劉娟 郭華 孫敏 付萍

[摘要]目的：通過蛋白芯片技術(shù)篩選血清中的2個(gè)結(jié)果蛋白做免疫組化（Immunohistocry，IH）研究，檢測(cè)其在干燥綜合征（Sj?grens syndrome，SS）患者唇腺組織、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者皮損及狼瘡性腎炎（Lupus nephritis，LN）患者腎臟組織中的表達(dá)情況。方法：收集2004年1月-2013年12月就診于風(fēng)濕免疫科患者的組織蠟塊43例，按照不同疾病、不同部位將組織蠟塊分為SS組16例、非SS對(duì)照組10例、SLE皮損組9例、LN組8例。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)骨橋蛋白和鐵調(diào)素在SS患者、SLE患者皮損和LN患者腎臟組織中的表達(dá)。使用Fromowitz的綜合計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果判定。陽(yáng)性率的比較采用四格表確切概率法。結(jié)果：骨橋蛋白和鐵調(diào)素在SS唇腺組織的表達(dá)均高于非SS唇腺組織，兩種蛋白在SLE皮損中未液化的少量基底層細(xì)胞中見陽(yáng)性表達(dá)、狼瘡腎組織中腎小管上皮細(xì)胞見陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論：骨橋蛋白與鐵調(diào)素可在干燥綜合征患者唇腺組織、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者皮損及狼瘡性腎炎患者的腎小管中表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]干燥綜合征；免疫組化；骨橋蛋白；鐵調(diào)素；系統(tǒng)性紅斑狼瘡

[中圖分類號(hào)]R365? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）05-0096-04

The Expression Both of Osteopontin and Hepcidin in the Tissue of Sj?grens Syndrome and Systemic Lupus Erythematosus Patients

LIU Juan1，GUO Hua1，SUN Min1，F(xiàn)U Ping2

（1.Department of Dermatology，Huishan People's Hospital of Wuxi，Wuxi 214187，Jiangsu，China; 2.Department of Rheumatology and Immunology，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective? The immunohistochemical method was applied to text two proteins screened through SELDI-TOF-MS from serum. To test the expression in the labial gland tissue of SS patients，the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients. Methods? Collection forty-three tissue wax blocks from the patients who treated in the department of rheumatology and immunology during January 2004 to December 2013. The tissue wax blocks were divided into SS group（n=16）， non-SS control group（n=10）， SLE skin lesion group（n=9）and LN group（n=8） accord different disease and different position.Used the immunohistochemical staining to test the expression in the labial gland tissue of SS patients， the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients.Used the Fromowitz comprehensive scoring method to assess the results. The comparison of two kinds of protein staining positive rate used the four table exact probability. Results? Osteopontin and hepcidin in the expression of SS labial gland tissue were higher than non-SS labial gland tissue， was detected in the lesions of SLE did see positive expression in a small amount of liquid base layer cells， lupus kidney tissues in renal tubular did see positive expression. Conclusion? Osteopontin and hepcidin were expressed in labial gland tissue of SS， skin lesion of SLE and lupus kidney patientsrenal tubules of LN.

Key words： sj?grens syndrome; immunohistochemical; osteopontin; hepcidin; systemic lupus erythematosus

