田然，買爾哈巴·米吉提，張相民，吳勇延，高偉

030001太原， 山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院（田然）；030001太原，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室/耳鼻咽喉外科（田然、買爾哈巴·米吉提、吳勇延、高偉）；518172 廣東 深圳，深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科（張相民、吳勇延、高偉）

頭頸癌是指發(fā)生在唇、口腔、鼻腔鼻竇、咽（鼻咽、口咽、喉咽）、唾液腺和喉等部位的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為主，其原發(fā)部位和病理類型之多，居全身腫瘤之首［1］。頭頸癌位居全身惡性腫瘤的第六位，其具有侵襲力強以及早期頸部淋巴結轉移的惡性生物學行為，是其主要致死的首要危險因素［2-3］。目前，頭頸部鱗癌主要的治療手段以手術為主，輔以放化療等。然而大約2/3的患者確診時已屬晚期［4］，5年生存率低于50%［5］。分子靶向治療作為當今腫瘤治療的新興方式，在消化道、呼吸道以及婦科等腫瘤治療中取得了較好效果，但頭頸部鱗癌分子靶點以及靶向制劑進展有限。因此，挖掘頭頸鱗癌中有效且特異的分子標志物，對于明晰其發(fā)病機理以及未來的精準診療有著重要的臨床意義。

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）為長度大于200 nt的非編碼RNA，以往被認為是“轉錄垃圾”。隨著新一代高通量測序技術的高速發(fā)展與廣泛應用，越來越多l(xiāng)ncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，其生物學作用也不斷突破認知，在腫瘤中的重要生物學功能備受學者關注。lncRNA MNX1-AS1位于人的7號染色體，在卵巢癌［6］、宮頸癌［7］、膠質母細胞瘤［8］等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)其表達異常，可通過調控下游信號通路影響癌細胞的增殖、侵襲遷移和凋亡等生物學表型。但lncRNA MNX1-AS1在頭頸部鱗癌中的生物學功能和臨床價值尚不明晰。本研究提取TCGA數(shù)據(jù)庫中的頭頸癌轉錄組數(shù)據(jù)，分析其表達水平與患者臨床病理參數(shù)的相關性，利用實時熒光定量（quantitative realtime ，qPCR技術檢測lncRNA MNX1-AS1在頭頸癌細胞系中的表達水平，并檢測其在頭頸癌細胞系增殖、侵襲和遷移惡性表型中的生物學功能，為頭頸鱗癌挖掘新的分子靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肺二倍體細胞系2BS、人永生化表皮細胞HaCaT與人舌鱗癌細胞系CAL-27購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，人喉鱗癌細胞系FD-LSC-1由復旦大學附屬眼耳鼻喉醫(yī)院頭頸外科團隊饋贈，人咽鱗癌胸水轉移細胞系Detroit562購自中國科學院上海細胞庫。主要試劑包括DMEM（Gibco，美國），胰蛋白酶（Sigma，美國），Trizol（Invitrogen，美國），反轉錄試劑盒（EasyScript，中國），實時熒光定量PCR試劑盒（TransGen Biotech，中國），LipofectamineTM3000 轉染試劑（Invitrogen，美國），CCK-8（TransGen Biotech，中國），Matrigel基質膠（Corning，美國），細胞凋亡檢測試劑盒（Zeta Life，中國），細胞周期檢測試劑盒（Yeasen，中國）等。常溫高速離心機（德國Eppendorf），雙人超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司），熒光定量 PCR 儀（美國 Roche），CO2培養(yǎng)箱（德國 Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染 FD-LSC-1培養(yǎng)基為BEGM，2BS、HaCaT、CAL-27以及Detroit562培養(yǎng)基為DMEM，均含10%FBS+1%青鏈霉素于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長到對數(shù)生長期時傳代。取上述細胞系，采用胰酶消化、中和、離心后接種于12孔板，待細胞融合度達到80%左右，用LipofectamineTM3000進行siRNA轉染，6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h檢測轉染效率。實驗分為陰性對照（siRNANC，si-NC）和實驗組 siRNA-lncRNA MNX1-AS1實驗組（分別轉染si-lncRNA MNX1-AS1-635或silncRNA MNX1-AS1-986），每組設置三個復孔。

