孫悅，胡馨月，丁曉麗，李晶，呂萍，張慧，梁成罡

·論著·

人胰島素及其類(lèi)似物中殘留溶劑測(cè)定方法研究

孫悅，胡馨月，丁曉麗，李晶，呂萍，張慧，梁成罡

102629 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院激素室/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

建立人胰島素及其類(lèi)似物中有機(jī)溶劑殘留測(cè)定方法，用同一方法測(cè)定目前在人胰島素及類(lèi)似物生產(chǎn)工藝中普遍存在的甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇 5 種殘留溶劑。采用頂空氣相色譜法，使用 DB-624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.53 mm，3 μm），載氣為氮?dú)?，流速?2.5 ml/min，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為 250 ℃，進(jìn)樣口溫度為 200 ℃，分流比為 5:1，頂空平衡溫度為 85 ℃，平衡時(shí)間為 20 min，柱溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?40 ℃，保持10 min，隨后以 5 ℃/min升至 80 ℃，隨后以 20 ℃/min 升至 200 ℃。甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈及正丙醇峰之間分離良好；專(zhuān)屬性、耐用性、精密度良好；甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇分別在 1.5 ～ 60.8、1.1 ～ 98.9、0.8 ～ 100.4、0.7 ～ 10.4、0.8 ～ 100.1 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（2均大于 0.99）；甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇檢出限分別為 0.6、0.3、0.2、0.2、0.2 μg/ml，定量限分別為 1.5、1.1、0.8、0.7、0.8 μg/ml；各溶劑在人胰島素及其類(lèi)似物中平均加標(biāo)回收率（n = 9）均在 90% ～ 110% 范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度良好。該方法可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于人胰島素及其類(lèi)似物中甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇 5 種殘留溶劑測(cè)定。

人胰島素及其類(lèi)似物； 頂空氣相色譜法； 殘留溶劑； 方法學(xué)驗(yàn)證

人胰島素及其類(lèi)似物由重組 DNA 技術(shù)制備得到，是 1 型糖尿病患者的基本治療方法，也是許多長(zhǎng)期 2 型糖尿病患者常見(jiàn)的治療選擇[1]。人胰島素由 A、B 兩條以分子間二硫鍵連接起來(lái)的肽鏈組成，A 鏈 21 個(gè)氨基酸，B 鏈 30 個(gè)氨基酸，胰島素類(lèi)似物在人胰島素結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸替換和脂肪酸鏈化學(xué)修飾，以改變吸收速率、作用持續(xù)時(shí)間、提高作用的再現(xiàn)性，并調(diào)節(jié)各種靶組織中的相對(duì)功效[1-3]。

藥品中的殘留溶劑系指在原料藥或輔料的生產(chǎn)中，以及在制劑制備過(guò)程中使用的，但在工藝過(guò)程中未能完全去除的有機(jī)溶劑[4]。人胰島素及類(lèi)似物下游生產(chǎn)工藝步驟包括包涵體清洗、包涵體溶解、胰島素原融合蛋白提取、緩沖液交換、胰島素原純化、胰島素原復(fù)性、酶切、胰島素純化、結(jié)晶和凍干等步驟[5]。以上工藝中常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇、乙酸等，其中乙腈、甲醇屬于第二類(lèi)溶劑，應(yīng)該限制使用，乙醇、異丙醇和正丙醇屬于第三類(lèi)溶劑，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)，制訂相應(yīng)的限度，使其符合產(chǎn)品規(guī)范、藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）或其他基本的質(zhì)量要求[4]。

2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》三部、《美國(guó)藥典》43 版、《歐洲藥典》10.0 版均收載了人胰島素、甘精胰島素、賴脯胰島素、門(mén)冬胰島素、地特胰島素及德谷胰島素，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前，獲得人胰島素及其類(lèi)似物批準(zhǔn)文號(hào)的企業(yè)及在注冊(cè)的企業(yè)較多，殘留溶劑測(cè)定方法各異。針對(duì)這一問(wèn)題，本文對(duì)人胰島素及其類(lèi)似物中殘留溶劑測(cè)定進(jìn)行了研究，建立了一種氣相色譜方法同時(shí)測(cè)定 5 種殘留溶劑，包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該法可操作性強(qiáng)、專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠保證產(chǎn)品質(zhì)量可控，節(jié)省檢測(cè)成本，為標(biāo)準(zhǔn)提高提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

