張悅 王征

創(chuàng)傷、手術(shù)和癌癥等原因造成的骨缺損一直是困擾骨科醫(yī)生的臨床問題。對于小的骨缺損，人體的骨組織可以再生修復(fù)[1]，但是在臨界性骨缺損甚至更大范圍骨缺損的情況下，必須使用天然骨移植物或合成材料來修復(fù)缺損，才能實現(xiàn)骨再生。天然骨移植包括自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植，但因受到來源不足、術(shù)后并發(fā)癥、免疫排斥反應(yīng)及存在共患病可能等原因使得天然骨在臨床中應(yīng)用較少[2-3]。不同于天然骨來源受限，骨修復(fù)的合成材料來源廣泛，并且可以通過調(diào)控材料的特性參數(shù)使其更接近自然骨，以此大大降低疾病傳播風(fēng)險和免疫原性[4-6]。因此，在臨床上針對去骨瓣減壓術(shù)造成的顱骨臨界骨缺損的修復(fù)主要是利用仿生支架[7]。

由有序排列的Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石組成的礦化膠原（mineralized collagen，MC），采用獨特的體外仿生礦化技術(shù)，通過納米鈣磷鹽和膠原分子組裝而成，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)與人體天然松質(zhì)骨相似[8]。研究證實，礦化膠原人工骨修復(fù)材料不但具有優(yōu)秀的誘導(dǎo)成骨活性，而且在體內(nèi)最終能夠完全降解吸收，是一種理想的骨修復(fù)材料[9-10]。

為了將MC 固定于骨缺損位置并持續(xù)停留一段時間，筆者選擇了具有良好生物相容性和可降解性的海藻酸鈉（Alginate，ALG）作為載體，通過局部生理濃度的Ca2+使ALG形成固態(tài)凝膠[11]。本實驗將MC與ALG按特定比例混合后制備的MCA 膠體懸浮液填充到臨界性骨缺損部位，以達到骨修復(fù)的目的。

1 材料與方法

1.1 主要動物、試劑與儀器

實驗動物：15只成年雄性SD大鼠，體重280 ～ 300 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，所有實驗均經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（許可證號SQ 2022541）。

主要試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；海藻酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Ⅰ型膠原（河北考力森生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素（博奧拓達科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；氯化鈣（CaCl2·5H2O）、磷酸（H3PO4）、乙酸（CH3COOH）（國藥集團股份有限公司）。

主要儀器：掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；投射電子顯微鏡（日本電子公司）；磁力攪拌器（上海思樂儀器有限公司）；冷凍干燥箱（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；高速離心機（臺灣益弘儀器股份有限公司）；高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Micro-CT（美國GE 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 MCA水凝膠制備方法

1.2.1 MC制備

將0.6 gⅠ型膠原海綿裁剪成小塊，加入至1 L 冰醋酸溶液（0.5 mol/L）中。室溫下使用磁力攪拌將所得混合物充分混合10 h以上，避光。隨后加入120 mL氯化鈣水溶液（0.5 mol/L），避光持續(xù)攪拌1 ～ 2 h。再加入72 mL磷酸水溶液（0.5 mol/L），繼續(xù)攪拌1 ～ 2 h。用0.5 mol/L 濃度的氫氧化鈉溶液將混合體系pH調(diào)至10，攪拌10 h。將體系溶液移到離心管中，離心速度在8 000 ～ 12 000轉(zhuǎn)/分鐘，測量離心后上清液pH，并加入與上清液等體積的超純水，充分?jǐn)嚢韬笤俅坞x心，重復(fù)多次直至上清液pH為7左右。使用凍干機冷凍干燥48 h去除殘留水分，使用瑪瑙研磨缽研磨30 min[8,12]。

1.2.2 MCA制備

將15 mg ALG混入1 mL超純水中，然后磁力攪拌10 min以形成稠密的混合物。隨后將200 mg的MC粉末加入ALG溶液中，持續(xù)磁力攪拌30 min。用于體外實驗時使用1.8 mM的CaCl2溶液進行交聯(lián)反應(yīng)，形成固態(tài)凝膠，用于體內(nèi)實驗時利用局部體液中的Ca2+進行交聯(lián)[13]。

1.3 掃描電子顯微鏡和投射電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡（SEM）和投射電子顯微鏡（TEM）觀察海藻酸鈉水凝膠和MCA的形貌，利用安裝在SEM和TEM上的EDS裝置進行元素分析。

將制備的MC沉淀物滴在銅網(wǎng)上，干燥處理后TEM觀察。海藻酸鈉水凝膠和MCA經(jīng)Ca2+溶液交聯(lián)后用超純水清洗（洗滌3 次，每次5 min），隨后進行脫水干燥處理用于SEM觀察交聯(lián)狀態(tài)和元素分析。

