何琴　王利　段薈芹　茍小蘭

摘要： 為探討在飼料中添加枯草芽孢桿菌和糞腸球菌對鯽魚生長發(fā)育、免疫機(jī)能及腸道菌群的影響，將900尾鯽魚分為3個試驗(yàn)組，分別飼喂基礎(chǔ)飼料（S1）、添加枯草芽孢桿菌與糞腸球菌混合飼料 （S2）和添加枯草芽孢桿菌飼料（S3），在飼喂47 d后檢測3組鯽魚的生長性能、免疫指標(biāo)和腸道菌群生物多樣性。結(jié)果顯示，添加枯草芽孢桿菌和糞腸球菌混合飼料組鯽魚的增質(zhì)量率、特定生長率和餌料系數(shù)均顯著高于其他組（P<0.05），該組鯽魚血清的丙二醛（MDA）含量顯著下降且低于其他2組（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）和堿性磷酸酶（AKP）活性較其他2組顯著升高（P<0.05）；3組鯽魚腸道菌群中多為厚壁菌門和變形菌門，共有優(yōu)勢菌屬均為梭菌屬，其中枯草芽孢桿菌和糞腸球菌混合飼料飼養(yǎng)組（S2組）鯽魚的腸道菌群更具多樣性。由此可見，枯草芽孢桿菌和糞腸球菌可有效促進(jìn)鯽魚生長，改善鯽魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其免疫機(jī)能。

關(guān)鍵詞： 枯草芽孢桿菌；糞腸球菌；益生菌；鯽魚；免疫指標(biāo)；腸道菌群

中圖分類號： S965.117 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0142-06

Effects of Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis on growth performance， serum biochemical indices and intestinal microflora of Carassius auratus

HE Qin¹， WANG Li¹， DUAN Hui-qin¹， GOU Xiao-lan²

（1.The Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic Affairs Commission， Southwest Minzu University ，Chengdu 610041， China;2.Calysseo（Chongqing）Co.，Ltd.， Chongqing 401220， China）

Abstract： In order to study the effects of Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis on the growth， immune function and intestinal flora of Carassius auratus， 900 healthy crucian carps were divided into three experimental groups and fed with basal feed （S1）， mixed feed of Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis （S2） and? Bacillus subtilis feed （S3）， respectively. Growth performance， immune indices and intestinal microflora diversity of Carassius auratus in the three groups were detected after feeding for 47 days. The results showed that the weight gain rate， specific growth rate and feed conversion ratio of crucian carps in S2 group were significantly higher than those in other groups （P<0.05）. The content of malondialdehyde in serum of crucian carps in S2 group was significantly decreased and lower than that in other groups （P<0.05）， and the activities of superoxide dismutase （SOD） and alkaline phosphatase （AKP） were significantly higher than those in other groups （P<0.05）. The intestinal dominant floras of Carassius auratus in the three groups were mainly composed of Firmicutes and Proteobacteria， while the common dominant genus was Clostridium. Compared with the S1 group and S3 group， the intestinal flora of crucian carp in the S2 group was more diverse. In conclusion， Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis can effectively promote the growth of Carassius auratus， improve the intestinal flora structure of Carassius auratus and enhance their immune function.

Key words： Bacillus subtilis;Enterococcus faecalis;probiotics;crucian carp;immune index;intestinal flora

近年來，益生菌成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，越來越多的證據(jù)表明益生菌在動物養(yǎng)殖方面具有顯著的優(yōu)勢與功效^[1]?？股氐拇罅渴褂靡呀?jīng)對人類和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了一定的毒副作用，而益生菌具有活性抗體的作用，能有效改善腸道健康，平衡菌群，提高動物免疫力，在一定程度上能代替抗生素發(fā)揮其抑菌作用^[2]。益生菌添加劑作為理想的抗生素替代品，已被廣泛用于疾病預(yù)防與控制^[3-4]。添加益生菌的飼料，不僅具有更高的營養(yǎng)價值，還能更有效地促進(jìn)動物健康。目前，益生菌被廣泛添加到飼料中或直接拌料飼喂。隨著中國對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視，人們發(fā)現(xiàn)抗生素的濫用對水體造成了大量的污染，水產(chǎn)品的質(zhì)量不斷下降^[5]。通過初步研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在水生動物中的應(yīng)用可以在一定程度上促進(jìn)水產(chǎn)動物有益菌的有效生長，同時抑制有害菌的生長，促進(jìn)水產(chǎn)動物的健康，預(yù)防和減少水產(chǎn)動物病害^[5]。

