曹明英 姚朱華 張伶俐 王永剛

300121 天津市人民醫(yī)院心內(nèi)一科(曹明英、姚朱華、張伶俐);300070 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院(王永剛)

血小板異?；罨诩毙怨跔顒用}綜合征發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[1],此類患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)術(shù)后即刻血小板CD62p、CD63和糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲa水平較術(shù)前明顯增高[2-3]。PCI術(shù)中對狹窄局部實(shí)施球囊機(jī)械性壓迫、撕裂及支架置入,使斑塊破裂,暴露出內(nèi)皮下膠原、血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)等配體,通過vWF-GPⅠb 介導(dǎo)血小板粘附于損傷表面,引起血小板活化?；罨难“宀粌H參與血栓形成,還釋放多種血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子和生長因子,參與介入治療后的急性和亞急性血管再閉塞和再狹窄的發(fā)生[4-5]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是一種絲氨酸蛋白酶,通過促進(jìn)低密度脂蛋白受體在核內(nèi)體和溶酶體中的降解,增加血液中低密度脂蛋白膽固醇的水平,在脂質(zhì)代謝中起著重要作用[6]。最近研究也有報道PCSK9在心血管事件中發(fā)揮的作用與調(diào)節(jié)低密度脂蛋白膽固醇外作用相關(guān),包括它在促進(jìn)血小板活化和凝血過程中的作用,從而使心血管疾病進(jìn)展[7-9]。研究顯示,高PCSK9水平與接受直接PCI的急性心肌梗死患者的心臟事件獨(dú)立相關(guān),其原因可能是PCSK9與患者的炎癥和血小板活化標(biāo)志物有較強(qiáng)的相關(guān)性[10-11]。由此,PCSK9抑制劑(PCSK9 inhibitors,PCSK9i)因在預(yù)防和治療心血管疾病中的多效性而備受關(guān)注,不過迄今為止,以上結(jié)果僅限于動物實(shí)驗(yàn)或少數(shù)臨床研究。本研究旨在觀察PCSK9i(依洛尤單抗)對急性心肌梗死患者血小板活化的影響及對患者預(yù)后的影響。

1 對象和方法

1.1 研究對象

前瞻性隊(duì)列研究。入選2019年12月至2021年12月在天津市人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的以急性心肌梗死為首要初次診斷的患者89例,男性67例,女性22例,年齡38～81歲,平均(63.7±9.6)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18～85歲,性別不限;(2)診斷依據(jù)《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南(2016)》[12]和《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[13];(3)發(fā)病時間在24 h內(nèi);(4)無論是否接受再灌注治療(包括靜脈溶栓和PCI)均可。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)嚴(yán)重貧血(血紅蛋白<60 g/L);(2)血小板計數(shù)<100×109/L;(3)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶>2倍參考值上限;(4)重度腎功能不全(Cockcroft-Gault公式估算腎小球?yàn)V過率<30 ml·min-1·1.73 m-2);(5)腫瘤終末期,感染性休克,結(jié)締組織病,血液系統(tǒng)疾病,難治性高血壓,急性腦卒中,糖尿病酮癥或高滲昏迷,妊娠;(6)長期口服抗凝藥物和糖皮質(zhì)激素類藥物。本研究經(jīng)天津市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[倫理審批號:(2019)年快審第(C02)號],每位研究對象均簽署知情同意后進(jìn)行。

1.2 研究分組

采用隨機(jī)數(shù)字表方法將入選患者分為依洛尤單抗組45例和對照組44例。依洛尤單抗組于入院24 h內(nèi)給予皮下注射1支(140 mg)依洛尤單抗注射液(生產(chǎn)廠家:Amgen Manufacturing Limited,國藥批準(zhǔn)文號:S20180021),14 d后再次注射1支。對照組不予注射。兩組均于入院時給予負(fù)荷劑量的阿司匹林300 mg和替格瑞洛180 mg。此后每日常規(guī)應(yīng)用抑制血小板聚集和他汀降脂藥物,包括阿司匹林75～100 mg/次每日1次,替格瑞洛90 mg/次每日2次,瑞舒伐他汀10 mg/次每日1次。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄所有入選患者的臨床特征,包括年齡、性別、急性心肌梗死分型(急性ST段抬高型心肌梗死和急性非ST段抬高型心肌梗死)、吸煙、高血壓、糖尿病和卒中史。入院時均檢測肝功能、血脂、高敏C反應(yīng)蛋白和行超聲心動圖檢查。分別于入院時(干預(yù)前)、第1個月檢測血清PCSK9水平和血小板活化指標(biāo)(CD63和CD62P雙標(biāo)陽性的百分比)。

