康柱，閆煥，周素珍,2,3，范金波,2,3

（1.渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州121013；3.生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

殼聚糖（Chitosan，CS）作為天然生物大分子多糖，因具有特殊的氨基結構，故性質穩(wěn)定[1]。CS 可作為食品保鮮劑應用在果蔬保鮮、肉制品保鮮以及水產保鮮[2-5]；作為食品添加劑起到增稠、澄清的作用[6-7]，還具有調節(jié)機體免疫力，改善胃腸道等功能[8-9]；除此之外，在食品包裝上也有所應用[10-11]。因此，CS在食品領域的研究與開發(fā)具有廣闊的前景。

酪蛋白（Casein，CA）是牛乳中含量最豐富的蛋白質[12]，其含有多種必需氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值[13]。因其具有良好的乳化性、保水性、溶解性和發(fā)泡性，已被成熟應用于肉制品、烘焙食品、人造奶油、干酪、飲料等食品的加工中[14]。除此之外，還可用作蛋白基載體來運輸藥物或多酚、黃酮類生物活性小分子[15]。

食品中添加多糖較為常見，多糖的添加不僅可以改善食品品質、風味，還可以延緩食品變質，延長貨架期[16-19]。乳制品貨架期一直是消費者關注的焦點，徐佳等[20]研究表明在乳飲料中添加少量黃原膠、β–葡聚糖等，可改善產品口感和外觀，增強穩(wěn)定性，延長貨架期。Zielinska 等[21]研究表明將低聚果糖添加在發(fā)酵乳制品中，可提高該產品的感官黏度和質量，從而延長貯藏期。目前，在乳制品中多糖的應用較為廣泛，但對研究CA–多糖相互作用機制及機理的報道較為少見，且CA–多糖的相互作用易受到pH、離子強度、電荷密度等因素影響[17]。因此，本文選用牛乳中含量最高的CA 與在食品領域應用廣泛的CS 為研究對象，在3 種不同pH 值（7.4、5.2、3.0）條件下，探究CS 與CA 的結合作用，以及對CA 結構的影響，這對乳制品的貯藏和開發(fā)研究具有重要意義。

1 實驗

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑：酪蛋白（98 %），北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖（分子質量≈30 000 u，純度≥95%），酷爾化學科技（北京）有限公司；其他實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

主要儀器與設備：F–7000 熒光分光光度計，日本日立高新技術公司；IRTracer–100 傅里葉變換紅外光譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；PHS–25 pH計，儀電科學儀器（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儲備液的配制

稱取一定量的酪蛋白和殼聚糖，配制2 mg/mL 的CA 儲備液和8 mg/mL 的CS 儲備液（溶于體積分數(shù)為1%的乙酸溶液），配制濃度為0.2 mol/L 的磷酸緩沖液。

1.3.2 熒光光譜

1.3.2.1 熒光光譜測定

向離心管中加入一定量的PBS 緩沖液，再加入30 μL CA 溶液，最后加入CS 溶液，使之充分反應30 min。最終離心管中體系的總體積為3 mL，CA 的質量濃度為0.02 mg/mL，CA 與CS 濃度比為1 ∶0、1 ∶9、1 ∶18 、1 ∶27 、1 ∶36 、1 ∶45 （6 個不同濃度比在圖中分別以1—6 表示）。在298 K 和310 K 溫度下，設置激發(fā)波長為280 nm，狹縫寬度為5.0 nm，掃描范圍為290～500 nm 內的熒光發(fā)射光譜[22]，并在3 種不同pH 值（7.4、5.2、3.0）條件下進行測量。

1.3.2.2 熒光猝滅機理和結合常數(shù)計算

本實驗采用Stern–Volmer 方程（1）和Hill 方程（2）分析熒光猝滅機理[23]。

式中：F0和F為未加入和加入CS 時CS 的熒光強度峰值；[Q]為CS 在體系中濃度；τ0為熒光團的平均壽命（10?8s）；Ksv為猝滅常數(shù)；Kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；Ka為表觀結合常數(shù)。

1.3.2.3 熱力學性質分析

通過Van't Hoff 方程（3）和熱力學方程（4）計算相關參數(shù)，分析其作用力類型[24]。

式中：R為氣體常數(shù)，R=8.314 J/(mol·K)；K1和K2為對應T1、T2的表觀結合常數(shù)；ΔG為結合反應的吉布斯自由能變化；ΔS為熵變。

1.3.3 同步熒光光譜測定

樣品配制方法同1.3.2.1 節(jié)，參考郝明皓[25]方法并做修改，在298 K 溫度下，設置激發(fā)波長和發(fā)射波長間隔Δλ=60 nm 和Δλ=15 nm，測定樣品在250～350 nm范圍內同步熒光光譜。分別在3 種不同pH（7.4、5.2、3.0）條件下進行測量。

