張運恒 王軒 李毅

骨關節(jié)炎（OA）是一種由關節(jié)軟骨退行性變引起的疾病，以關節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質增生為特點。關節(jié)軟骨分解和磨損常引起關節(jié)疼痛、腫脹、僵硬等癥狀，通常累及膝關節(jié)、手腕、髖關節(jié)和脊柱，嚴重影響65 歲及以上老年人的生活質量。由于軟骨無血供且再生能力差，早期OA 治療包括自體軟骨細胞植入(ACI)[1]、自體骨軟骨移植(OATS)及微骨折手術[2]等，中晚期OA 治療包括截骨矯形、關節(jié)融合及關節(jié)置換。目前尚未有早期關節(jié)軟骨損傷有效的治療方法。近年來再生醫(yī)學成為了OA 治療研究的熱點。2006 年，Takahashi等[3]首次報道了誘導多能干細胞(iPSC），通過體外導入4 種特定的轉錄因子將小鼠皮膚成纖維細胞重編程為類胚胎干細胞形態(tài)。iPSC 具有很強的向軟骨細胞分化的潛能，且具有可通過對體細胞重編程獲得、來源較多、不涉及倫理問題等特點。大量研究表明，iPSC 在OA 早期治療和軟骨修復中具有廣闊的應用前景。本文對iPSC 的特點及其在OA 軟骨再生療法中的應用進行綜述，以期望在臨床上為OA 軟骨修復提供新的思路。

1 iPSC 特點

iPSC 與胚胎干細胞十分類似，呈圓形，在顯微鏡下可見其細胞群由高核質體積比的細胞組成，具有清晰的邊緣和較高的堿性磷酸酶活性[4]。它的細胞表面特征為存有階段特異性胚胎抗原（SSEA）3、SSEA4、糖蛋白t 細胞受體α 位點(TRA 1-60)等，可表達CD30、CD9、CD50、CD200 和CD90[5]。此外，iPSC 的免疫原性在一定程度上可被調控。Xu 等[6]研究表明，可使用新型CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)來生成由人類白細胞抗原（HLA）編輯的iPSC，這些iPSC 可避免受到T 細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的攻擊。

自體軟骨細胞、胚胎干細胞（ESC）和間充質干細胞（MSC）已應用于軟骨再生治療中。ACI 技術可治療的軟骨細胞有限，在體外增殖傳代也會導致其在培養(yǎng)過程中去分化。ESC 在臨床應用中有畸胎瘤形成的風險，且存在倫理問題。MSC 能特定地分化為軟骨、骨等，且可來源于脂肪、骨髓、臍帶等多種組織，因此大量應用于OA 治療中，但其體外傳代能力有限，而且合成及增殖能力也隨著年齡增長而下降。

iPSC 不僅能無限自我更新，還有分化成機體任意細胞的能力[7]。iPSC 可來源于豐富的成熟體細胞，通過重編程手段[8]獲取并用于治療，能無創(chuàng)操作且無醫(yī)學倫理問題。隨著對iPSC 研究的不斷深入，c-Myc基因被證實可從iPSC 制備過程中剔除，其余轉錄因子也分別有了替代品，逆轉錄病毒被證實可替換為質粒載體、仙臺病毒等。這些都讓iPSC 的生產變得安全，也使iPSC 的臨床應用成為可能。

2 iPSC 誘導關節(jié)軟骨形成

OA 最早且最主要的病理變化發(fā)生在關節(jié)軟骨。軟骨的主要功能是減震和潤滑，軟骨損傷會導致關節(jié)在頻繁的活動中逐漸發(fā)生磨損和降解，產生OA。因此，OA 治療的關鍵在于對軟骨進行修復。誘導真皮成纖維細胞、脂肪干細胞、臍帶血單核細胞等來源的iPSC 向軟骨分化是解決此問題的新途徑。

目前學者們進行iPSC 向軟骨分化的體外實驗有以下4 種方法。①將iPSC 培養(yǎng)為間充質前體細胞（MPC）、誘導多能干細胞來源的間充質干細胞（iPSC-MSC）等間充質細胞樣細胞，再誘導其向軟骨細胞分化。此方法可獲得相對均一的軟骨細胞，適用于軟骨發(fā)育不良的治療[9]。②將iPSC 培養(yǎng)在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中以獲得神經嵴細胞，再經此中間體分化為間充質細胞樣細胞，進而產生軟骨細胞。但研究發(fā)現(xiàn)其在植入軟骨缺損處后不會在體內自發(fā)產生軟骨[10]，必須在植入前將其分化為成軟骨譜系。③通過將iPSC 培養(yǎng)成擬胚體（EB），使iPSC 轉變?yōu)殚g充質細胞樣細胞，并通過細胞分選等方式將其獲得，最終完成向軟骨細胞的分化。這種采用EB 中間體的方法十分常用，不過其產生的間充質細胞樣細胞較少，且需使用專門的生物反應培養(yǎng)體系。④由于iPSC 有向三胚層分化的潛能，可以通過化學試劑及一些小分子物質將其持續(xù)向中胚層分化并減少其他分化方向，最后采用3D 培養(yǎng)使其轉化為軟骨細胞[11]。此方法較為節(jié)省時間且軟骨成熟度高[12]。值得注意的是，后兩種方法都涉及了中胚層譜系定向分化。Adkar等[13]通過一些細胞因子和化學分子等的調控作用，實現(xiàn)了iPSC 向軟骨細胞的轉化，且該軟骨細胞在體外成熟后還顯示出一定的異質性。相比于體外實驗，體內實驗更能證實iPSC 修復缺陷的能力。