1.4 檢測方法

1.4.1 血清PCSK9水平檢測 采用雙抗體夾心法測定血清PCSK9水平,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作。

1.4.2 血小板活化指標(biāo)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿中血小板CD62P與CD63雙陽性表達(dá)的百分比。主要試劑:(1)美國BD公司生產(chǎn)的Monoclonal Antibody CD62P-FITC單克隆抗體;(2)美國BD公司生產(chǎn)的Monoclonal Antibody CD63-FITC單克隆抗體;(3)PBS液等。流式細(xì)胞儀:美國BD公司,型號:FACSCanto Ⅱ,Flowjo軟件。

檢測步驟:CD62P的陽性表達(dá)率測定:(1)以Flowcheck熒光微球檢查儀器光路、流路,調(diào)整顏色補(bǔ)償,該項(xiàng)工作由流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員協(xié)助完成;(2)從-20℃冰箱中取出富含血小板血漿的待測液,使用微量加樣槍各取5 μl;(3)取上樣管兩支,分別使用微量加樣槍加入20 μl CD62P-FITC單克隆抗體和20 μl IgG1-FITC,并標(biāo)記;(4)室溫下避光反應(yīng)20 min;(5)然后各加入PBS液4 ml;(6)反應(yīng)后立即上機(jī)進(jìn)行檢測;(7)選擇波長為488 nm的氬離子激光門,通過前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)區(qū)分血小板群;(8)設(shè)置血小板門,將血小板群與其他顆粒及細(xì)胞區(qū)分,流速控制在100～200個/s;(9)每份標(biāo)本檢測 10 000個血小板,以同型對照陽性率大于0%,小于2%為界,設(shè)定陽性細(xì)胞門,計算熒光標(biāo)記陽性血小板百分比,CD62P的表達(dá)率以陽性血小板所占全部檢測血小板的百分比表示。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒所標(biāo)記的注意事項(xiàng),以避免血小板激活,確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,檢查及調(diào)整儀器等在試驗(yàn)各步驟之間等待的時間間隙順利完成。CD63的陽性表達(dá)率測定:CD63陽性表達(dá)率使用CD63-FITC單克隆抗體,其具體操作步驟及注意事項(xiàng)參照上述CD62P的陽性表達(dá)率測定。

1.5 終點(diǎn)事件評價

本研究中主要不良心血管事件包括嚴(yán)重心臟事件和出血事件。嚴(yán)重心臟事件定義為冠心病相關(guān)死亡、非致死性心肌梗死、因心絞痛再入院。出血事件以2011年出血學(xué)術(shù)研究聯(lián)合會(BARC)制定的出血分類標(biāo)準(zhǔn)定義[14],記錄BARC出血1～2型、3或5型情況。

1.6 隨訪

于入組后第1、3、6、12和24個月分別進(jìn)行隨訪,采取門診復(fù)診或電話隨訪方式,詳細(xì)記錄主要不良心血管事件發(fā)生情況,并于第1、6和12個月檢測患者N末端B型利鈉肽原、心電圖和超聲心動圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組患者的基線臨床特征、血清PCSK9水平和血小板活化情況比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05),見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 PCSK9水平的影響因素

納入年齡、性別、高血壓、糖尿病、卒中史、吸煙、梗死類型(前壁、下壁及非ST段抬高型心肌梗死)、血小板活化指標(biāo)、高敏C反應(yīng)蛋白、N末端B型利鈉肽原和左心室射血分?jǐn)?shù)建立多因素回歸方程。結(jié)果發(fā)現(xiàn),性別(B=285.894,t=2.093,P=0.040)和高敏C反應(yīng)蛋白(B=-19.533,t=-2.356,P=0.021)對血清PCSK9水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義;血小板活化指標(biāo)與血清PCSK9水平無相關(guān)性(B=-40.756,t=-1.148,P=0.255)。

2.3 依洛尤單抗對PCSK9水平和血小板活化的影響

依洛尤單抗組的血小板活化指標(biāo)在干預(yù)前后存在統(tǒng)計學(xué)差異(Z=4.977,P<0.01),對照組則無統(tǒng)計學(xué)差異(Z=1.471,P=0.141),見圖1、表2。依洛尤單抗組明顯抑制了PCSK9水平,而對照組PCSK9水平無明顯變化,見表3。