枯草芽孢桿菌和糞腸球菌是在漁用飼料中較常應(yīng)用的2種益生菌，它們通過在水產(chǎn)動物的腸道中定植從而改善水產(chǎn)動物的生長性能，同時達(dá)到提升其免疫機(jī)能的效果^[6]。枯草芽孢桿菌是一類廣泛存在于大自然中的好氧型革蘭氏陽性菌，為中國批準(zhǔn)的19種飼料添加劑益生菌中的一類，目前在食品、制藥、農(nóng)作物生產(chǎn)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域多有應(yīng)用^[7-8]。糞腸球菌具有抑菌作用，屬于乳酸菌屬，是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，其次級代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素和部分多糖等抑菌物質(zhì)對許多病害微生物的生長和繁殖都具有抑制作用，同時糞腸球菌還能產(chǎn)生有機(jī)酸等多種代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)動物腸道pH，從而抑制有害菌的生長^[9-10]。將枯草芽孢桿菌和糞腸球菌2種菌的復(fù)合菌通過飼料添加方式作用于動物產(chǎn)生的影響，僅在改善水貂^[11]（Neovison vison）、藍(lán)狐^[12]（Alopex lagopus）和斷奶仔豬^[13]等哺乳動物的生長和免疫性能上有少量研究，在水產(chǎn)動物中鮮有報道。

鯽魚是中國重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖魚類，經(jīng)過多代的人工育種已形成遺傳穩(wěn)定品系，具有一定研究價值^[14-15]。隨著國內(nèi)市場對鯽魚需求的增加，漁民廣泛應(yīng)用集約化養(yǎng)殖模式，濫用抗生素，使得流行性魚病的爆發(fā)狀況日益嚴(yán)重，如何使用益生菌低成本防治魚病成為目前研究的重點(diǎn)^[16]。本試驗(yàn)旨在探討在飼料中添加枯草芽孢桿菌和糞腸球菌及其復(fù)合菌對鯽魚生長發(fā)育、血清學(xué)指標(biāo)和腸道微生物多樣性的影響，從而為2種益生菌的下一步應(yīng)用提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康鯽魚平均體質(zhì)量（100±20） g，購自成都市某水產(chǎn)科技有限公司。對照組（S1）投喂基礎(chǔ)飼料，復(fù)合益生菌組（S2）投喂添加枯草芽孢桿菌和糞腸球菌的混合飼料，單一菌組（S3）投喂添加枯草芽孢桿菌的混合飼料?；A(chǔ)飼料為成都市某水產(chǎn)公司的魚用膨化配合飼料153號（2.0～3.0目），配方略作改動，其組成和主要營養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)用鯽魚使用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)1周，試驗(yàn)期間保證溶解氧>5.0 mg/L，水溫（27±3） ℃，pH 7.5～8.5，每天固定時間投喂3次飼料，日投餌量為試驗(yàn)魚體質(zhì)量的1%～3%?？莶菅挎邨U菌和糞腸球菌活菌種由西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，活菌濃度分別為1.5×10⁸CFU/ml和2.0×10⁸CFU/ml。

1.2 動物飼養(yǎng)

按100尾/箱的放養(yǎng)密度，將900尾鯽魚隨機(jī)放入9口試驗(yàn)網(wǎng)箱內(nèi)（1.0 m×1.6 m×2.0 m），每3個網(wǎng)箱為1個試驗(yàn)組。試驗(yàn)期間根據(jù)鯽魚每周的飲食和生長情況對攝食量進(jìn)行調(diào)整，飼養(yǎng)周期為47 d。每天觀察并記錄鯽魚的攝食活動和死亡情況，并及時稱量死亡的魚并查明死亡原因。

