邵昌明　謝姍珊　智勇　曙阿克·哈爾恒　林柏桐　于燕艷　曾斌芳

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）的活性成分及潛在靶點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證PI3K-Akt、信號(hào)通路，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法 通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到中藥的有效活性成分，同時(shí)從 GeneCard、OMIM和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CAG的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索及篩選；預(yù)測(cè)其活性成分與疾病靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選節(jié)點(diǎn)，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，探討?zhàn)B陰活胃合劑治療CAG的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：選用SPF級(jí)SD雄性大鼠，采用隨機(jī)分配法分為空白組及造模組，利用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）及饑飽失常法等方法進(jìn)行造模，造模成功后隨機(jī)分為模型組、維酶素組以及養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組，每組10只，連續(xù)干預(yù)56 d；通過(guò)HE染色觀察各組SD大鼠胃黏膜病理組織的變化，IHC檢測(cè)各組大鼠胃黏膜PI3K、AKT1、mTOR中蛋白的表達(dá)含量。結(jié)果 從養(yǎng)陰活胃合劑中篩選出309個(gè)化學(xué)成分，涉及治療CAG的靶點(diǎn)378個(gè)；篩選疾病靶點(diǎn)698個(gè)，共同靶點(diǎn)130個(gè)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)自由度≥平均自由度，篩選核心靶點(diǎn)38個(gè)；通過(guò)GO、KEGG富集分析得到，養(yǎng)陰活胃合劑可以影響PI3K-Akt、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥相關(guān)等多個(gè)信號(hào)通路。養(yǎng)陰活胃合劑能夠有效降低CAG模型大鼠胃組織中PI3K、AKT1、mTOR中蛋白表達(dá)情況（P<0.05）。結(jié)論 養(yǎng)陰活胃合劑通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)治療CAG，可以有效改善CAG模型大鼠胃黏膜細(xì)胞的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等，有效調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，能夠有效改善CAG大鼠胃黏膜的損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 養(yǎng)陰活胃合劑；慢性萎縮性胃炎；胃黏膜；活性成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；作用機(jī)制

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.013

Mechanism of action of Yangyin Huowei Mixture in treating chronic atrophic gastritis based on network pharmacology and experimental verification

SHAO Changming1， XIE Shanshan1， ZHI Yong1， SHUAK Harheng1， LIN Baitong2， YU Yanyan1， ZENG Binfang1*

1. Xinjiang Medical University Institute of TCM， Urumqi， Xinjiang 830011， China; 2. Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To predict the active ingredients and potential targets of Yangyin Huowei Mixture （YYHWM） in treating chronic atrophic gastritis （CAG） based on network pharmacology， and to provide scientific basis for clinical application through animal experimental verification of PI3K-Akt， signaling pathways. Methods The effective active ingredients of Chinese medicine were screened by traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） and SymMap database， and the targets of CAG were searched and screened from GeneCard， OMIM and DisGeNET database. To predict the active ingredients and disease targets， the network diagram was constructed by Cytoscape 3.7.1 software and the nodes were screened by topological analysis of the network. The protein-protein interaction （PPI） network of the core target was analyzed by STRING database. GO and KEGG enrichment analysis was performed on the core target genes using DAVID database to explore the mechanism of YYHWM in treating CAG. Experimental verification： SPF SD male rats were selected and randomly divided into blank group and model group. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine （MNNG） and hunger-satiety disorder were used for modeling. After successful modeling， they were randomly divided into model group， vitamycin group， low-， medium- and high-dose YYHWM groups， with 10 rats in each group， and were continuously intervened for 56 d. The pathological changes of gastric mucosa in SD rats were observed by HE staining. The expressions of PI3K， AKT1 and mTOR in gastric mucosa of rats in each group were determined by IHC. Results A total of 309 chemical ingredients were screened from YYHWM， involving 378 targets for treating CAG; a total of 698 disease targets and 130 common targets were screened， and 38 core targets were screened according to the the nodal degree of freedom ≥ average degree of freedom. Through GO and KEGG enrichment analysis， YYHWM can affect PI3K-Akt， TNF signaling pathway， MAPK signaling pathway， cancer-related and other signaling pathways. YYHWM can effectively reduce the protein expressions of PI3K， AKT1 and mTOR in gastric tissue of CAG model rats （P<0.05）. Conclusion Through multi-pathway and multi-target treatment of CAG， YYHWM can effectively alleviate the proliferation， the apoptosis and inflammatory response of gastric mucosal cells in CAG model rats， and regulate PI3K/Akt signaling pathway， thus reducing gastric mucosal injury in CAG rats.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yangyin Huowei Mixture; chronic atrophic gastritis; gastric mucosa; active ingredients; network pharmacology; mechanism of action