7890A型氣相色譜儀和 7890B 型頂空進(jìn)樣器為美國(guó) Aglient 公司產(chǎn)品；ME155DU 電子天平為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；人胰島素、門(mén)冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素、德谷胰島素為中檢院激素室留樣；甲醇、無(wú)水乙醇、異丙醇為國(guó)藥集團(tuán)化藥試劑有限公司產(chǎn)品（含量≥ 99.5%）；正丙醇、乙腈和二甲基亞砜為美國(guó) Sigma Aldrich 公司產(chǎn)品（含量≥ 99.5%）；鹽酸、磷酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 頂空條件 采用 DB-624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.53 mm，3 μm），載氣為氮?dú)猓魉贋?2.5 ml/min，檢測(cè)器為 FID，檢測(cè)器溫度為 250 ℃，進(jìn)樣口溫度為 200 ℃，分流比為5:1，頂空平衡溫度為 85 ℃，平衡時(shí)間為 20 min，柱溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?40 ℃，保持 10 min，隨后以 5 ℃/min升至 80 ℃，隨后以 20 ℃/min升至 200 ℃。

1.2.2 供試品與對(duì)照品溶液配制

⑴供試品溶液：取人胰島素、門(mén)冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素、德谷胰島素，分別精密稱取 50 mg 置 20 ml 頂空瓶中，加 0.01 mol/L 鹽酸溶液 5 ml溶解，搖勻，壓蓋密封，作為供試品溶液。

⑵對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別精密稱取甲醇 150 mg、乙醇 250 mg、異丙醇 250 mg、乙腈20.5 mg、正丙醇 250 mg 置 50 ml 量瓶中，用 0.01 mol/L 鹽酸溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

⑶混合對(duì)照品溶液：分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液 1.0 ml 置同一 100 ml 量瓶中，用 0.01 mol/L 鹽酸溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，量取 5 ml 置 20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封，作為混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 專(zhuān)屬性樣品制備 分別量取混合對(duì)照品溶液、0.01 mol/L 鹽酸溶液 5 ml 置 20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封，作為專(zhuān)屬性溶液。

1.2.4 線性樣品制備 分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置同一量瓶，用 0.01 mol/L 鹽酸溶液梯度稀釋得到 LOQ、L1 ～ L7 系列混合線性溶液，其中甲醇濃度分別為 1.5、5.2、10.0、20.4、30.4、40.4、50.8、60.8 μg/ml，乙醇濃度分別為 1.1、8.4、16.3、33.1、49.4、65.8、82.6、98.9 μg/ml，異丙醇濃度分別為 0.8、8.5、16.6、33.6、50.2、66.8、88.9、100.4 μg/ml，乙腈濃度分別為 0.7、0.9、1.7、3.5、5.2、6.9、8.7、10.4 μg/ml，正丙醇濃度分別為 0.8、8.5、16.5、33.5、50.0、66.5、83.6、100.1 μg/ml，分別量取各混合線性溶液 5 ml 置 20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封即得。

1.2.5 精密度樣品制備 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 針考察精密度。

1.2.6 檢測(cè)限與定量限樣品制備 分別量取甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用 0.01 mol/L 鹽酸溶液依次稀釋?zhuān)咳?5 ml 置 20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封，以信噪比 S/N = 3 時(shí)相應(yīng)的濃度確定檢測(cè)限，以信噪比 S/N = 10 時(shí)相應(yīng)的濃度確定定量限。