1.2.2 qPCR檢測 上述培養(yǎng)板中加入Trizol提取細胞總RNA，核酸分析儀檢測總RNA的濃度與純度。采用TransGen Biotech進行反轉錄獲得cDNA后進行 qPCR，采用 2（-△△CT）法計算目的基因相對表達量，以18S作為內參基因，檢測細胞中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1的表達水平，qPCR引物和siRNA序列如 下：qMNX1-AS1-2F：GGCTCCACACTGCTTTCTGG；qMNX1-AS1-2R：GTTGTATGTTGTCTGCGTTGTT；18S-F：TGGATACCGCAGCTAGGA，18SR：CGGCGCAATACGAATGCCCC。LncMNX1-AS1 siRNA序列如下：si-lncRNA MNX1-AS1-635正義鏈：GAGUCUUGCAAAGAGGAGAUCUUUA，si-lncRNA MNX1-AS1-635反義鏈：UAAAGAUCUCCUCUUUGCAAGACUC。si-lncRNA MNX1-AS1-986正 義 鏈：GGCACUCCUUUAGAACCCACCUGUU；si-lncRNA MNX1-AS1-986反義鏈：AACAGGUGGGUUCUAAAGGAGUGCC。以上引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2.3 CCK-8細胞增殖能力檢測實驗 將呈對數(shù)增長的細胞鋪至6孔板中，分為si-NC組和si-lncRNA MNX1-AS1組。在細胞轉染24 h后接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。檢測時每孔加入110 μL CCK-8檢測混合溶液后避光孵育1 h。分別在0 h、24 h、48 h、72 h用酶標儀檢測450 nm處的光密度值，繪制生長曲線。

1.2.4 克隆形成實驗 細胞轉染24 h后，消化、中和、離心后，接種于6孔板后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)10天左右觀察克隆形成情況，待肉眼可見克隆形成后棄上清，室溫下用4%多聚甲醛固定和0.1%結晶紫染色，拍照并計數(shù)細胞克隆數(shù)。

1.2.5 Transwell侵襲和遷移實驗 細胞轉染24 h后，進行消化離心后，將培養(yǎng)液換為無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)洗滌兩次后。取200 μL含細胞的懸液加入Transwell細胞培養(yǎng)板的上室（侵襲實驗在上室加入Matrigel基質膠并待形成膜后加入細胞懸液），在下室加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉擦除上室細胞，PBS浸洗。4%多聚甲醛固定和0.1%結晶紫染色后晾干拍照，統(tǒng)計穿過小室的細胞數(shù)量。

1.2.6 TCGA數(shù)據(jù)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載頭頸鱗癌轉錄組測序數(shù)據(jù)及相應臨床信息，采用FPKM格式對lncRNAs的表達水平進行統(tǒng)計學分析。在R語言（3.6.3版本）中，利用“ggplot2”R包將分析結果可視化。使用“DEseq2”R包篩選差異表達基因，設置篩選閾值，上調性基因的篩選條件設置為log2FC ＞ 0且P ＜ 0.05，下調性基因的篩選條件設置為 log2FC ＜ 0 且 P ＜ 0.05。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPad Prism 6進行作圖。計量資料以均數(shù)標準差（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較用單因素方差分析。所有檢驗均為雙側。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P ＜ 0.001為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LncRNA MNX1-AS1在頭頸癌細胞系的表達水平