大多數(shù)體內實驗研究基本可以理解為iPSC 在體外進行分化再移植到體內，目前較多使用的方法是通過培養(yǎng)EB 的方式或利用其他刺激來改善特定胚層細胞，也可采用通過iPSC 獲取軟骨細胞的方法，還可運用細胞支架以及化學試劑等。Zhu 等[14]通過誘導EB 的形成使人類iPSC 分化為軟骨細胞并用于大鼠OA 模型中，結果顯示OA 得到改善且有關節(jié)軟骨基質生成。在此基礎上，Rim 等[15]提出了使用編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2 或轉化生長因子（TGF）-β3 的微環(huán)載體，同樣可將人類iPSC 分化為軟骨細胞，并導入大鼠模型中修復軟骨缺損，這樣可降低EB 方法的細胞培養(yǎng)成本。此外，有學者提出了在EB 方法中添加Rho 相關蛋白激酶（ROCK）抑制劑(Y27632)，提高了EB 方法的安全性，可在無血清條件下完成人類iPSC 向關節(jié)軟骨細胞分化，證明其具有應用于臨床的潛力[16]。

除了利用EB 方法外，還有一種使人類iPSC轉變?yōu)橥该鬈浌堑姆椒?。在引入BMP-2、TGF-β1和生長分化因子（GDF）-5 等后，通過懸浮培養(yǎng)純化并產生軟骨顆粒，再將其移植到免疫缺陷小鼠和大鼠中，可發(fā)現(xiàn)表達Ⅱ型膠原蛋白的透明軟骨生成。Chang 等[17]建立了兔OA 模型，通過移植iPSC 進行治療并評估其模型中獲得的軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)分化的軟骨細胞可在體內有效地修復OA 導致的軟骨損傷且具有抗炎、抗分解的作用。

近期在大鼠、小型豬、兔等動物上進行的相關體內實驗大部分在體外實驗的基礎上完成。在不同的實驗研究中，iPSC 分化出的軟骨細胞不論在治療結果，還是在后期評估中都有不錯的表現(xiàn)，且iPSC 來源的細胞能夠在體內再生透明軟骨，表達Ⅱ型膠原蛋白，這些也為今后運用于臨床治療提供了參考。

2 iPSC 用于OA 軟骨再生治療

在OA 的軟骨再生治療中，iPSC 常與MSC 進行比較。在iPSC 發(fā)現(xiàn)之前，MSC 一直作為細胞治療的首選，因為其可來源于多種組織、無倫理道德問題且有旁分泌的功能。但MSC 增殖代數(shù)有限，難以獲得滿足組織工程技術的細胞用量。iPSC 的出現(xiàn)恰恰可以彌補這一缺點，產生足量的MSC 以達到對關節(jié)軟骨的修復。而眾多研究也表明，iPSC的衍生細胞體外軟骨分化很成功，可生成Ⅱ型膠原蛋白高表達的透明軟骨且少出現(xiàn)細胞肥大[18]，與原生關節(jié)軟骨細胞功能相似度極高。后期的體外實驗還發(fā)現(xiàn)，細胞生長環(huán)境顯著影響其向軟骨細胞分化的效率[19]，三維培養(yǎng)方法可提高細胞在孵化期間的接觸，在軟骨形成中至關重要。

Yamashita 等[20]、Zhu 等[14]及Rim 等[21]將體外培養(yǎng)的iPSC 衍生軟骨細胞移植到OA 動物模型體內，再對缺損部位的再生軟骨進行評估，均證實了由iPSC 分化產生的軟骨細胞對體內軟骨缺損的修復潛力。iPSC-MSC 較其衍生的軟骨細胞在移入體內后可獲得更好的結果。Xu 等[22]以iPSC-MSC為基礎，在實驗中驗證了iPSC 具有修復體內軟骨缺損的能力。

雖然iPSC 的衍生細胞在體內外均表現(xiàn)出不錯的軟骨再生潛能，且在多項研究中有半數(shù)以上未顯示任何類型的畸胎瘤或腫瘤形成，但是應用于臨床仍有諸多挑戰(zhàn)。首先，是存在于軟骨誘導的方法上，將iPSC 與軟骨細胞共培養(yǎng)，盡管軟骨細胞分泌的細胞因子可使iPSC 向軟骨細胞分化，但獲得的軟骨細胞數(shù)量較少且太過依賴與此共培養(yǎng)體系。同樣地，體外形成EB 后獲得的可產生軟骨細胞的中胚層細胞不足，很難滿足再生醫(yī)學的需要，如何高效地取得分化良好的間充質細胞樣細胞困擾著許多研究團隊。其次，iPSC 來源影響著其軟骨分化能力，相較于其他來源的iPSC，臍帶血單核細胞來源的iPSC 分化后可表達更多的軟骨特異性標記，但產生分化能力差異的原因至今未有研究探究，為臨床試驗增加了不確定因素。再者，全球iPSC 庫的開發(fā)正在進行，而缺乏統(tǒng)一藥品生產質量管理規(guī)范（GMP）標準的鑒別方案（即鑒別是否為符合GMP 級的用于臨床治療的iPSC 衍生人體細胞的方案）是其應用障礙之一。iPSC 的遺傳安全性問題也逐漸暴露出來，體細胞自身因素及培養(yǎng)iPSC 的不同階段均可導致遺傳物質改變，這些遺傳變異阻礙了它們在新療法中的應用。

3 結語

盡管iPSC 有諸多優(yōu)點，其臨床應用依然是漫長的過程，主要的限制原因是其致瘤性[23-24]。iPSC類似于ESC，理論上可以分化為三胚層的任意細胞，因此具備在未分化狀態(tài)下形成畸胎瘤的潛力。相信隨著越來越多優(yōu)秀的體內試驗和誘導方案的建立，iPSC 向骨或軟骨分化的技術也會日趨成熟。