1.2.7 準(zhǔn)確度樣品制備 取人胰島素、門(mén)冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素、德谷胰島素，分別精密稱取 50 mg 置 20 ml 頂空瓶中，平行 9 份，分為 3 組，分別用 5 ml 線性溶液 L3、L4、L5 溶解，得到 70%、100%、130% 濃度水平準(zhǔn)確度考察溶液。

1.2.8 溶液穩(wěn)定性樣品制備 取人胰島素及其類(lèi)似物 100% 濃度水平準(zhǔn)確度考察溶液，于 0、2、24 h 進(jìn)行檢測(cè)，考察溶液穩(wěn)定性。

1.2.9 耐用性樣品制備 分別改變分流比（10:1）、流速（3.0 ml/min）、頂空加熱時(shí)間（15 min）、頂空加熱溫度（80 ℃）、氣相色譜柱[DB-624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.31 mm，1.8 μm）]，取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，考察方法耐用性。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性

如圖 1 所示，空白溶液對(duì)甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇檢測(cè)無(wú)影響，專(zhuān)屬性良好。5 種溶劑峰間分離度分別為 12.4、8.8、2.0、18.2，理論塔板數(shù)分別為 26416、30029、25005、35164、42914，分離度良好，柱效高。

2.2 線性

分別以甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性范圍、線性回歸方程見(jiàn)表 1，2均大于 0.99，線性良好。

2.3 精密度

取精密度考察溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 針，甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇峰面積 RSD% 分別為 0.7%、0.5%、1.1%、0.5%、0.9%，精密度良好。

圖1 空白溶液色譜圖（A）和混合對(duì)照品溶液色譜圖（B）

Figure 1 Chromatogram of blank solution (A) and mixed reference solution (B)

表1 5 種殘留溶劑線性關(guān)系結(jié)果

Table 1 Linear relationship results of 5 residual solvents

名稱 Name線性范圍（μg/ml） Linear range (μg/ml)線性回歸方程 Linear regression equation相關(guān)系數(shù)r2 Coefficient r2 甲醇 Methanol1.5 ～ 60.8y = 2.1286x + 0.24580.9998 乙醇 Ethanol1.1 ～ 98.9y = 4.384x – 0.10650.9997 異丙醇 Isopropanol0.8 ～ 100.4y = 8.9556x + 1.06850.9997 乙腈 Acetonitrile0.7 ～ 10.4y = 7.5009x + 0.40930.9985 正丙醇 N-propanol0.8 ～ 100.1y = 8.4692x – 1.07440.9997

2.4 檢測(cè)限與定量限

以信噪比 S/N = 3 時(shí)相應(yīng)的濃度確定檢測(cè)限，甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇檢測(cè)限分別為 0.6、0.3、0.2、0.2、0.2 μg/ml；以信噪比 S/N = 10 時(shí)相應(yīng)的濃度確定定量限，甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇檢測(cè)限分別為 1.5、1.1、0.8、0.7、0.8 μg/ml。

2.5 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度考察結(jié)果見(jiàn)表 2，人胰島素、門(mén)冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素、德谷胰島素樣品平均加標(biāo)回收率均在 90% ～ 110% 范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性

分別于 0、2、24 h 測(cè)定人胰島素、門(mén)冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素、德谷胰島素 100% 濃度水平準(zhǔn)確度考察溶液中各溶劑含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 3，甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇含量 RSD%（n = 3）均小于5.0%，溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 耐用性

在不同耐用性條件下分別采用外標(biāo)法測(cè)定混合對(duì)照品溶液中甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、正丙醇含量，測(cè)定結(jié)果如表 4 所示，含量 RSD% 均小于 5.0%，方法耐用性良好。