1.3.4 三維熒光光譜測定

固定CA 質量濃度為0.02 mg/mL，CS 質量濃度為0.36 mg/mL，設定激發(fā)波長為200～350 nm，發(fā)射波長為200～450 nm，在298 K 溫度下，進行三維熒光光譜的測定[25]。分別在3 種不同pH（7.4、5.2、3.0）條件下進行測量。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測定

樣品溶液配制方法同1.3.2 節(jié)，參考張超等[26]的方法，將反應完全的樣品通過真空冷凍干燥制成粉末狀固體，分別稱取待測樣品和KBr，使待測樣品和KBr 質量比約為1 ∶100，混合均勻并進行充分研磨，制成待測薄片；放入傅里葉變換紅外光譜儀中，設置掃描范圍為400～4 000 cm?1，進行光譜掃描并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3 次，實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差；實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21 軟件進行處理，使用Origin 2022 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

如圖1 所示，在不同條件下，CS 對CA 均產生熒光猝滅效應，且在340 nm 附近出現(xiàn)熒光最大吸收峰。在298 K 時，3 種pH 條件下，CA 的熒光強度峰值分別降低了57.5%、61.9%和58.1%；當pH=7.4時，最大發(fā)射波長（λmax）發(fā)生微弱的紅移；pH=5.2時，λmax紅移6 nm（335～341）；pH=3.0 時，λmax發(fā)生紅移4 nm（336～340）。在310 K 時，CA 的熒光強度峰值分別降低了59%、61.7%和59.7%，且均發(fā)生紅移；在相同pH 條件下，與298 K 相比較，λmax也發(fā)生輕微的變化。這說明pH 的變化，使二者相互作用的微環(huán)境發(fā)生改變，同時溫度也改變了二者發(fā)生反應的微環(huán)境。由圖1g、h 可知，隨著CS 濃度的逐漸升高，猝滅率也隨之增大，且pH=5.2 時猝滅率最高。

圖1 pH 對CS 與CA 相互作用影響的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra for the effect of pH on the interaction between chitosan on casein

2.2 熒光猝滅機理和結合常數(shù)

本文通過分析熒光猝滅機理，探究CS 與CA 之間的相互作用。熒光猝滅類型包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，2 種方式均可以降低CA 的熒光強度[27-28]。本文采用方程（1）和方程（2）計算，并分析CS 與CA相互作用的熒光猝滅機理[29]。

由表1 可知，在同一pH 值條件下，在CA 中加入CS，Ksv與溫度呈現(xiàn)負相關關系，但Kq均大于最大散射碰撞猝滅常數(shù)（2×1010M?1·s?1），說明CS 對CA 產生靜態(tài)猝滅，且二者結合形成新的復合物。在pH=5.2 時，猝滅常數(shù)Ksv最大，與圖1g、h 的結果一致。由Hill 方程計算出來的結合常數(shù)Ka都在103數(shù)量級，說明CS 與CA 的結合能力較強。在不同pH條件下，n均在1 左右，這表明CA 結構中至少有一個結合位點與CS 相結合[30]，與前人的研究結果相一致[26]。R2的值越接近于1，說明數(shù)據(jù)越精確。

表1 CS 與 CA 相互作用的常數(shù)Tab.1 Constants for the interaction between chitosan and casein

2.3 熱力學性質分析和作用力類型

當生物大分子與小分子相互作用時，主要通過氫鍵、范德華力、靜電相互作用等作用力相連接[31-32]。本文通過Van't Hoff 方程（3）和熱力學方程（4）來分析其反應的熱力學性質和作用力類型[33-34]。

由表2、3 可知，ΔG<0，ΔS>0 說明CS 與CA 結合均為熵增加的自發(fā)反應。當pH=7.4 和pH=3.0 時，ΔH<0，說明在這2 個pH 條件下，該反應為放熱反應，與表1 中隨著溫度升高Ka減小相呼應。由此可推斷在此pH 條件下，靜電相互作用為主要驅動力；在pH=5.2 時，ΔH>0，二者反應為吸熱反應，可推斷出二者通過疏水相互作用結合，與前人結果相一致[26]。在pH=5.2 時，熱力學常數(shù)的方向發(fā)生變化，且pH=5.2更接近于CA 的等電點。由此可推斷pH 值的變化影響了CA 與CS 結合的微環(huán)境。

表2 CS 與CA 相互作用的熱力學參數(shù)Tab.2 Thermodynamic constants for interaction between chitosan and casein

表3 熱力學常數(shù)與相互作用力的關系Tab.3 Relationship between thermodynamic constants and interaction forces

2.4 同步熒光光譜的分析

同步熒光光譜通過對熒光團氨基酸殘基——酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）的微環(huán)境變化進行分析，判斷蛋白質構象是否發(fā)生改變[35]。在同步熒光光譜中，Tyr 的微環(huán)境變化在Δλ=15 nm 處，Trp 的微環(huán)境變化在Δλ=60 nm 處[36]。本文通過同步熒光光譜中λmax的偏移情況，判斷CA 構象是否發(fā)生改變。

