賴?yán)?，楊躍龍

（1.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410000；2.懷化市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 懷化 418000）

朱砂是一味常用的中藥材，具有清心鎮(zhèn)驚、安神、明目、解毒之功效，用于心悸易驚，失眠多夢，癲癇發(fā)作，小兒驚風(fēng)，視物昏花，口瘡，喉痹，瘡瘍腫毒[1-2]。朱砂主要化學(xué)成分為天然硫化汞（HgS），其難溶于水，難被人體吸收[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[4-5]表明，朱砂中含有的少量可溶性汞（Hg2+）能在胃腸道內(nèi)溶解，是朱砂產(chǎn)生毒理作用的主要活性成分。2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中采用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（LC-ICP-MS）法測定朱砂中的二價(jià)汞，但LC-ICP-MS主要依靠進(jìn)口，成本高，運(yùn)行費(fèi)用也高，不便于普及使用。因此，使用成本更低的更易普及的液相色譜-原子熒光光譜（LC-AFS）法測定朱砂二價(jià)汞的含量尤為必要，而且使用LC-AFS法測定朱砂二價(jià)汞的含量均能滿足2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的要求。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

LC-AFS6500液相色譜原子熒光聯(lián)用儀（北京海光公司，貨號：216053）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，貨號：1125170265）；LC-ICP-MS（賽默飛世爾公司，貨號：SN02456R）。

汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司，供含量測定用，批號：A4Q1，濃度：1 000 μg/mL）；甲醇為分析純（美國GRACE公司，批號：2011171）；鹽酸為優(yōu)級純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20210825）；乙酸銨為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20201123）；氫氧化鉀為優(yōu)級純（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20190314）；硼氫化鉀為優(yōu)級純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20210422）；L-半胱氨酸為生物試劑（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20210308）；胃蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司，批號：A05GS144235）；胰蛋白酶（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：GT003251）；水為超純水由科室自制；朱砂（懷化龍?jiān)粗兴庯嬈?，批號?30402，130611，130826）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 儀器：LC-AFS6500液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，色譜柱：Angel C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相∶甲醇-0.04 mol/L乙酸銨（含0.1%L-半胱氨酸）（3∶97）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；載氣：氬氣，載氣流量：500 mL/min，屏蔽氣流量：1 000 mL/min；載液：鹽酸溶液（1+9），還原劑：2 g/L硼氫化鉀溶液。檢測器：汞燈（主電流30 mA）；負(fù)高壓：340 V；進(jìn)樣量：100 μL

2.2 供試品溶液的制備[6-8]精密稱取本品粉末30 mg（過五號篩），置250mL塑料量瓶中，一式兩份，一份加人工胃液200mL，另一份加人工腸液，搖勻，置37℃水浴中超聲處理2h（每隔15min充分搖勻1次），放冷，分別用相應(yīng)溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量至50 mL塑料離心管中，靜置24 h，用洗耳球輕輕吹去上層表面溶液，吸取中層溶液15 mL，用微孔濾膜（10 μm）濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL塑料量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

2.3 對照品貯備液的制備 精密量取汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置100 mL塑料量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL至量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品貯備液0.5、1、5、10、20、50 mL分別至100 mL塑料量瓶中加8%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密量取上述對照品溶液100 μL注入液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，記錄色譜圖（見圖1）。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得汞的回歸方程：Y=310.431X+11.832 6（r=0.999 8）；表明汞對照品在質(zhì)量濃度為0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

圖1 汞對照品溶液圖譜

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

2.5.1 人工胃液回收率試驗(yàn) 分別精密量取9份已知含量的樣品（批號：130402）約30 mg置250 mL塑料量瓶中，平均分成3組，分別各加入對照品溶液（12.5 μg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備。分別吸取100 μL注入液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖（見圖2），計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 人工胃液提取加樣回收率試驗(yàn)

圖2 人工胃液提取樣品溶液圖譜

2.5.2 人工腸液回收率試驗(yàn) 分別精密量取9份已知含量的樣品（批號：130402）約30 mg置250 mL塑料量瓶中，平均分成3組，分別各加入對照品溶液（5 μg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備。分別吸取100 μL注入液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖（見圖3），計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 人工腸液提取加樣回收率試驗(yàn)

圖3 人工腸液提取樣品溶液圖譜

試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批朱砂樣品（批號：130402），按樣品含量測定方法配制1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為100 μL，記錄峰面積，結(jié)果汞的峰面積RSD為3.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批朱砂樣品（批號：130402），按樣品含量測定方法配制1份，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣100 μL，記錄峰面積，結(jié)果汞的峰面積RSD為3.6%。試驗(yàn)結(jié)果表明：本品溶液在放置24 h后測定，汞的峰面積基本無變化，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批朱砂樣品（批號為：130402），按樣品含量測定方法配制6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別進(jìn)樣100 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。按回歸方程計(jì)算汞的含量，結(jié)果RSD分別為4.0%。試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法重復(fù)性良好。