圖1 兩組干預(yù)前后血小板活化流式圖

表2 干預(yù)前后血小板活化指標(biāo)變化情況[M(Q1,Q3)]

表3 干預(yù)前后血清PCSK9水平變化情況

2.4 依洛尤單抗對急性心肌梗死患者預(yù)后的影響

本研究隨訪截止時間為2022年2月28日,中位隨訪時間為17.6個月,最短11.1個月,最長26.9個月。

依洛尤單抗組:因心絞痛就診或再入院2例,其中1例行再灌注治療;2例發(fā)生腦出血,其中1例于1個月時死亡;1例因急性心力衰竭住院期間死亡。對照組因心絞痛就診或再入院8例,其中3例行再灌注治療。兩組因心絞痛就診或再入院發(fā)生率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.21,P=0.04)。

2.5 出血事件比較及影響因素

兩組BARC1或2型出血發(fā)生率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義[17.8%(8/45)比9.1%(4/44),χ2=1.439,P=0.230];BARC3或5型出血情況:依洛尤單抗組發(fā)生2例顱內(nèi)出血(其中1例死亡),對照組發(fā)生1例消化道出血,兩組發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗(yàn),P=0.509)。經(jīng)過二元logistic回歸分析,納入入院時血小板活性指標(biāo)和血清PCSK9水平兩個因素,結(jié)果提示血清PCSK9水平是出血的獨(dú)立風(fēng)險因素(B=-0.36,t=15.405,P<0.01),見圖2。

A:血小板活化指標(biāo)聯(lián)合PCSK9水平對出血事件的預(yù)測價值ROC曲線,顯示預(yù)測率86.56%;B:PCSK9與出血事件的概率圖,顯示PCSK9水平越高,出血風(fēng)險越低;C:血小板活化指標(biāo)與出血事件的概率圖,顯示血小板活化指標(biāo)越高,出血風(fēng)險越高

3 討論

PCSK9i顯著降低動脈粥樣硬化性心血管疾病患者低密度脂蛋白膽固醇水平和心血管事件發(fā)生風(fēng)險的作用,已在大規(guī)模臨床試驗(yàn)如依洛尤單抗的FOURIER等研究中得到明確證實(shí)[15-16]。此外,一系列人類臨床試驗(yàn)也證實(shí)了PCSK9對止血系統(tǒng)的影響:前瞻性PCSK9-REACT研究顯示,在接受PCI和P2Y12抑制劑的近期急性冠狀動脈綜合征患者中,血漿PCSK9水平與治療期間高血小板反應(yīng)性直接相關(guān),提示PCSK9可能增強(qiáng)血小板活化[17]。急性心肌梗死患者在急診PCI治療后,嚴(yán)重影響預(yù)后的是急性冠狀動脈內(nèi)血栓事件,而急性期機(jī)體的應(yīng)激炎癥狀態(tài)促使血小板處于活化狀態(tài),這就增加了血栓事件的發(fā)生風(fēng)險。本研究基于既往的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),觀察PCSK9i對急性心肌梗死患者血小板活化狀態(tài)的影響,并對非計劃性血運(yùn)重建等心臟事件進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,基于抑制血小板活化,PCSK9i(依洛尤單抗)能降低上述心臟事件的發(fā)生風(fēng)險。