頭頸鱗癌細胞系FD-LSC-1、CAL-27以及Detroit562的表達較正常細胞系人胚肺二倍體細胞2BS和人永生化表皮細胞HaCaT中的相對表達倍數(shù)為309.781±52.769、300.607±65.519、86.657±37.356倍 和 9.637±1.519、9.613±0.965和 2.670±0.538（t值分別為 10.135、7.920、3.972 和 9.850、15.451、5.379，均 P ＜ 0.01），表明 lncRNA MNX1-AS1 在頭頸鱗癌細胞系中顯著高表達（圖1），提示lncRNA MNX1-AS1與頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

圖1 LncRNA MNX1-AS1在頭頸鱗癌細胞系中的表達水平Figure 1. Expression of LncRNA MNX1-AS1 in HNC Cell Lines

2.2 LncRNA MNX1-AS1的表達水平與頭頸癌患者臨床病理參數(shù)的相關性

從TCGA數(shù)據(jù)庫查找519例頭頸鱗癌組織樣本和44例正常對照組織的轉錄組測序數(shù)據(jù)，去除臨床病理信息不全的病例，最終納入502例頭頸鱗癌組織樣本進行差異表達分析。結果表明頭頸鱗癌組織中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1表達水平高于正常對照組織（頭頸鱗癌組織 vs 正常對照組織 = 0.323 vs 0.088；t = 5.024，P ＜ 0.05）；在 G3 + G4 病理分級頭頸鱗癌中相對表達量為0.442±0.768，顯著高于G1和G2病理分級的相對表達量0.279±0.445（t = -2.207，P ＜ 0.05）。臨床相關性分析發(fā)現(xiàn)，有吸煙史患者組中其表達水平高于無吸煙史患者組（0.351±0.577 vs 0.227±0.463；t = -2.342，P ＜ 0.05）；在 臨 床分期Ⅲ+Ⅳ期患者頭頸鱗癌組織中相對表達量為0.358±0.587，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者頭頸鱗癌組織中的相對表達量0.219±0.416（t = -2.803，P ＜ 0.05）。生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA MNX1-AS1 高表達組的患者總生存率顯著低于低表達組患者總生存率（P ＜ 0.05），其中中位生存時間分別為 42.97 個月、61.27個月（圖2）。

圖2 LncRNA MNX1-AS1表達與患者臨床參數(shù)的關系Figure 2.Relation of LncRNA MNX1-AS1 Expression to Clinical Parameters of Patients

2.3 LncRNA MNX1-AS1敲降效果

結果顯示，相比對照組si-NC，F(xiàn)D-LSC-1實驗組細胞轉染siRNA （si-lncRNA MNX1-AS1-635和si-lncRNA MNX1-AS1-986）之后的相對表達量分別為0.597±0.064和 0.557±0.023，t值分別為10.866和 33.250，均 P ＜ 0.001；CAL-27實驗組中的相對表達量分別為0.473±0.125（t = 7.296，P ＜0.05） 和 0.460±0.056（t = 16.799，P ＜ 0.001）。Detroit562實驗組中的相對表達量分別為0.500±0.205和0.563±0.185（t = 4.221，t = 4.094，均 P ＜ 0.05），達到預期敲降效果（圖3）。

圖3 轉染siRNA后頭頸鱗癌細胞系中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1的相對表達量Figure 3.Expressions of lncRNA MNX1-AS1 in HNC Cell Lines after Being Transfected by siRNA

2.4 LncRNA MNX1-AS1對頭頸癌細胞增殖活力的影響

生長曲線結果顯示，轉染si-lncRNA MNX1-AS1后，3個頭頸鱗癌細胞系的增殖活力均下降，t值分別為 11.920和 10.331、28.382±0.201和 27.976、5.311 和 4.394， P 均 ＜ 0.05（圖 4）。

圖4 LncRNA MNX1-AS1對頭頸鱗癌細胞系增殖活力的影響Figure 4.Effects of LncRNA MNX1-AS1 on the Viability of HNC Cell Lines