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）大部分由于幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori， HP）感染及自身免疫功能缺陷致使胃黏膜內(nèi)固有腺體萎縮、減少、胃黏膜變薄而引起的疾病[1-3]，嚴(yán)重可能發(fā)展成為伴腸上皮化生或異型增生的疾病，最后發(fā)展成為胃癌[4]，是腸型胃癌Correa模式的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。西醫(yī)治療主要是以對(duì)癥治療為主，比如消炎保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)、根除HP以及抗氧化治療[6]，對(duì)于部分患者的治療可能效果不明顯。經(jīng)研究及臨床試驗(yàn)表明，中藥復(fù)方治療CAG具有突出的效果，并且預(yù)后較好，對(duì)藥物依賴性比較小。中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)[7]，因此，中醫(yī)治療CAG具有巨大優(yōu)勢(shì)，在治療中可以改善胃黏膜的萎縮癥狀，防止病情的蔓延，并且能夠?qū)崿F(xiàn)萎縮的逆轉(zhuǎn)[8]。

中醫(yī)學(xué)將CAG歸屬為“胃痞”“呃逆”“胃脘痛”“痞滿”等范疇[9]。CAG主要是由于外邪入侵、情志內(nèi)傷及飲食不潔而引起的，致使脾失健運(yùn)，胃失和納，肝郁氣滯，肝胃不和，痰濕阻滯，痰瘀互結(jié)，氣血運(yùn)行失常，致使胃黏膜發(fā)生萎縮甚至發(fā)展成為腸化生[10]，應(yīng)以“活血化瘀，益氣養(yǎng)胃”為治療大法?！梆B(yǎng)胃陰”的思想在古代就已經(jīng)流行，養(yǎng)陰活胃合劑是曾斌芳教授的經(jīng)驗(yàn)方[11-12]，經(jīng)過(guò)組方加減及臨床研究，得到了養(yǎng)陰活胃合劑，對(duì)于臨床的治療具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。圍繞CAG的發(fā)病機(jī)制，以活血化瘀、益氣養(yǎng)胃為原則，“養(yǎng)陰”意為滋陰生津，“活胃”意為活血化瘀，從而推動(dòng)胃腸動(dòng)力，促進(jìn)蠕動(dòng)，使萎縮恢復(fù)，目前養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG在臨床上取得了很好的療效，通過(guò)前期臨床實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了養(yǎng)陰活胃合劑可以治療多種證型的CAG[13]。養(yǎng)陰活胃合劑是由蘆根、莪術(shù)、甘草、玉竹、茜草、白術(shù)、雞內(nèi)金組成，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)胃的功效。方中君藥蘆根止嘔、生津止渴、滋養(yǎng)胃內(nèi)津液；莪術(shù)破血行氣、消積止痛。臣藥玉竹養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴能夠顧護(hù)胃陰；茜草入脾胃經(jīng)，涼血止血、活血化瘀。佐藥白術(shù)健脾益氣、化濁和胃；雞內(nèi)金寬中健脾、消食磨胃。使藥甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、益氣養(yǎng)胃之功。因此，本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)挖掘養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的主要靶點(diǎn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，來(lái)探討?zhàn)B陰活胃合劑的對(duì)于臨床應(yīng)用的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)藥物、藥品和試劑