SS是一種以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)累及全身外分泌腺，主要侵犯淚腺和唾液腺為主的彌漫性慢性自身免疫性疾病。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是具有多種功能的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，OPN可表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DC、T、B淋巴細(xì)胞等作為一種前炎性細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)[1]。OPN與SLE相關(guān)研究已有報(bào)道，但與SS相關(guān)研究報(bào)道較少；鐵調(diào)素（Hepcidin，Hepc）是鐵代謝的主要調(diào)節(jié)激素，目前OPN和Hepc在干燥綜合征的研究中報(bào)道較為罕見。本研究通過蛋白芯片技術(shù)篩選血清中的2個(gè)結(jié)果蛋白進(jìn)一步做唇腺組織免疫組化研究，檢測(cè)其在SS患者唇腺組織、SLE患者皮損及LN患者腎臟組織中的表達(dá)情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：收集2004年1月-2013年12月就診于昆醫(yī)附二院滿足2002年國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)確診為干燥綜合征16例患者的唇腺蠟塊作為SS組，男1例，女15例，年齡20～72歲，平均年齡（46.94±13.57）歲；收集2004年1月-2013年12月就診于昆醫(yī)附二院患者做唇腺活檢為正常唇腺組織的唇腺蠟塊，即不符合SS診斷標(biāo)準(zhǔn)的唇腺組織蠟塊10例，作為非SS對(duì)照組，男3例，女7例，年齡44～68歲，平均年齡（57.78±8.35）歲，兩組患者在年齡、性別上對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；收集滿足2009年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的皮損蠟塊9例，作為SLE皮損組：男1例，女8例，年齡12～59歲，平均年齡（35.44±15.85）歲；狼瘡性腎炎腎臟組織蠟塊8例作為L(zhǎng)N組：男3例，女5例，年齡16～45歲，平均年齡（26.0±9.34）歲，兩組患者在年齡、性別上對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試驗(yàn)試劑：一抗為兔抗骨橋蛋白抗體（BYK-0019R）和兔抗鐵調(diào)素抗體（BYK-8870R），均采購(gòu)于上海博研生物有限公司（Abcam）；二步法抗為兔鼠通用型免疫組化試劑盒（GK500710，Gene Tech）。

1.3 方法：骨橋蛋白、鐵調(diào)素免疫組織化學(xué)染色采用Envision二步法。以PBS液代替一抗的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果為陰性對(duì)照；以唇腺腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和腎小管細(xì)胞胞漿著色作為OPN與Hepc的判斷依據(jù)；結(jié)果評(píng)估參照Fromowitz的綜合計(jì)分法進(jìn)行，進(jìn)行雙盲半定量分析。以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)著色或與背景顏色一致為陰性細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率及計(jì)分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率1%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50％為3分；根據(jù)多數(shù)細(xì)胞的著色強(qiáng)度計(jì)算強(qiáng)度得分，無(wú)著色為0分，淺棕褐色為1分，棕褐色為2分，深棕褐色為3分；陽(yáng)性率和強(qiáng)度計(jì)分相加后的結(jié)果：0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。樣本OPN表達(dá)陽(yáng)性率的比較采用Fisher確切概率法。

2? 結(jié)果

2.1 SS組、非SS組唇腺組織中OPN的免疫組化染色結(jié)果：SS組骨OPN免疫組化的組織切片可見在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞（主要為導(dǎo)管上皮細(xì)胞）的胞漿中有棕黃色顆粒即呈陽(yáng)性表達(dá)，少量基底層細(xì)胞也存在陽(yáng)性表達(dá)；非SS組在部分導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞上皮細(xì)胞胞漿中可見淡黃色顆粒；SS唇腺的陰性對(duì)照片無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。見圖1。

2.2 SS組、非SS組唇腺組織中Hepc的免疫組化染色結(jié)果：SS組Hepc免疫組化的組織切片可見在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞（主要為導(dǎo)管上皮細(xì)胞）胞漿中有棕黃色顆粒即呈陽(yáng)性表達(dá)，少量基底層細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá)；非SS組在部分導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞上皮細(xì)胞胞漿中可見淡黃色顆粒；SS唇腺的陰性對(duì)照片無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。見圖2。

2.3 OPN和Hepc在SS組唇腺組織陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)分析：SS組唇腺組織中OPN的陽(yáng)性率為87.5%（14/16），Hepc的陽(yáng)性率為81.3%（13/16），OPN和Hepc的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在非SS組中OPN和Hepc的陽(yáng)性率均為30.0%（3/10）。OPN在SS組陽(yáng)性率高于非SS組中（P＜0.05），Hepc在SS組陽(yáng)性率高于非SS組（P＜0.05）。16例SS中有12例共同表達(dá)OPN和Hepc。見表1。