1.3 生長指標(biāo)測定

養(yǎng)殖47 d后，每組隨機(jī)取5尾魚，測定鯽魚的平均增質(zhì)量率（Weight gain， WGR）、特定生長率（Specific growth rate， SGR）、餌料系數(shù)（FCR）和存活率（Survival rate， SR）。計算公式：（1）增質(zhì)量率WG（%）=（W_t-W₀）/W₀×100; （2）餌料系數(shù)（FCR）=投飼總量/增質(zhì)量;（3）特定生長率SGR（%） = （lnW_t-lnW₀）/t×100; （4）存活率SR（%） = Nf /N_i×100。式中，? W_t是試驗(yàn)第t天時魚質(zhì)量（g），W₀是初始魚質(zhì)量（g），t是飼養(yǎng)周期（d），Nf 是試驗(yàn)結(jié)束時鯽魚的尾數(shù)，N_i是試驗(yàn)開始時鯽魚的尾數(shù)。

1.4 血清學(xué)指標(biāo)測定

鯽魚禁食24 h，每組隨機(jī)取5尾魚，通過尾柄靜脈取血，靜置離心以獲取血清，4 ℃保存，測定其丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）和堿性磷酸酶（AKP）活性。

1.5 腸道菌群多樣性測定

每組隨機(jī)取5尾魚，使用75%濃度的酒精消毒鯽魚體表，在無菌環(huán)境中取其腸道內(nèi)容物置于2 ml EP管中，-80 ℃保存。樣品由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X—±SD）表示，用SPSS 24.0單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析原始數(shù)據(jù)，采用Duncans法進(jìn)行多重比較，以P<0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與糞腸球菌對鯽魚生長性能的影響

添加枯草芽孢桿菌與糞腸球菌的飼料對鯽魚生長性能的影響見表2。試驗(yàn)47 d后，S2組的鯽魚增質(zhì)量率和特定生長率顯著高于S1和S3組（P<0.05），餌料效率顯著低于S1和S3組（P<0.05）。 同對照組相比，S2組鯽魚增質(zhì)量率和特定生長率顯著提高（P<0.05），分別提高140.55%和107.8%，而餌料系數(shù)顯著降低（P<0.05），降低了58.8%，各組成活率無顯著差異（P>0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌與糞腸球菌對鯽魚血清學(xué)指標(biāo)的影響

復(fù)合益生菌組（S2）對鯽魚血清中MDA含量及SOD和AKP的活性有明顯的影響（P<0.05）（表3）。復(fù)合益生菌組鯽魚的血清MDA含量低于對照組，SOD活性和AKP活性高于對照組（P<0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌與糞腸球菌對鯽魚腸道細(xì)菌分布的影響

對各組樣品總DNA的16S rDNA V4區(qū)共測得70 511條標(biāo)記（Total Tags）和5 395條低頻Tags（Unique Tags），樣品數(shù)據(jù)所得原始序列為73 449～79 357條。用Usearch在97％的一致性下進(jìn)行聚類，覆蓋率達(dá)到97％以上，說明測序數(shù)據(jù)合理，測序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中絕大部分物種。香農(nóng)指數(shù)反映了樣品中細(xì)菌多樣性及細(xì)菌分布均勻程度。

腸道菌群豐富度稀釋曲線表明，在序列測定量增加初期，操作分類單元（OTU）數(shù)量迅速增加，而當(dāng)序列測定量超過一定程度時，OTU數(shù)目緩慢上升，并逐步趨于平穩(wěn)。這說明鯽魚腸道大部分微生物的種類已被發(fā)現(xiàn)，各組樣品的測序總量可以較完整地闡述各組鯽魚的腸道微生物菌群的構(gòu)成。