蘆根30 g（批號(hào)：20210901）、莪術(shù)9 g（批號(hào)：201001）、玉竹10 g（批號(hào)：200301）、茜草9 g（批號(hào)：191201）、白術(shù)10 g（批號(hào)：200601）、雞內(nèi)金9 g（批號(hào)：210301）、甘草6 g（批號(hào)：201002），以上藥材均購(gòu)自于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，上海羅恩試劑，批號(hào)：RH222415）；鹽酸雷尼替丁膠囊（云鵬醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：E210303）；雷尼替丁大鼠飼料（含3%的雷尼替?。┯尚陆t(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心制作；維酶素膠囊（德州博誠(chéng)制藥有限公司，批號(hào)：w20210401）；無(wú)水乙醇、氯化鈉AR分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20220201、20210601）；無(wú)菌去離子水、中性樹(shù)膠（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：F0020、1117L021）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BA02198228）；蘇木素染液、伊紅染液（Biosharp公司，批號(hào)：21236146）；黏附載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，REF.188105）；兔二步法試劑盒、封閉用羊血清、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為2241D0301、228060225、21110301、224020208）；PI3K、AKT1、mTOR抗體（美國(guó)Abcam試劑公司，批號(hào)分別為ab151549、ab81283、ab32028）。

1.2? 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠SPF級(jí)別選用4～5周齡，體質(zhì)量為180～220 g，購(gòu)買(mǎi)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，采用架式籠養(yǎng)，維持室溫在19～22 ℃，晝夜明暗交替12 h，許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：IACUC-20210331-03）。

1.3? 儀器

EG1150型組織包埋機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)、CV5030封片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；XSP-C204型光學(xué)顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；電子秤（AB104-N，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.4? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.4.1? 養(yǎng)陰活胃合劑有效活性化學(xué)成分的篩選及其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)? 通過(guò)TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SymMap（http：//www.symmap.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)收集養(yǎng)陰活胃合劑中蘆根、甘草、莪術(shù)、玉竹、茜草、白術(shù)的成分，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18，獲得有效成分，雞內(nèi)金通過(guò)SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)獲取有效化學(xué)成分，F(xiàn)DR（BH）<0.05，再通過(guò)TCMSP輸入有效化學(xué)成分，同上篩選條件，得到雞內(nèi)金的有效活性成分。

1.4.2? 有效成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)? 通過(guò)TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)將有效活性成分通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢成分并設(shè)置已被認(rèn)證的Reviewed，設(shè)置生物物種為Homo sapiens，來(lái)獲取藥物的有效成分靶點(diǎn)，查閱文獻(xiàn)獲取相關(guān)藥物成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用SMILES格式保存，對(duì)無(wú)法直接獲取的活性成分，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)繪制2D結(jié)構(gòu)獲取。

1.4.3? CAG靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)? 通過(guò)OMIM、DisGeNET和GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CAG的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，輸入“Chronic atrophic gastritis”，查詢CAG靶點(diǎn)，通過(guò)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的整合，去除重復(fù)項(xiàng)及刪除假陽(yáng)性來(lái)獲取疾病的靶點(diǎn)。

1.4.4? 養(yǎng)陰活胃合劑的靶點(diǎn)與CAG的相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建? 通過(guò)Venny 2.1.0分別將養(yǎng)陰活胃合劑和CAG的靶點(diǎn)錄入在線作圖工具平臺(tái)上，來(lái)繪制韋恩圖，獲得兩者交集的靶點(diǎn)蛋白。用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行構(gòu)建養(yǎng)陰活胃合劑成分、靶點(diǎn)及疾病的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.5? PPI絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的選擇? 通過(guò)STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)輸入藥物和疾病共同靶點(diǎn)，選擇蛋白種類(lèi)為“Homo sapiens”獲取相關(guān)信息，將結(jié)果導(dǎo)出為T(mén)SV格式，通過(guò)Cytoscape 將文件導(dǎo)入進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過(guò)選擇節(jié)點(diǎn)自由度≥平均自由度，篩選出核心靶點(diǎn)，導(dǎo)出文件。在通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的核心靶點(diǎn)輸入來(lái)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4.6? GO功能和KEGG通路富集分析? 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)重要靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，物種選擇人類(lèi)（Homo sapiens），統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用超幾何法以P＜0.01評(píng)估GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的突出性，選擇生物過(guò)程（biological process， BP）、細(xì)胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）。通過(guò)對(duì)重要靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，分析中藥復(fù)方靶點(diǎn)具有的生物學(xué)功能及信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而得到養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的主要作用通路。