2.9 陰性對照品干擾試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備不含朱砂的陰性對照品溶液。進(jìn)樣量為100 μL，注入液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明：陰性對照品溶液不干擾測定。（見圖4~5）

圖4 人工胃液提取空白樣品溶液圖譜

圖5 人工腸液提取空白樣品溶液圖譜

2.10 樣品含量測定 取3批不同批號的樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品中二價(jià)汞的含量測定結(jié)果

3 討論

雖然HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)是目前元素形態(tài)分析研究中最常用的方法[9-12]，但其在實(shí)際應(yīng)用中還存在著較多不足之處。如HPLC法多采用有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽為流動(dòng)相，會(huì)造成ICP-MS進(jìn)樣管和采樣錐的堵塞、基體效應(yīng)嚴(yán)重、影響檢測靈敏度、儀器運(yùn)行成本高等問題。通常在實(shí)際應(yīng)用中可沖入5%（體積分?jǐn)?shù)）以下的氧氣來解決碳沉積導(dǎo)致的錐孔堵塞問題，但這會(huì)造成采樣錐使用壽命的縮短。因此，在實(shí)際應(yīng)用過程中還需要根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x取不同的方法[13-15]，彌補(bǔ)聯(lián)用技術(shù)存在的缺陷。LC-AFS是中國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的分析儀器，具有分析靈敏度高、線性范圍寬、光譜干擾及化學(xué)干擾少、儀器結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉易于維護(hù)等特點(diǎn)[16-17]，As、Hg、Se、Sb等元素的主要熒光譜線介于200～290 nm之間，正好是日盲光電倍增管靈敏度最好波段，即處于AFS最佳檢測波長范圍內(nèi)。另一方面這些元素可以形成氣態(tài)化合物，與大量的基體相分離，從而大大降低了基體干擾，而且與LC-ICP-MS的溶液直接噴霧進(jìn)樣相比，AFS的蒸汽發(fā)生技術(shù)能將待測元素充分預(yù)富集，進(jìn)樣效率近乎100%。LC-AFS法其最大特點(diǎn)在于對含有特定元素的化合物具有高度的專一性和較高靈敏度[18]。由“2.10”項(xiàng)可以看出LC-AFS法具有與LC-ICP-MS相似的分析性能，與LC-ICP-MS相比較，LC-AFS法在采購成本、使用成本具有極大優(yōu)勢，并且具有操作簡單、容易上手的特點(diǎn)。

LC-AFS法測定朱砂中的二價(jià)汞的原理就是利用C18柱將其進(jìn)行分離，分離后的二價(jià)汞在酸性條件下，無機(jī)汞與硼氫化鉀在線反應(yīng)生成汞蒸氣，由原子熒光光譜儀測定。

3.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)中通過使用不同濃度的乙酸銨和L-半胱氨酸進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在使用0.04 mmol/L乙酸銨和0.1%L-半胱氨酸時(shí)二價(jià)汞的峰型較好，出峰時(shí)間較快。所以最終選擇甲醇-0.04 mol/L乙酸銨（含0.1%L-半胱氨酸）（3∶97）為流動(dòng)相。

3.2 還原劑濃度選擇[19-20]硼氫化鉀是原子熒光光譜儀常用的還原劑，其作用是將待測樣品溶液中的鹽酸與還原劑反應(yīng)，生成的氫氣和溶液中的汞元素形成氫化物，然后借助于載氣將其導(dǎo)入石英管燃燒，氫化物即迅速原子化。還原劑濃度過高，生成的大量氫氣會(huì)使儀器對汞的靈敏度和穩(wěn)定性變差，因此，在本試驗(yàn)中分別嘗試采用0.1%、0.2%、0.3%的硼氫化鉀進(jìn)行試驗(yàn)，使用0.2%的硼氫化鉀做還原劑時(shí)二價(jià)汞的靈敏度和穩(wěn)定性最佳，故采用0.2%的硼氫化鉀作為還原劑。

3.3 稀釋溶劑選擇 將水、流動(dòng)相分別作為稀釋溶劑分別進(jìn)樣進(jìn)行比較。結(jié)果在本試驗(yàn)所采用的色譜條件下，用流動(dòng)相作為稀釋溶劑峰形較好，故采用流動(dòng)相作為稀釋溶劑。

3.4 結(jié)論 本法通過模擬人體胃腸道環(huán)境對朱砂中的可溶性汞進(jìn)行提取，將提取液進(jìn)行稀釋后進(jìn)入LC-AFS進(jìn)行測定，通過對實(shí)驗(yàn)條件的不斷摸索，多次優(yōu)化設(shè)計(jì)，使得該方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可靠，符合2020年版《中華人民共和國藥典》9101分析方法指導(dǎo)原則要求，可用于朱砂中二價(jià)汞的的含量測定。