如圖2 所示，在pH=7.4 時，Tyr 和Trp 殘基的λmax均發(fā)生輕微紅移，說明對應氨基酸殘基附近暴露的微環(huán)境的親水性增強；當pH=5.2 時，λmax未發(fā)生明顯變化；當pH=3.0 時，Trp 殘基的λmax紅移4 nm，這反映出Trp殘基附近的微環(huán)境極性增強，更容易在環(huán)境中暴露；而Tyr 殘基的λmax沒有發(fā)生偏移。以上結果可推測出CS的存在和pH 值共同使CA 的構象發(fā)生了變化。

圖2 溫度為298 K 時，CS 與CA 相互作用的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

2.5 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜與熒光發(fā)射光譜相比，對CA 的熒光強度和峰的信息展示更全面、更直觀。其中峰a 表示Trp 殘基的光譜特征峰，峰b 反映的是CA 多肽骨架光譜變化[37]。

由圖3 可觀察出，當CS 加入后，峰a 和峰b 的熒光強度都發(fā)生了不同程度的降低。由表4 可知，加入CS 后，當pH=7.4 時，Trp 殘基的光譜特征峰a 的λmax藍移6 nm，熒光強度降低4.54%，峰b 的λmax紅移3 nm，熒光強度降低了12.98%；當pH=5.2 時，峰a 的λmax藍移5 nm，峰b 的λmax紅移2 nm，熒光強度分別降低了17.72%和40.20%；當pH=3.0 時，峰a的λmax藍移4 nm，峰b 的λmax紅移4 nm，熒光強度分別降低6.75%和29.05%。pH=5.2 時猝滅效果最強，與前文發(fā)射熒光光譜中的結果相一致。以上結果表明在不同pH 條件下，與CA 三維熒光光譜相比，加入后CS，峰a 均發(fā)生明顯藍移，蛋白熒光基團殘基微環(huán)境的非極性增強，且峰b 均發(fā)生不同程度紅移，反映出蛋白熒光基團殘基的微環(huán)境的親水性增強。由此可推測，CS 的加入和pH 值的影響，使得CA 的構象發(fā)生改變。

表4 CA 和CA–CS 的三維熒光特征參數(shù)Tab.4 Three-dimensional fluorescence characteristic parameters of casein and casein-chitosan

圖3 溫度為298 K 時，CS 與CA 相互作用的三維熒光光譜Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜可用來進一步研究蛋白質二級結構的變化。通常根據(jù)光譜中酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm?1）和酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm?1）的偏振情況，分析出蛋白質結構的變化，從而進一步說明蛋白質與配體發(fā)生了相互作用[38]。也可通過光譜中的酰胺A 帶（3 400～3 300 cm?1）的改變來輔助說明[39]。

由圖4 可知，CA 在酰胺Ⅰ帶和酰胺A 帶有較明顯的特征吸收峰。在pH=7.4 的條件下，CA 與CS 發(fā)生作用后，酰胺Ⅰ帶的峰位從1 688.94 cm–1偏移到1 653.49 cm–1；同時酰胺A 帶的峰位從3 445.72 cm–1偏移到3 433.98 cm–1。pH=5.2 時，與pH=7.4 時相比，酰胺Ⅰ帶的峰位從1 653.49 cm–1偏移到1 638.31 cm–1，且酰胺A 帶也發(fā)生了偏移；當pH=3.0 時，酰胺Ⅰ帶的峰位發(fā)生偏移，酰胺A 帶未發(fā)生偏移。以上結果表明CA 的結構在與CS 結合后發(fā)生了變化，同時pH 值的變化也會影響CA 與CS 結合后的構象。

圖4 溫度為298 K 時，CS 與CA 相互作用的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

3 結語

本文通過熒光光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法以及傅里葉變換紅外光譜法探究CA 與CS的相互作用，以及CS 的加入對CA 產生的影響。研究結果表明，在3 種pH 條件下，CS 的加入，使CA產生熒光猝滅現(xiàn)象。通過對熒光猝滅機理和熱力學分析可知，該猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅，二者通過靜電相互作用結合。在pH=5.2 時，猝滅效果最為明顯，這可能與CA 的等電點有關。同步熒光光譜和三維熒光光譜表明，CS 的加入和pH 值的影響改變了CA 的空間構象；傅里葉變換紅外光譜中酰胺Ⅰ帶和酰胺A 帶的偏振情況表明CA 的結構發(fā)生了變化。實驗結果表明，CS 的加入使得CA 的結構發(fā)生變化，同時，pH值的變化也影響到了二者的結合。這將為蛋白質–多糖的相互作用提供實驗依據(jù)，對乳制品的貯藏及開發(fā)具有重要意義。