表2 人胰島素及其類(lèi)似物加標(biāo)回收率結(jié)果

Table 2 Results of spiked recovery of human insulin and its analogues

名稱Name殘留溶劑Residualsolvent濃度水平70%Concentration level 70%濃度水平100%Concentration level 100%濃度水平130%Concentration level 130%平均回收率（%）Averagerecoveries(%)RSD%（n = 9） 理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%) 人胰島素Humaninsulin甲醇Methanol20.421.5105.430.431.8104.640.441.3102.0103.12.0 20.7101.531.2102.642.5105.1 21.4104.930.299.341.5102.5 乙醇Ethanol33.132.999.349.449.6100.465.865.799.998.61.2 32.497.848.698.364.998.7 32.497.847.796.664.898.5 異丙醇Isopropanol33.632.997.750.248.496.566.865.698.296.31.4 32.897.548.095.662.793.9 32.396.047.795.064.296.1 乙腈Acetonitrile3.53.6103.75.25.3101.96.96.898.8100.72.4 3.5100.25.198.16.797.5 3.6104.65.3102.06.999.7 正丙醇N-propanol33.532.496.650.048.496.766.565.298.096.21.2 32.697.247.995.762.894.4 32.195.947.394.664.396.6 門(mén)冬胰島素Insulinaspart甲醇Methanol20.421.1103.430.430.5100.440.441.3102.2102.11.9 21.1103.729.898.042.1104.1 20.9102.430.9101.541.6102.8 乙醇Ethanol33.132.899.149.449.199.365.865.599.699.11.0 33.199.847.997.064.798.4 33.2100.349.299.465.399.3 異丙醇Isopropanol33.632.095.250.248.596.666.862.994.295.01.0 31.794.247.494.463.194.5 31.794.348.596.663.895.5 乙腈Acetonitrile3.53.497.75.25.2100.26.96.695.198.02.0 3.396.15.3101.06.796.9 3.498.25.197.56.999.3 正丙醇N-propanol33.531.995.050.048.196.066.562.594.094.90.8 31.694.347.194.262.894.4 31.694.348.095.963.595.5 賴脯胰島素Insulinlispro甲醇Methanol20.420.098.130.431.4103.240.440.299.4100.72.2 20.399.731.2102.640.299.4 20.7101.429.998.342.0103.9 乙醇Ethanol33.132.096.749.450.0101.165.864.397.999.71.8 33.5101.248.497.965.9100.2 32.196.949.5100.166.0100.4 異丙醇Isopropanol33.631.794.250.248.797.066.863.895.695.01.1 31.794.147.594.763.294.6 31.994.947.293.964.196.0 乙腈Acetonitrile3.53.497.65.25.197.16.96.695.698.22.2 3.6102.55.095.96.797.5 3.599.05.299.26.999.7 正丙醇N-propanol33.531.594.150.048.596.966.563.194.895.01.2 32.195.747.795.362.593.9 31.995.146.693.164.096.2

續(xù)表 2

名稱Name殘留溶劑Residualsolvent濃度水平70%Concentration level 70%濃度水平100%Concentration level 100%濃度水平130%Concentration level 130%平均回收率（%）Averagerecoveries(%)RSD%（n = 9） 理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理論值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)實(shí)測(cè)值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%) 甘精胰島素Insulinglargine甲醇Methanol20.420.9102.630.429.797.740.443.4107.3101.02.9 20.399.631.0101.840.499.9 20.7101.729.697.441.0101.3 乙醇Ethanol33.135.4107.049.448.497.965.869.0105.0102.72.9 34.0102.551.7104.566.2100.7 34.6104.448.999.067.8103.1 異丙醇Isopropanol33.632.396.050.246.893.266.866.098.895.62.5 31.192.447.795.065.698.3 31.994.946.893.365.698.2 乙腈Acetonitrile3.53.5101.05.25.095.96.96.9100.298.12.2 3.496.55.197.16.999.3 3.497.74.994.96.999.9 正丙醇N-propanol33.532.095.350.046.492.866.565.999.195.12.7 30.691.347.795.464.997.5 31.594.046.492.764.997.6 地特胰島素Insulindetemir甲醇Methanol20.421.1103.730.430.9101.640.442.0103.8103.51.3 21.2104.231.7104.141.0101.3 21.6105.831.3102.842.0103.8 乙醇Ethanol33.133.3100.549.449.199.265.867.7103.0100.41.5 33.2100.149.6100.365.098.9 34.0102.749.199.365.599.7 異丙醇Isopropanol33.632.295.850.247.494.466.865.698.296.01.3 32.195.548.195.864.396.3 32.997.847.794.963.995.7 乙腈Acetonitrile3.53.6102.55.25.299.86.96.897.8101.01.7 3.5101.55.3102.07.0101.2 3.6103.55.3100.96.999.5 正丙醇N-propanol33.532.095.450.047.294.366.565.798.796.31.7 32.797.448.096.063.795.8 33.198.847.394.563.695.5 德谷胰島素Insulindegludec甲醇Methanol20.420.4100.230.430.4100.040.440.299.499.91.9 19.696.230.399.840.098.9 20.098.331.4103.139.597.7 乙醇Ethanol33.132.197.049.447.796.465.863.897.198.12.1 31.494.749.099.164.698.3 33.6101.549.199.365.399.3 異丙醇Isopropanol33.631.493.250.246.592.666.862.393.294.02.3 31.593.745.590.564.796.9 31.693.847.594.565.397.7 乙腈Acetonitrile3.53.496.25.25.198.96.96.898.098.51.2 3.599.25.2100.56.898.6 3.497.65.299.36.898.1 正丙醇N-propanol33.531.794.550.047.394.666.562.193.394.61.4 31.894.746.292.364.296.5 31.794.447.695.164.096.2

