitor of bacterial Hsp70 chaperone potentiates antibiotics and mitigates resistance. Cell Chem Biol， 2022， 29（5）： 854-869.e9.

［12］ Jee B， Singh Y， Yadav R， et al. Small heat shock protein16. 3 of Mycobacterium tuberculosis： after two decades of functional characterization. Cell Physiol Biochem， 2018， 49（1）： 368-380.

［13］ Yang L， Zhang C， Zhao Y， et al. Effects of Mycobacterium tuberculosis mutant strain hsp16.3 gene on murine RAW 264.7 macrophage autophagy. DNA Cell Biol， 2018， 37（1）： 7-14.

［14］ Hu Y， Liu A， Menendez M C， et al. HspX knock-out in Mycobacterium tuberculosis leads to shorter antibiotic treatment and lower relapse rate in a mouse model–a potential novel therapeutic target. Tuberculosis， 2015， 95（1）： 31-36.

［15］ Seyed Majidi A， Bazzazi H， Zamani S， et al. Comparison of hspX gene sequence in the Beijing and non-Beijing Mycobacterium tuberculosis. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis，2020， 21： 100187.

［16］ Nachappa S A， Neelambike S M， Ramachandra N B. Differential expression of the Mycobacterium tuberculosis heat shock protein genes in response to drug-induced stress. Tuberculosis（Edinb），2022， 134： 102201.

（收稿日期：2022-12-25）

（本文編輯：楊江瑜）