王欣波 ，齊明明 ，邵音 ，趙宇 ，聶雙蓮 ，樸勇洙

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種病因尚不明確的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以認(rèn)知功能降低與進(jìn)行性記憶力減退為主要表現(xiàn)。作為臨床癡呆的常見誘因，AD以異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和含β淀粉樣蛋白（Aβ）的老年斑塊為主要病理特征，目前尚無特效療法能阻止或逆轉(zhuǎn)AD 進(jìn)展[1]，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。目前全球約有5 000萬AD患者，預(yù)計到21世紀(jì)中葉罹患AD的人數(shù)將升至1.52億，我國目前約有1 000萬AD患者。

miRNA是一類核苷酸內(nèi)源性非編碼RNA，具有高保守性和組織特異性，通過Aβ代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎癥、Tau蛋白磷酸化和膽固醇代謝等生理過程參與AD發(fā)生發(fā)展[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，安神定志方能抑制海馬組織miR-103a-3p/BDNF通路，參與Tau蛋白磷酸化的調(diào)控，發(fā)揮改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用[5]。本研究通過體外實驗觀察安神定志方對Aβ誘導(dǎo)的大鼠PC12 細(xì)胞miR-103a-3p/BDNF/TrkB 通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明安神定志方治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞

清潔級雄性SD大鼠20只，8周齡，體質(zhì)量（200±5）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號SCXK（黑）2015-003。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實驗室動物房，溫度22.5～24.5 ℃，相對濕度44%～53%，光照時間12 h/d，自由攝食飲水。大鼠PC12細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物及制備

安神定志方（黨參15 g，茯神15 g，茯苓15 g，龍齒25 g，石菖蒲5 g，遠(yuǎn)志5 g），飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。將飲片置于圓底燒瓶中，加清水浸泡，文火煎煮2次后合并藥液，過濾后將藥液濃縮至原藥材濃度為1 g/mL，即得安神定志方水煎劑。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ25-35（貨號A4559），美國Sigma公司；胎牛血清（貨號10099141C）、DMEM 培養(yǎng)基（貨號11965084），美國Thermo Fisher 公司；MTT（貨號C0009S）、Annexin V-FITC 試劑盒（貨號C1062S）、Tau 抗體（貨號AF1249）、p-TauSer396抗體（貨號AF2368）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）抗體（貨號AF1423）、HRP標(biāo)記二抗（貨號A0208）、Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑（貨號C0526），上海碧云天；酪氨酸激酶受體B（TrkB）抗體（貨號ab187041）、p-TrkB抗體（貨號ab229908）、β-actin 抗體（貨號ab6276），英國Abcam公司；miR-103a-3p模擬劑，上海艾博思生物科技有限公司合成；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號4366596）、定量檢測試劑盒（貨號4427975），美國ABI公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（貨號E-BCK046-M）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號E-BCK025-S），武漢伊萊瑞特；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號MM-0386R2），江蘇酶免；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（貨號A005-1-1），南京建成。倒置相差顯微鏡（型號XZ-10），廣州明美光電技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀（型號Attune NxT）、實時熒光定量PCR儀（型號ABI7500），美國Thermo Fisher公司；電泳儀（型號164-5052）、凝膠成像儀（型號GelDoc），美國伯樂公司；全自動多功能酶標(biāo)儀（型號DP-9602G），北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.4 含藥血清制備

20只大鼠隨機(jī)分為空白組和安神定志方組，每組10只。按人與動物等效劑量換算給藥劑量，安神定志方組予安神定志方水煎劑8 g/kg灌胃，空白組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。末次灌胃24 h后，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，水浴滅活，0.22 μm濾膜過濾，即得空白血清和含藥血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 分組、造模及干預(yù)

PC12細(xì)胞以DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代2～3代后進(jìn)行實驗。

取對數(shù)期PC12細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96孔板，轉(zhuǎn)染前更換為Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基，通過Lipo6000 將miR-103a-3p 模擬劑轉(zhuǎn)染至50%融合的PC12細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

設(shè)置空白組、模型組、安神定志方組、過表達(dá)組和安神定志方+過表達(dá)組（聯(lián)合組），每組3個復(fù)孔。PC12細(xì)胞以106個/孔接種于6孔板，過表達(dá)組和聯(lián)合組接種轉(zhuǎn)染miR-103a-3p模擬劑的細(xì)胞。除空白組不予處理外，其余各組采用20 μmol/L Aβ25-35處理24 h建立AD細(xì)胞模型[6]。24 h后，空白組、模型組和過表達(dá)組更換為10%空白血清培養(yǎng)基，安神定志方組和聯(lián)合組更換為10%含藥血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 細(xì)胞活力

培養(yǎng)24、48、72 h 向各孔加入5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀波長570 nm處檢測各孔吸光度，即為細(xì)胞活力。

1.6.2 細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，按106個/mL進(jìn)行重懸，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL，暗室孵育15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡水平，計算凋亡率。