表3 溶液穩(wěn)定性結(jié)果

Table 3 Solution stability results

名稱Name含量RSD%（n = 3） Content RSD% (n = 3) 甲醇 Methanol乙醇 Ethanol異丙醇 Isopropanol乙腈 Acetonitrile正丙醇 N-propanol 人胰島素 Human insulin3.32.71.53.43.2 門(mén)冬胰島素 Insulin aspart2.00.71.31.71.0 賴脯胰島素 Insulin lispro2.70.91.63.02.0 甘精胰島素 Insulin glargine1.22.52.72.72.4 地特胰島素 Insulin detemir2.52.93.60.73.8 德谷胰島素 Insulin degludec1.81.61.23.82.7

表4 耐用性結(jié)果

Table 4 Durability results

耐用性改變條件Durability change conditions實(shí)測(cè)值（μg/ml） Measured value (μg/ml) 甲醇Methanol乙醇Ethanol異丙醇Isopropanol乙腈Acetonitrile正丙醇N-propanol 原方法 Original method20.433.133.63.533.5 分流比10:1 Split ratio 10:121.934.733.43.534.2 流速3.0 ml/min Velocity of flow 3.0 ml/min20.633.634.43.834.3 頂空加熱時(shí)間15 min Headspace heating time 15 min20.633.033.53.532.7 頂空加熱溫度80 ℃ Headspace heating temperature 80 ℃20.534.034.83.634.9 氣相色譜柱[DB-624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.31 mm，1.8 μm）]Gas chromatography column [DB-624 capillary column (30 m × 0.31 mm, 1.8 μm)]20.632.933.63.433.6 RSD（%）2.72.01.73.72.2

3 討論

氣相色譜法是測(cè)定殘留溶劑的常用方法，氣相色譜程序主要有三種方法：直接進(jìn)樣法、頂空分析法和固相微萃取法[6]。本文根據(jù)人胰島素及其類(lèi)似物和各待測(cè)溶劑理化性質(zhì)，選擇頂空-氣相色譜法進(jìn)行分析研究，頂空法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、溶劑峰小、更潔凈等優(yōu)勢(shì)。本研究考察了人胰島素及其類(lèi)似物在0.01 mol/L 鹽酸溶液、1% 磷酸溶液、二甲基亞砜中的溶解性，結(jié)果顯示在0.01 mol/L 鹽酸溶液中溶解性好，氣液分配系數(shù)小，靈敏度高。采用混合對(duì)照品溶液考察頂空加熱時(shí)間、頂空加熱溫度，結(jié)果顯示溫度越高，溶劑峰面積越大，相同溫度加熱 15 ～ 35 min，溶劑峰面積基本一致，說(shuō)明加熱 15 min 時(shí)即達(dá)到氣液平衡。本研究還考察了不同氣相色譜柱、柱溫程序等條件，最終建立了專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確、靈敏度高的頂空-氣相色譜法。