靜止?fàn)顟B(tài)的血小板內(nèi)分布著多種顆粒,如a顆粒、溶酶體顆粒等。這些顆粒表面存在著一些特定蛋白,如a顆粒表面有CD62P抗原,溶酶體顆粒表面有CD63抗原。血小板活化時,由于顆粒膜蛋白與血小板膜蛋白相互融合,使顆粒膜蛋白翻轉(zhuǎn)到血小板膜表面。因此,可通過檢測這些顆粒膜蛋白來判斷血小板的活化狀態(tài)[18]。本研究采用流式細(xì)胞檢測的方法,檢測CD63和CD62P雙標(biāo)陽性的血小板,來定義活化的血小板。結(jié)果顯示,應(yīng)用依洛尤單抗治療能夠較非干預(yù)組明顯抑制血小板活化。Di Minno等[19]采用一種結(jié)合代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn),應(yīng)用PCSK9i治療家族性高膽固醇血癥患者可降低血小板活化因子及其前體的血漿水平。體外研究證實(shí)了CD36和Nox2激活介導(dǎo)的活性氧通路是PCSK9誘導(dǎo)血小板活化的潛在機(jī)制[20]。PCSK9i對血小板活性的影響凸顯了PCSK9與人類血小板功能調(diào)節(jié)之間的相互作用。PCSK9i可降低氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)ox-LDL途徑和抑制Nox2激活,阻斷花生四烯酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并抑制健康人的血小板活化[21-22]。Barale等[23]研究證實(shí),PCSK9i給藥6個月后血小板活化降低,并發(fā)現(xiàn)23例雜合型家族性高膽固醇血癥患者在PCSK9i治療后血小板活化標(biāo)志物(如CD62P表達(dá)、血漿可溶性CD40L、血小板因子4和可溶性P選擇素)水平降低,這些標(biāo)志物與血清PCSK9之間存在相關(guān)性。匯總既往研究和本研究結(jié)果提示,PCSK9i在與低密度脂蛋白受體結(jié)合的同時,也可能與血小板表面的相關(guān)受體結(jié)合,從而抑制血小板的活化。

近年來,PCSK9已被證實(shí)與動脈粥樣硬化疾病進(jìn)展過程中的血小板活化有關(guān)。這些研究的開展源于一個橫斷面調(diào)查,該研究從330例穩(wěn)定型冠狀動脈疾病患者中發(fā)現(xiàn)血漿PCSK9水平與血小板計數(shù)之間存在明確且獨(dú)立的相關(guān)性[24]。Pastori等[25]研究發(fā)現(xiàn),在心血管高?；颊咧?PCSK9升高與11-脫氫血栓素B2尿排泄量增加密切相關(guān),11-脫氫血栓素B2是血栓素A2的一種穩(wěn)定代謝物,提示PCSK9可能在調(diào)節(jié)血小板活化方面發(fā)揮作用。Camera等[8]的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步印證了這些臨床研究結(jié)果,他們利用動物模型研究PCSK9對血小板活化、聚集和血栓形成的影響,結(jié)果表明PCSK9基因的缺失降低了小鼠的血小板功能和動脈血栓的生成和穩(wěn)定性。本研究通過多因素線性回歸分析,未能證實(shí)急性心肌梗死患者體內(nèi)血清PCSK9水平與血小板活化指標(biāo)相關(guān),與既往研究結(jié)果不同,分析原因可能是選取的標(biāo)記物不同和未入選健康者作對照。

抑制血小板活化,減少血栓事件發(fā)生,勢必減少了非計劃再次血運(yùn)重建的風(fēng)險。但減少血小板活化,可能增加出血風(fēng)險。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),心絞痛患者血清PCSK9水平與活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間呈負(fù)相關(guān)[26],所以應(yīng)用PCSK9i后降低血清PCSK9水平,可能延長活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間,勢必增加出血風(fēng)險。另一項(xiàng)長達(dá)兩年的隨訪研究發(fā)現(xiàn),凝血酶原時間延長為急性心肌梗死患者全因死亡的獨(dú)立危險因素[27]。本研究結(jié)果顯示,兩組小出血事件發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異,但依洛尤單抗組發(fā)生了2例危及生命的顱內(nèi)出血,對照組僅發(fā)生了1例消化道出血,所以出血風(fēng)險需要進(jìn)一步關(guān)注。

總之,應(yīng)用PCSK9i可能抑制血小板活化,減少心血管事件風(fēng)險,而是否增加出血風(fēng)險尚需擴(kuò)大樣本量和延長觀察時間。本研究顯示PCSK9i(依洛尤單抗)有抑制血小板活化,從而減少心血管事件發(fā)生的趨勢,如果增加樣本量和應(yīng)用干預(yù)藥物療程,可能效果會更明顯。增加分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)一步深究PCSK9i抑制血小板活化的機(jī)制是本研究進(jìn)一步深入的方向。盡管本研究為PCSK9i提供了一種新的降膽固醇治療作用外的多效性探索模式,為各類高危心血管患者的治療提供了新的方向,然而此類藥物確切的療效與安全性仍有待更多的臨床研究論證[28]。后期研究還應(yīng)增加更多安全性指標(biāo)的監(jiān)測,如藥物依賴性和相關(guān)抗體的產(chǎn)生等,也是本研究的不足之處。

利益沖突：無