1.6.3 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測

培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清液，參照試劑盒說明書檢測上清液LDH 活性。細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融進(jìn)行裂解，3 500 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，參照試劑盒說明書檢測MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.6.4 RT-qPCR檢測

培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，TaqMan miRNA定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：95 °C、60 s；95 °C、15 s，60° C、15 s，72 °C、45 s，4 °C、1 min，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-103a-3p相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot檢測

培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，4 ℃、1 000 r/min離心10 min，采用BCA法測定蛋白濃度。上樣20 μg，SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入BDNF一抗（1∶1 000）、p-TrkB一抗（1∶1 000）、TrkB一抗（1∶5 000）、p-Tau一抗（1∶500）、Tau一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加HRP標(biāo)記二抗（1∶1 000），37 ℃孵育40 min。采用ECL法對膜進(jìn)行顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像后使用Quantity One 3.0軟件分析。以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 安神定志方對PC12細(xì)胞活力的影響

空白組細(xì)胞形態(tài)正常，呈多角形或梭形，細(xì)胞貼壁成簇生長，突起較長且相互交織呈網(wǎng)狀分布；模型組細(xì)胞縮小變圓，呈脫壁聚集狀，部分細(xì)胞漂浮、折光性下降，突起變短甚至消失；安神定志方組及聯(lián)合組細(xì)胞在細(xì)胞生長與交織成網(wǎng)方面與模型組接近，在細(xì)胞數(shù)量方面較模型組減少、突起較模型組縮短、連接較模型組紊亂；過表達(dá)組PC12細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞皺縮聚集、折光性驟降、突起減少。見圖1。

圖1 各組PC12細(xì)胞形態(tài)（×100）

與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞各時點細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯(lián)合組PC12細(xì)胞各時點細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），過表達(dá)組各時點細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組PC12細(xì)胞各時點細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.01）。安神定志方組培養(yǎng)48 h時細(xì)胞活力升高最明顯，因此選擇培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。見表2。

表2 各組PC12細(xì)胞不同時點細(xì)胞活力比較（±s）

表2 各組PC12細(xì)胞不同時點細(xì)胞活力比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達(dá)組比較，●●P＜0.01

組別空白組模型組安神定志方組過表達(dá)組聯(lián)合組72 h 0.69±0.06 0.41±0.03**0.51±0.04##0.34±0.04##0.46±0.06#●●n33333 24 h 0.45±0.03 0.31±0.04**0.41±0.04##0.25±0.03##0.37±0.03#●●48 h 0.57±0.04 0.36±0.05**0.52±0.07##0.28±0.03##0.43±0.03#●●

2.2 安神定志方對PC12細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見表3、圖2。

圖2 各組PC12細(xì)胞凋亡檢測流式圖

表3 各組PC12細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表3 各組PC12細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達(dá)組比較，●●P＜0.01

凋亡率10.39±1.17 22.85±1.97**12.67±1.19##30.82±2.31##17.48±1.23#●●組別空白組模型組安神定志方組過表達(dá)組聯(lián)合組n33333

2.3 安神定志方對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯(lián)合組細(xì)胞LDH活性和MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性增加，過表達(dá)組細(xì)胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組細(xì)胞LDH 活性和MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組PC12細(xì)胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）

表4 各組PC12細(xì)胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達(dá)組比較，●●P＜0.01

GSH-Px/（μmol/L）26.45±1.73 8.58±1.12**15.12±2.36##4.13±0.89##10.34±1.29#●●組別空白組模型組安神定志方組過表達(dá)組聯(lián)合組n33333 LDH/（U/L）346.12±25.12 832.98±41.19**391.45±24.78##943.48±42.23##687.26±36.57##●●SOD/（U/mL）198.47±14.36 48.32± 4.01**173.21±16.12##22.15± 3.89##64.36± 4.71#●●MDA/（mmol/mL）265.24±19.12 587.18±31.13**276.35±19.89##734.67±32.18##513.61±29.27#●●

2.4 安神定志方對PC12 細(xì)胞miR-103a-3p mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞miR-103a-3p mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯(lián)合組細(xì)胞miR-103a-3p mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.01），過表達(dá)組miR-103a-3p mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組細(xì)胞miR-103a-3p mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見表5。

表5 各組PC12細(xì)胞miR-103a-3p mRNA表達(dá)比較（±s，相對表達(dá)量）

表5 各組PC12細(xì)胞miR-103a-3p mRNA表達(dá)比較（±s，相對表達(dá)量）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與過表達(dá)組比較，●●P＜0.01

miR-103a-3p 1.00±0.03 2.92±0.19**1.78±0.12##3.91±0.21##2.13±0.14##●●組別空白組模型組安神定志方組過表達(dá)組聯(lián)合組n33333