1.5? 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模? 選取健康SD雄性大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組：空白組10只、造模組50只；空白組采取普通飼養(yǎng)，其他50只進(jìn)行造模，造模組參考文獻(xiàn)改良的四因素法進(jìn)行造模[14-15]。（1）采用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）：150 μg/mL MNNG溶液每天飲用，全程避光；（2）鹽酸雷尼替丁：制作含有3%雷尼替丁的特殊飼料進(jìn)行隔日喂養(yǎng)；（3）饑飽失常法：即每周一、周三、周五飽食，每周二、周四、周六、周日禁食，不禁水，禁食日來(lái)灌胃；（4）禁食日進(jìn)行隔天灌胃，周二、周六進(jìn)行空腹灌胃15% NaCl 溶液2 mL/100 g，周四、周日進(jìn)行空腹灌胃30%乙醇1 mL/100 g；持續(xù)造模10周，在第10周隨機(jī)抽取空白組和模型組各一只大鼠空腹12 h，進(jìn)行麻醉解剖，取全胃，使用HE染色，光鏡下觀察CAG大鼠胃黏膜的病理變化，可以觀察腺體萎縮，減少，病理分析采取全國(guó)慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診治方案意見(jiàn)中的病理診斷為標(biāo)準(zhǔn)[16]。造模成功后，將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、維酶素組以及養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組。

1.5.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理? 空白組不進(jìn)行藥物干預(yù)，進(jìn)行正常飼養(yǎng)；造模成功后，于第11周開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)，干預(yù)組停止飲用MNNG及特殊飼料喂養(yǎng)，恢復(fù)飲用正常水和正常飼料。各組藥物干預(yù)時(shí)間每天1次，連續(xù)給藥56 d，模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)，繼續(xù)飲用MNNG及特殊飼料；養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組按照成人與大鼠的體表面積換算等效劑量[17]，以1∶2∶4的比例給藥，低劑量組中藥飲片量3.55 g/kg、中劑量組中藥飲片量7.11 g/kg，高劑量組中藥飲片量14.22 g/kg；維酶素組藥量0.16 g/kg。大鼠最后一次灌胃干預(yù)后，禁食24 h，水正常給予，次日進(jìn)行麻醉解剖以10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，取全胃，生理鹽水清理，分離后迅速放入4%多聚甲醛固定液及凍存管放入液氮中，-80 ℃冰箱存放。

1.5.3? HE染色觀察胃黏膜組織病理變化? 胃組織固定，脫水，石蠟包埋切片，烤片1 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，蘇木素染色，1％鹽酸乙醇分化，PBS返藍(lán)，伊紅染色，乙醇梯度脫水、二甲苯脫蠟，中性樹(shù)膠封片，光鏡下多倍視野進(jìn)行觀察SD大鼠胃黏膜的病理情況。

1.5.4? IHC法觀察胃黏膜組織PI3K、AKT1、mTOR含量表達(dá)情況? 將石蠟切片在烤片機(jī)上60 ℃ 1 h后，二甲苯透明，乙醇梯度脫蠟，檸檬酸鹽修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗（PI3K，1∶100抗體稀釋液稀釋?zhuān)籄KT1，1∶250抗體稀釋液稀釋?zhuān)籱TOR，1∶400抗體稀釋液稀釋?zhuān)┓跤^(guò)夜大于16 h，滴加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，DAB顯色。蘇木素染核，1％鹽酸乙醇注液分化，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 8.0.2對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用“ｘ±s”表示，多組間采取平均數(shù)比較，單因素方差分析，各組間比較單因素ANOVA分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析

2.1.1? 養(yǎng)陰活胃合劑的有效成分? 從TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)獲得養(yǎng)陰活胃合劑有效成分309種，其中蘆根1種、莪術(shù)23種、玉竹8種、茜草168種、白術(shù)7種、雞內(nèi)金10種、甘草92種，其中2種及以上中藥所共有成分為2種。

2.1.2? 作用靶點(diǎn)的篩選? 獲取的有效活性成分經(jīng)Uniport轉(zhuǎn)換疾病靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)去除重復(fù)項(xiàng)，共獲得養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG靶點(diǎn)378個(gè)。通過(guò)Cytoscape 3.7.1繪制出藥物成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系圖。詳見(jiàn)圖1。