2.4 SLE皮損中OPN和Hepc的免疫組化染色結(jié)果：OPN和Hepc在SLE皮損未液化的少量基底細(xì)胞中均可見陽(yáng)性表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞未見陽(yáng)性表達(dá)。見圖3。

2.5 LN組腎臟組織中OPN和Hepc的免疫組化染色結(jié)果：OPN和Hepc在LN狼瘡腎臟組織的大量腎小管上皮細(xì)胞中均可見陽(yáng)性表達(dá)，腎小球中無(wú)表達(dá)。見圖4。

2.6 OPN和Hepc在LN組腎臟組織陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)分析：LN組腎臟組織中OPN的陽(yáng)性率為62.5%，Hep的陽(yáng)性率為75.0%，OPN和Hepc的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。8例SS中有5例共同表達(dá)OPN和Hepc。見表2。

2.7 在OPN及Hepc兩組蛋白的LN組腎臟組織每張切片中各選5張400×的視野圖，算出100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并算出均值，對(duì)兩組進(jìn)行相關(guān)性分析，從輸出的散點(diǎn)圖可看出兩個(gè)變量有線性趨勢(shì)，其線性回歸方程為y=0.995x+1.776，可認(rèn)為OPN在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)量與Hepc在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)量呈正相關(guān)。見圖5。

3? 討論

干燥綜合征是以淋巴細(xì)胞對(duì)外分泌腺浸潤(rùn)為特征的自身免疫性疾病，主要產(chǎn)生IFN-γ的Th1細(xì)胞在SS患者的唇腺組織被發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞刺激T、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，引起腺體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙。

OPN是一種具有多種功能的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，分布于多種組織，也可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、DC和淋巴細(xì)胞中，在免疫系統(tǒng)的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。此前研究表明，應(yīng)用SELDI檢測(cè)干燥綜合征患者的特異性差異蛋白中有骨橋蛋白[3]。王玉華[4]發(fā)現(xiàn)SS患者唇腺組織及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞胞漿中OPN的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平顯著增高，吳國(guó)琳發(fā)現(xiàn)干燥綜合征患者血清和唾液腺組織OPN表達(dá)增加[5]，本研究結(jié)果顯示OPN在腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞均有表達(dá)，提示OPN參與了SS的發(fā)病過程，但其機(jī)制不清。分析原因可能為，OPN在炎性刺激物的誘導(dǎo)下使Th細(xì)胞向Th1、Th2或Th17細(xì)胞偏移，同時(shí)OPN也是多克隆B細(xì)胞活化因可刺激巨噬細(xì)胞增殖活化，誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的分泌，引起組織損傷[6]，而B細(xì)胞是SS發(fā)病必不可少的因素，OPN可能通過多種方式誘發(fā)或加重了SS。

在米向斌[7]的研究中，活動(dòng)期SLE患者血清中OPN水平明顯增高，SLEDAI（SLE疾病活動(dòng)指數(shù)）與血清OPN水平呈明顯正相關(guān)；但是非活動(dòng)期SLE患者和健康對(duì)照組血清OPN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且，血清OPN水平與IL-17水平呈明顯正相關(guān)。另一研究顯示SLE患者血漿中OPN水平較正常健康人群顯著增高，且處于活動(dòng)期的SLE患者血漿OPN水平顯著高于穩(wěn)定期[8]。本實(shí)驗(yàn)中OPN在SLE皮損未液化的少量基底細(xì)胞中可見陽(yáng)性表達(dá)。目前在基因?qū)用鍷aleta等[9]的研究表明，OPN_rs1126616 的雜合或純合突變（707C/T）的個(gè)體具有更高的SLE易感性。國(guó)內(nèi)研究表明，OPN基因的rs1126772、rs11728697和rs4754位點(diǎn)SLE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)[10]。SLE患者OPN基因rs9138和rsl1730582位點(diǎn)與SLE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)[11]。這些結(jié)果說明OPN的產(chǎn)生和SLE的炎性損傷和疾病進(jìn)展密切相關(guān)其具體發(fā)病機(jī)制及致病基因位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