2.5 安神定志方對PC12 細(xì)胞Tau、腦源性神經(jīng)因子、酪氨酸激酶受體B蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)明顯升高，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯(lián)合組PC12細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)明顯降低，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)明顯升高，過表達(dá)組PC12細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)明顯升高，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組PC12 細(xì)胞p-Tau 蛋白表達(dá)明顯降低，BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。各組細(xì)胞Tau、TrkB蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表6。

圖3 各組PC12細(xì)胞Tau、BDNF、TrkB蛋白免疫印跡

表6 各組PC12細(xì)胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組PC12細(xì)胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與過表達(dá)組比較，●●P＜0.01

TrkB 0.84±0.06 0.82±0.05 0.83±0.03 0.82±0.07 0.81±0.06組別空白組模型組安神定志方組過表達(dá)組聯(lián)合組n33333 p-Tau 0.11±0.02 0.49±0.05**0.18±0.03##0.73±0.09##0.31±0.04##●●Tau 0.98±0.09 1.04±0.12 1.01±0.09 1.05±0.11 1.03±0.11 BDNF 1.07±0.10 0.51±0.15**1.03±0.09##0.39±0.06##0.62±0.13##●●p-TrkB 0.94±0.11 0.37±0.06**0.61±0.07##0.21±0.03##0.51±0.08##●●

3 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，為本虛標(biāo)實之證，以虛為主，日久導(dǎo)致臟腑衰憊，或每與痰瘀兼雜，治療上應(yīng)重視痰瘀與AD的關(guān)系[7]。安神定志方出自《醫(yī)學(xué)心悟》，具有安神益智、豁痰開竅功效。方中黨參與遠(yuǎn)志安神益智，為君藥；臣以茯苓、茯神健脾寧心安神；佐以石菖蒲、龍齒豁痰開竅、鎮(zhèn)驚安神。研究發(fā)現(xiàn)，本方藥物及其有效成分可通過多靶點、多通路發(fā)揮治療AD作用[8-10]。本研究結(jié)果表明，安神定志方可以改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，抑制其凋亡水平。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在AD生理病理過程中扮演重要角色，可加劇神經(jīng)元損害，并通過誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，進(jìn)而引起患者認(rèn)知能力改變。MDA作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可抵抗活性氧（ROS）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，可以間接提示細(xì)胞過氧化損傷程度。過度的氧化應(yīng)激引起ROS大量釋放，從而增加MDA含量，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)鞘膜完整性破壞。有研究顯示，機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度與LDH活性呈正相關(guān)，而氧化應(yīng)激能導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，增加細(xì)胞膜通透性，促使LDH釋放到細(xì)胞外[11]。SOD能減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)元造成的損傷，在不飽和脂質(zhì)氧化降解過程中，SOD能夠抑制ROS誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生，抑制神經(jīng)毒性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)GSH-Px等抗氧化酶減少可導(dǎo)致體內(nèi)自由基大量生成，加強(qiáng)過氧化反應(yīng)，破壞組織和細(xì)胞，降低組織功能，造成機(jī)體衰老[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，安神定志方可顯著降低PC12細(xì)胞LDH活性和MDA含量，增加SOD和GSH-Px活性，表明安神定志方可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

BDNF是廣泛分布于大腦皮層和海馬組織的堿性蛋白，通過調(diào)控神經(jīng)元突觸形態(tài)與功能影響學(xué)習(xí)能力。作為神經(jīng)保護(hù)因子，BDNF對神經(jīng)元生長、分化、成熟和可塑性的維持具有重要作用[13]。此外，BDNF可通過與細(xì)胞膜上TrkB蛋白特異性結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成及釋放[14-15]。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，主要分布于神經(jīng)元的軸突部分，其磷酸化水平與腦組織神經(jīng)原纖維的纏結(jié)程度密切相關(guān)。Aβ通過與Tau蛋白結(jié)合形成可溶性的穩(wěn)定復(fù)合物，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及突觸功能障礙，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡[16]。Tau蛋白異常磷酸化是AD的特征性病理表現(xiàn)，在眾多的Tau蛋白磷酸化位點中，以絲氨酸（占53%）與蘇氨酸（占41%）位點磷酸化為主[17]。據(jù)報道，Thr231、Thr181和Ser396位點與AD密切相關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果表明，安神定志方可顯著下調(diào)PC12細(xì)胞miR-103a-3p mRNA 表達(dá)，與動物實驗結(jié)果[5]一致。在此基礎(chǔ)上，Western blot結(jié)果證實，安神定志方能顯著上調(diào)BDNF和p-TrkB蛋白表達(dá)，而miR-103a-3p模擬劑能顯著下調(diào)PC12細(xì)胞BDNF及p-TrkB蛋白水平。此外，本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p模擬劑能上調(diào)Ser396位點p-Tau蛋白表達(dá)，而安神定志方能部分拮抗miR-103a-3p對Tau蛋白磷酸化的促進(jìn)作用。

綜上所述，安神定志方可能通過抑制PC12細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)激活BDNF/TrkB信號通路，從而抑制Tau蛋白磷酸化，對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。