2.1.3? CAG相關(guān)靶點(diǎn)的篩選? 通過(guò)OMIM、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CAG的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，分別收集了蛋白靶點(diǎn)基因83、203、681個(gè)，整合后去除重復(fù)值共獲得698個(gè)CAG的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)。

2.1.4? 養(yǎng)陰活胃合劑的作用靶點(diǎn)與CAG相關(guān)靶點(diǎn)基因的Venny分析? 將養(yǎng)陰活胃合劑中的378個(gè)作用靶點(diǎn)與CAG中698個(gè)作用靶點(diǎn)輸入Venny 2.1作圖工具平臺(tái)，共獲得130個(gè)共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG潛在的活性靶點(diǎn)。

2.1.5? PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲆约昂诵陌悬c(diǎn)的篩選? 將獲得的共同靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)后獲得TSV格式文件后，將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1選擇自由度（degree）≥平均自由度的節(jié)點(diǎn)后，獲取到重要靶點(diǎn)38個(gè)，將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見(jiàn)圖2。圖中包含38個(gè)節(jié)點(diǎn)，159條邊，平均節(jié)點(diǎn)度是8.37，節(jié)點(diǎn)為蛋白，邊與邊是蛋白和蛋白的相互關(guān)系，線條越多顯示各個(gè)蛋白之間的關(guān)聯(lián)性越大，核心靶點(diǎn)排在前幾位的分別是PPARG、ALB、MTOR、PTEN、AKT1、CD4、HMOX1、MMP2、CCL2、IL-2。

2.1.6? 重要靶點(diǎn)的富集分析? 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，將養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的38個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行G0富集分析，BP、CC、MF每組按照P值選擇前10個(gè)利用微生信繪制條形圖。詳見(jiàn)圖3。

在GO富集分析過(guò)程中，主要包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、基因表達(dá)的正調(diào)控、耐藥性藥物敏感性/耐藥性、激活平滑肌細(xì)胞增殖、對(duì)異種生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡抑制等生物過(guò)程、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、蛋白質(zhì)均聚、細(xì)胞對(duì)缺氧應(yīng)激的反應(yīng)等信號(hào)通路。在KEGG富集分析中，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，將養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的38個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，每組按照P值選擇前30個(gè)通過(guò)微生信繪制氣泡圖，結(jié)果顯示，養(yǎng)陰活胃合劑可能涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥相關(guān)等信號(hào)通路見(jiàn)圖4。

養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的最主要的研究通路為PI3K-Akt信號(hào)通路選擇的研究靶點(diǎn)為PI3K、AKT1、mTOR，胃癌的疾病示意圖見(jiàn)圖5，從圖中可以看出胃癌在發(fā)育不良的階段與PI3K-Akt信號(hào)通路最為密切，可以使細(xì)胞重生。主要的作用靶點(diǎn)是AKT1、MTOR、EGF、PTEN、EGFR、IL-2、VEGFA、IL-6、CCND1等，通過(guò)Cytoscape 3.7.1構(gòu)建養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的KEGG活性成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系圖。詳見(jiàn)圖6。

2.2 養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

2.2.1? 大鼠胃黏膜的病理觀察? 經(jīng)HE染色后，光鏡下顯示，空白組胃黏膜細(xì)胞排列緊密整齊，腺體大小正常，沒(méi)有炎癥增生以及腸化的出現(xiàn)；模型組胃黏膜出現(xiàn)腺體萎縮，排列不規(guī)則，黏膜層可見(jiàn)充血，顯現(xiàn)出炎癥以及腸化現(xiàn)象：與模型組相比，養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組及維酶素組胃黏膜腺體萎縮明顯減少，并未見(jiàn)大量炎癥浸潤(rùn)，沒(méi)有出現(xiàn)腸上皮化生，并且均有不同程度的改變，主要以養(yǎng)陰活胃合劑中劑量組和高劑量組較為明顯。詳見(jiàn)圖7。

2.2.2 養(yǎng)陰活胃合劑對(duì)CAG模型大鼠PI3K、AKT1、mTOR含量的影響? 與空白組相比，模型組大鼠胃組織PI3K、AKT1、mTOR的表達(dá)量均升高（P<0.05）；與模型組相比，養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組及維酶素組胃組織中PI3K、AKT1、mTOR的蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1和圖8—10。