2.5 LncRNA MNX1-AS1對頭頸癌細胞的克隆形成能力的影響

結果顯示，轉染si-lncRNA MNX1-AS1后，3個頭頸鱗癌細胞系克隆形成能力均顯著低于陰性對照 si-NC組，t值 分 別 為 10.577和 19.101、4.246和7.515、3.707和8.241，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），見圖 5。

2.6 頭頸鱗癌細胞系敲降lncRNA MNX1-AS1后遷移能力的變化

結果顯示，轉染si-lncRNA MNX1-AS1后，3個頭頸鱗癌細胞系的遷移能力均顯著低于陰性對照si-NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），結果表明敲降lncRNA MNX1-AS1顯著抑制頭頸鱗癌細胞系的遷移能力（圖6）。

圖6 LncRNA MNX1-AS1對細胞遷移能力的影響Figure 6.Effects of LncRNA MNX1-AS1 on the Migration of HNC Cell Lines

2.7 頭頸鱗癌細胞系敲降lncRNA MNX1-AS1后侵襲能力的變化

Transwell侵襲實驗結果如圖7。結果顯示轉染si-lncRNA MNX1-AS1后，3個頭頸鱗癌細胞系的侵襲能力均顯著低于陰性對照si-NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），結果表明敲降 lncRNA MNX1-AS1顯著抑制頭頸鱗癌細胞系的侵襲能力。

圖7 LncRNA MNX1-AS1對細胞侵襲能力的影響Figure 7.Effects of LncRNA MNX1-AS1 on the Invasion of HNC Cell Lines

3 討 論

腫瘤綜合治療取得了長足進步，分子靶向治療、免疫治療以及放化療等方式發(fā)揮著重要作用。其中靶向治療作為特異性較強的的治療手段能夠有效提高患者治療療效并延長生存期，因此尋找頭頸癌新的分子治療靶點有著重要臨床意義。隨著對lncRNA深入研究，發(fā)現(xiàn)它能在多個層面參與調控腫瘤的惡性表型，包括惡性增殖侵襲、遷移以及放化療抵抗等諸多惡性生物學進程等［9］。本課題組前期通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析頭頸癌組織中差異表達的lncRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNA MNX1-AS1在頭頸癌組織中差異表達，可能是頭頸癌中重要的分子靶點。因此我們進一步探討了lncRNA MNX1-AS1在頭頸癌中的細胞生物學功能與臨床價值。

LncRNA MNX1-AS1已經(jīng)被證實參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，如，lncRNA MNX1-AS1在惡性膠質瘤中表達上調且促進癌細胞的侵襲［8］；在宮頸癌組織和細胞中顯著上調，并通過MAPK通路參與癌癥進展［7］；在骨肉瘤組織中高表達并通過抑制KISS1來促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲［10］；在卵巢癌中表達顯著上調，敲降lncRNA MNX1-AS1后細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降［11］；前列腺癌中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1表達上調影響了癌細胞的活力、侵襲和遷移并且通過miR-2113來調節(jié)癌癥的進展［12］，Liu 等［13］發(fā)現(xiàn) lncRNA MNX1-AS1 促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展通過下游miR-34a/SIRT1信號通路。此外，還有許多關于lncRNA MNX1-AS1在癌癥中高表達并且影響癌細胞的增殖、侵襲和遷移作用的相關研究［10，14-20］。以上報道表明 lncRNA MNX1-AS1與腫瘤的增殖和轉移相關，與上述結果一致。本研究采用siRNA干擾lncRNA MNX1-AS1的表達，功能實驗發(fā)現(xiàn)頭頸癌細胞增殖活力、侵襲和遷移能力均降低，但目前關于lncRNA MNX1-AS1在頭頸癌中的作用機制的相關研究較少，其機制尚不清楚，應予以進一步深入探索。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MNX1-AS1在頭頸癌中異常高表達，發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的重要生物學功能，可能是頭頸癌中重要的新型分子靶點。

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