經(jīng)過序列比對，3組鯽魚腸道菌群樣品在門水平上物種相對豐度（圖1），排名前10位的有：梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）。S1組以厚壁菌門（55.81%）和變形菌門（21.45%）為主，芽單胞菌門（1.94%）和疣微菌門（1.48%）的含量較低；S2組以厚壁菌門（19.5%）和變形菌門（31.7%）為主，藍(lán)細(xì)菌門（2.89%）和疣微菌門（2.98%）含量較低；S3組以厚壁菌門（11.35%）和變形菌門（35.09%）為主，藍(lán)細(xì)菌門（1.98%）和疣微菌門（2.97%）含量較低。3組鯽魚的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門和變形菌門。

3組鯽魚腸道菌群樣品在屬水平上物種相對豐度排名前10的有：微小桿菌屬（Exiguobacterium）、變形菌屬（Acidiferrobacter）、丹毒絲菌屬（Dielma）、檸檬酸細(xì)菌屬（Citrobacter）、梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium sensu stricto 1）、厭氧梭菌屬（Peptoclostridium）、粘細(xì)菌屬（Haliangium）、聚球藻屬（Synechococcus ）、梭菌屬（Romboutsia）和桿菌屬（Cetobacterium）。S1組以梭菌屬（Romboutsia）（36.98%）和厭氧梭菌屬（14.95%）為主，S2組以梭菌（Romboutsia）（5.91%）和丹毒絲菌屬（Dielma）（5.41%）為主，S3組以梭菌屬（Romboutsia）（5.94%）和聚球藻屬（Synechococcus）（4.12%）為主。3組腸道優(yōu)勢菌屬均以梭菌屬（Romboutsia）為主。

S1、S2、S3組樣品菌群OTU總數(shù)分別為3 573、4 964和4 698。3個組共有的OTU數(shù)為2 858，三者OTU總數(shù)的不同說明不同飼喂組的鯽魚腸道菌群具有一定的保守性。S1和S2組共有的OTU為3 188個，分別特有385和1 776個OTU；S2和S3組共有的OTU為4 004個，分別特有960和694個OTU；S1和S3組共有的OTU為3 108個，分別特有465和個1 590個OTU。S2組與S3組和對照組S1相比，總菌群種類及特有菌群種類更多。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌和糞腸球菌對鯽魚生長性能的影響

益生菌能通過多種渠道提高多種動物的生長性能，其中最為普遍的是益生菌能在宿主動物體內(nèi)分泌合成多種營養(yǎng)物質(zhì)參與機(jī)體的代謝過程^[17]，從而改善宿主動物腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，促進(jìn)動物的生長與繁殖^［18-20］。在日糧中添加益生菌或復(fù)合益生菌，對櫻桃谷肉鴨^[21]和蛋雛雞^[22]等家禽、梅花鹿^[23]、水貂^[11]、綿羊^[24]、山羊^[25]、斷奶仔豬^[13]、奶牛^[26]和犢牛^[27]等動物的腸道微生物都具有改善作用，能顯著提高其日增質(zhì)量，促進(jìn)動物的生長發(fā)育，提高動物的生長性能。目前，枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)動物益生調(diào)節(jié)作用已經(jīng)在許多水產(chǎn)動物試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，如枯草芽孢桿菌作用于烏鱧^[17]、奧尼羅非魚^[28]、鯉魚^[29-30]、斑馬魚^[31]、雜交鱘^[32]等水產(chǎn)動物，它們的相對生長率和特定生長率均能提高，同時其還對水產(chǎn)動物的生長、存活以及餌料利用都有一定的調(diào)節(jié)作用，能顯著提高魚類的生長性能。糞腸球菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究報道較為少見。在沙玉杰^[33]的報道研究中，飼糧中添加糞腸球菌后，凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶和脂肪酶活性顯著提高。本試驗(yàn)中，添加復(fù)合益生菌（S2組）的鯽魚特定生長率和餌料系數(shù)顯著高于對照組（S1組），且促生長效果最好，其促生長機(jī)理可能為： （1） 枯草芽孢桿菌和糞腸球菌在鯽魚腸道中可以分泌多種消化酶，同時通過提高鯽魚腸道內(nèi)消化酶的活性來協(xié)助分解飼料中的營養(yǎng)素，從而促進(jìn)飼料的消化吸收，提高飼料的利用率。（2） 枯草芽孢桿菌作為一種需氧菌，可以通過消耗鯽魚體內(nèi)的游離氧，從而促進(jìn)鯽魚體內(nèi)有益厭氧菌的生長繁殖，抑制有害好氧菌的生長。同時枯草芽孢桿菌定植于腸道后可以產(chǎn)生多種有機(jī)酸，從而營造出有利于糞腸球菌生長的酸性環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)糞腸球菌在鯽魚體內(nèi)的定植與生長。（3） 在鯽魚體內(nèi)，枯草芽孢桿菌和糞腸球菌可能代謝產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)供鯽魚利用，如揮發(fā)性脂肪酸和多種維生素等，從而促進(jìn)鯽魚生長^[34]。