3 討論

CAG中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見(jiàn)指出：CAG的確診主要是應(yīng)用醫(yī)學(xué)技術(shù)胃鏡檢查及胃黏膜組織學(xué)檢查，尤其是胃黏膜組織學(xué)檢查的診斷價(jià)值更大，可見(jiàn)胃黏膜內(nèi)固有腺體萎縮、黏膜層變薄、伴或不伴腸腺化生和（或）假幽門(mén)腺化生等為特征的消化系統(tǒng)疾病。中醫(yī)講究的是辨證論治，對(duì)于HP感染的CAG患者，加蒼術(shù)、薏苡仁、黃柏、仙鶴草等，對(duì)于細(xì)菌的抑制有很好的療效。對(duì)一些膽汁反流的患者，加枳實(shí)、茯苓、香附、青皮等，對(duì)于吐酸、噯氣有一定療效。出現(xiàn)腸上皮化生及癌前病變的患者，可加白花蛇舌草、紫花地丁、半枝蓮、半邊蓮等藥物治療，這些藥物對(duì)于胃黏膜的保護(hù)及抑制腸上皮化生具有很好的作用[6]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的作用機(jī)制，對(duì)獲取養(yǎng)陰活胃合劑有效成分及得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分析，共獲得有效成分309種，這些可能是治療CAG的重要成分。β-谷甾醇、豆甾醇是植物甾醇類(lèi)化合物，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)物質(zhì)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等生物活性[18-20]；槲皮素屬于黃酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、防止血管增生等多種藥理學(xué)活性，槲皮素可以下調(diào)p-PI3K的表達(dá)，展現(xiàn)了槲皮素能夠有效誘導(dǎo)CAG的凋亡，與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)可以降低p-PI3K蛋白的表達(dá)，阻止胃上皮細(xì)胞免受氧化損傷[21-24]。

本研究預(yù)測(cè)出養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的130條信號(hào)通路，結(jié)果表明養(yǎng)陰活胃合劑主要通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)治療CAG。PI3K/Akt信號(hào)通路主要參與及調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其結(jié)構(gòu)為調(diào)節(jié)亞基p85及催化亞基p110，具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的活性。文獻(xiàn)研究表明，PI3K在CAG模型大鼠的胃黏膜上表達(dá)，PI3K被激活后，p110使PIP2磷酸化后為PIP3，使Akt 的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使AKT活化[25-26]。磷酸化后作用到下游的mTOR通路，與mTOR發(fā)生磷酸化反應(yīng)，調(diào)控下游基因，使細(xì)胞生長(zhǎng)，遏制細(xì)胞凋亡，抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，減少了對(duì)于大鼠胃黏膜的損傷，使在CAG過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞增殖和凋亡最終引起細(xì)胞死亡，進(jìn)一步阻斷胃癌前病變[27-30]。本研究將大鼠造模之后給予養(yǎng)陰活胃合劑進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠胃組織PI3K、AKT1、mTOR的蛋白表達(dá)情況，模型組中胃組織PI3K、AKT1、mTOR蛋白表達(dá)均升高，這說(shuō)明PI3K、AKT1、mTOR能夠抑制細(xì)胞的遷移、侵襲和腫瘤的生長(zhǎng)，防止胃癌前病變的發(fā)生，而養(yǎng)陰活胃合劑各組及維酶素組藥物干預(yù)后，胃組織PI3K、AKT1、mTOR中的蛋白表達(dá)均下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，但需臨床研究進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其重要通路 PI3K/Akt信號(hào)通路，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明：養(yǎng)陰活胃合劑能有改善CAG模型大鼠胃黏膜組織的病理變化，調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的增殖和凋亡，阻斷其癌變，實(shí)現(xiàn)萎縮逆轉(zhuǎn)，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也有一定的局限性，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)只包括一些草藥的活性成分，其他藥物還需根據(jù)查閱文獻(xiàn)分析其化學(xué)成分來(lái)預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，中藥復(fù)方也是將各個(gè)中藥簡(jiǎn)單疊加，人體內(nèi)的代謝也會(huì)影響其作用，在后期本團(tuán)隊(duì)將對(duì)其他的一些領(lǐng)域繼續(xù)驗(yàn)證，來(lái)進(jìn)一步闡明養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的研究機(jī)制。

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