有實(shí)驗(yàn)研究在MRL/1pr小鼠狼瘡腎炎的進(jìn)展中顯示，OPN可通過激活巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞起重要作用，OPN在腎小管的表達(dá)可能提示狼瘡性腎炎患者預(yù)后不良[12]。研究證實(shí)[5]OPN在LN腎小管的表達(dá)水平與正常腎組織相比有明顯增高，尤以IV型LN為甚，其表達(dá)量與腎臟病理活動(dòng)指數(shù)、腎損害臨床指標(biāo)及疾病活動(dòng)度相一致。LN活動(dòng)期患者血清中OPN水平高于緩解期[13]。OPN誘導(dǎo)的自身炎癥反應(yīng)間接促進(jìn)補(bǔ)體C3的消耗，C3主要沉積于腎小球基底膜，參與腎小球的損害，從而導(dǎo)致OPN間接參與腎小球的損害[14]。本研究顯示OPN僅在在LN患者的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)而在腎小球不表達(dá)，提示OPN可能不是LN發(fā)病的主要參與者，而是間接參與腎小球的損害，與上述研究一致。

鐵調(diào)素是一種主要從肝臟合成的小肽，在腦、心臟、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞也有少量的表達(dá)，經(jīng)過剪切修飾等改變后具有25個(gè)氨基酸且存在生物活性。Hepc是一種II型急性期蛋白，與炎癥、貧血和鐵代謝的調(diào)節(jié)具有相關(guān)性[15]。在RA患者中由于IL-6的刺激和誘導(dǎo)作用，BMP-6及Hepc失去了對(duì)貧血和鐵代謝的正常感應(yīng)及調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致鐵代謝紊亂及單純性慢性病性貧血的發(fā)生[16]。在SLE患者中IL-6可通過STAT3途徑和 HJV-BMP/SMAD信號(hào)通路調(diào)節(jié)Hepc的表達(dá)。有研究通過檢測(cè)92例狼瘡女患者的血清Hepc，得出血清Hepc與狼瘡活動(dòng)相關(guān)，可作為監(jiān)測(cè)狼瘡活動(dòng)的指標(biāo)[17]。尿液Hepc在LN患者組中的表達(dá)水平明顯高于SLE無(wú)腎炎組和健康對(duì)照組；尿液Hepc在活動(dòng)期LN患者組中表達(dá)水平顯著高于靜止期LN組，表明LN患者的尿液Hepc與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示Hepc在SS組和非SS組均有導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞不同程度的表達(dá)，但與腎臟損傷沒有明確的相關(guān)性，推測(cè)Hepc可能不是SS發(fā)病的驅(qū)動(dòng)因素，可能是繼發(fā)于損傷、感染和炎癥刺激等引起Hepc基因的強(qiáng)烈表達(dá)的結(jié)果，這一假設(shè)有待今后繼續(xù)研究。SLE患者血清Hepc與狼瘡活動(dòng)相關(guān)。尿液中Hepc在SLE腎臟受累的患者中表達(dá)水平升高，與本實(shí)驗(yàn)Hepc在SLE皮損未液化的少量基底細(xì)胞可見陽(yáng)性表達(dá)；Hepc在LN狼瘡腎臟組織的大量腎小管上皮細(xì)胞中可見陽(yáng)性表達(dá)，提示Hepc可能是一種新的反映LN活動(dòng)性的指標(biāo)。

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[收稿日期]2021-12-27

本文引用格式：劉娟，郭華，孫敏，等.骨橋蛋白和鐵調(diào)素在干燥綜合征及狼瘡患者組織中的表達(dá)[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（5）：96-99.