3.2 枯草芽孢桿菌和糞腸球菌對鯽魚血清學(xué)指標(biāo)的影響

血清酶活性是反映魚類免疫狀態(tài)的主要指標(biāo)之一。AKP是血液中一種低特異性的單脂肪酶，AKP活性越高表示吞噬細(xì)胞對血液中異物的降解速率越大。黃燕華等^[35]研究發(fā)現(xiàn)，在奧尼羅非魚的飼料中添加糞腸球菌后，魚血清中AKP活性顯著提高，說明將糞腸球菌作為添加劑添加到奧尼羅非魚飼料中，會顯著提高它們的免疫力。SOD在一定水平上反映水產(chǎn)動物抗氧化狀態(tài)及對外部環(huán)境應(yīng)激的能力^[17]。楊虹等^[17]在烏鱧的飼料中加入含枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌，發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌能夠顯著提高溶菌酶（LZM）和SOD的活性。丙二醛（MDA）既可反映細(xì)胞損傷程度又可以反映脂質(zhì)過氧化程度，因此，MDA可以間接地反映動物的免疫狀態(tài)^[36]。孫盛明等^[37]研究發(fā)現(xiàn)，血清中SOD活性和MDA含量往往成反比，二者在測定動物血清學(xué)指標(biāo)時具有相互補(bǔ)充的作用，枯草芽孢桿菌可以提高團(tuán)頭魴SOD等抗氧化酶的活性，降低團(tuán)頭魴體內(nèi)的MDA積累。在本試驗(yàn)中，與S1組和S3組相比，S2組的處理可以更有效地提高鯽魚血清中AKP和SOD的活性并降低MDA含量，這與黃燕華等^[35]的研究結(jié)果一致。

3.3 枯草芽孢桿菌和糞腸球菌對鯽魚腸道菌群多樣性的影響

水產(chǎn)動物腸道內(nèi)微生物種群的變化與其免疫機(jī)能息息相關(guān)。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是脊椎動物腸道內(nèi)的主要菌群^[38-39]。胡娟^[31]報道，在鯉魚的飼糧中添加枯草芽孢桿菌，鯉魚體內(nèi)的梭桿菌門顯著增加，其中能產(chǎn)生維生素B₁2的鯨桿菌豐度顯著增加，而水產(chǎn)動物常見病原體變形菌門的檸檬酸桿菌屬和氣單胞菌屬豐度顯著降低，說明在鯉魚飼料中添加枯草芽孢桿菌能改善鯉魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，有效增加鯉魚腸道有益菌的比例，抑制病原微生物的生長繁殖。本試驗(yàn)中，3組樣品的優(yōu)勢菌群主要由厚壁菌門和變形菌門組成，均以梭菌屬（Clostridium）為優(yōu)勢菌屬。與S1比，S2組和S3組的優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的豐度有不同程度的升高或降低，其中丹毒絲菌屬數(shù)量增多，厭氧梭菌屬數(shù)量大幅降低，推測2種外源益生菌的添加對部分厭氧梭菌屬有拮抗作用。S2組的桿菌屬數(shù)量明顯多于S1組和S3組，推測糞腸球菌與枯草芽孢桿菌可相互促進(jìn)定植。S2組的放線菌數(shù)量多于S1組和S3組，放線菌可以產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物來抑制病原菌生長，改善鯽魚腸道環(huán)境^[36]。

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（責(zé)任編輯：張震林）