有機(jī)溶劑殘留關(guān)乎制品質(zhì)量的安全性及可控性。近年來(lái)，人胰島素及其類(lèi)似物成為研發(fā)熱點(diǎn)，鑒于生產(chǎn)工藝中使用的有機(jī)溶劑種類(lèi)比較相近或相同，且制品理化性質(zhì)相近，建立通用型測(cè)定方法能夠同時(shí)應(yīng)用于 6 個(gè)胰島素品種的 5 種有機(jī)溶劑殘留測(cè)定，應(yīng)用范圍廣，能夠解決各企業(yè)測(cè)定方法各異、部分方法繁瑣等問(wèn)題。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》三部凡例規(guī)定，生產(chǎn)過(guò)程中如采用有機(jī)溶劑或其他物質(zhì)進(jìn)行提取、純化或滅活處理等，生產(chǎn)的后續(xù)工藝應(yīng)能有效去除。有機(jī)溶劑殘留量應(yīng)符合殘留溶劑測(cè)定法的相關(guān)規(guī)定（通則 0861）[7]。甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇限度分別為 0.3%、0.5%、0.5%、0.041%、0.5%，本文考察了各有機(jī)溶劑定量限至 200% 濃度水平線性范圍及70%、100%、130% 濃度水平加標(biāo)回收率，線性及準(zhǔn)確度良好，能夠用于人胰島素及其類(lèi)似物中甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和正丙醇?xì)埩羧軇┓治?，?duì)標(biāo)準(zhǔn)提高以及殘留溶劑分析方法的進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化提供了參考。

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Determination of residual solvents in human insulin and its analogues

SUN Yue, HU Xin-yue, DING Xiao-li, LI Jing, LYU Ping, ZHANG Hui, LIANG Cheng-gang

Author Affiliation: Division of Hormone, National Institutes for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drugs, Beijing 102629, China

To establish a method for the determination of organic solvent residues in human insulin and its analogues, and to determine the residual solvents of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol simultaneously.Headspace gas chromatography using DB-624 capillary column (30 m × 0.53 mm, 3 μm) with conditions as follows: ① the carrier gas is nitrogen; ② the flow rate is 2.5 ml/min; ③ the detector is a flame ionization detector; ④ the detector temperature is 250 ℃; ⑤ the injection port temperature is 200 ℃; ⑥ the split ratio is 5:1; ⑦ the headspace equilibrium temperature is 85 ℃; ⑧ the equilibrium time is 20 min. The column temperature program is as follows: ① the initial temperature is 40 ℃, and maintained for 10 min; ② it is raised to 80 ℃ at 5 ℃/min, and then it is raised to 200 ℃ at 20 ℃/min.The peaks of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol were well separated with good specificity, durability and precision. Methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol show a good linear relationship in the concentration range of 1.5 - 60.8, 1.1 - 98.9,0.8 - 100.4,0.7 - 10.4, and 0.8 - 100.1 μg/ml,respectively (2> 0.99). The detection limits of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol were 0.6, 0.3, 0.2, 0.2, 0.2 μg/ml, respectively. The limits of quantification were 1.5, 1.1, 0.8, 0.7, 0.8 μg/ml, respectively. The average recoveries (n = 9) of all solvents in human insulin and its analogues were in the range of 90% - 110%, and the accuracy was good.The method is operable, accurate and sensitive, and is suitable for the determination of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol in human insulin and its analogues.

human insulin and its analogues; headspace gas chromatography; residual solvent; method validation

s: LIANG Cheng-gang, Email: liangchenggang@nifdc.org.cn; ZHANG Hui, Email: zhanghui313@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.03.003

梁成罡，Email：liangchenggang@nifdc.org.cn；張慧，Email：zhanghui313@sina.com

2023-02-10