1.4 細胞增殖實驗

MCA 浸提液按照GB/T 16886.12-2000 要求，以0、100、200 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)將鈷-60滅菌后的MCA放入無血清細胞培養(yǎng)基中，在37℃細胞培養(yǎng)箱中放置48 h 后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心收集浸提液。然后，將L929 細胞接種于96 孔板（～5 000 細胞/孔），在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h后，用MCA浸提液代替培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。最后將浸提液吸出，用無菌PBS 洗滌2 次后加入含10%CCK-8 的培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下測定吸光度。

1.5 MCA體內(nèi)降解實驗

為了評估MCA 的體內(nèi)生物安全性及降解性，將MCA溶液注射到小鼠右側(cè)腹部皮下，利用局部生理Ca2+誘導(dǎo)交聯(lián)反應(yīng)，進而在原位形成水凝膠植入物。注射第3、7、60 d時將注射MCA 水凝膠部位的皮膚及皮下殘留的植入物一同取下，用4%多聚甲醛固定24 h。梯度脫水后將樣品包埋于石蠟中，切片后采用HE染色進行觀察。

1.6 MCA水凝膠在大鼠顱骨缺損模型中的修復(fù)作用

將15 只大鼠標(biāo)號后采用簡單隨機方法分成3 個實驗組，對照組、ALG 水凝膠組和MCA 水凝膠組，每組5 只。大鼠在進行顱骨缺損造模前，在手術(shù)室適應(yīng)1 周。使用七氟烷呼吸麻醉并維持麻醉，碘伏消毒備皮，切開顱頂皮膚及骨膜，充分暴露顱骨。使用直徑5 mm的環(huán)形骨鉆在大鼠顱骨頂部鉆出兩個對稱的缺損，避免損傷腦膜[14]。在缺損處填充ALG 水凝膠（15 mg/mL）、MCA（ALG，15 mg/mL；MC，200 mg/mL）后逐層縫合骨膜和皮膚。分別在第2、4、8 周處死大鼠，取出主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）和顱骨，4%多聚甲醛中固定24 h。顱骨標(biāo)本進行Micro-CT 掃描后放入10%EDTA 脫鈣，石蠟包埋，切片后進行HE染色。

1.7 Micro-CT掃描

采用X 射線顯微斷層掃描（Micro-CT）掃描大鼠顱骨缺損區(qū)域，通過不同階段的X射線吸收檢測骨形成。掃描步驟為每節(jié)20 μm。采用三維重建成像軟件對各實驗組修復(fù)效果進行分析。

1.8 再生骨的組織學(xué)染色及評價

術(shù)后2、4、8 周采集顱骨標(biāo)本，用4%甲醛固定24 h，用10%乙二胺四乙酸脫鈣1 個月。梯度脫水后，將樣品包埋于石蠟中，沿靠近植入體中心的冠狀位方向用切片機切成3 μm厚度的切片。采用HE染色進行組織學(xué)評價，并用光學(xué)顯微鏡對切片進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 MCA掃描電鏡觀察及元素分析

將MC 和ALG 按比例混合后制成MCA，掃描電子顯微鏡觀察顯示，與ALG 水凝膠（見圖1C）光滑的表面相比，混有礦化膠原的MCA表面粗糙（見圖1F），可以觀察到MC顆粒（見圖1F黑色箭頭）。從能量色散光譜（EDS）圖中觀察到MCA 中密集而均勻的Ca/P 信號，結(jié)果說明MC 均勻地分散在水凝膠中（見圖1D-H）。另外，對ALG 水凝膠和MCA 中鈣磷含量進行測定，MCA 中鈣和磷含量（Ca：wt%=24.76%，P：wt%=13.70%）高于ALG水凝膠（Ca：wt%=6.13%，P：wt%=3.42%）（見圖1I、J）。

圖1 A. MCA未經(jīng)Ca2+交聯(lián)的可注射狀態(tài)；B. MCA經(jīng)Ca2+交聯(lián)的固體狀態(tài)；C. ALG 表面的掃描電鏡圖；D. ALG 中Ca 分布情況，EDS圖片；E. ALG中P分布情況，EDS圖片；F. MCA表面的掃描電鏡圖（黑色箭頭指示的是MC 顆粒）；G. MCA 中Ca 分布情況，EDS 圖片；H. MCA 中P 分布情況，EDS 圖片；I. ALG 中Ca/P 含量；J. MCA中Ca/P含量

2.2 MCA生物相容性實驗

MCA 浸提液與L929 細胞孵育48 h 后，空白對照組（0 mg/mL）細胞增殖率為100%，100 mg/mL組為99.62%，200 mg/mL 組為99.95%，MCA 水凝膠細胞毒性評級為1級，無細胞毒性（見圖2A）。MCA水凝膠皮下注射部位皮膚HE 染色結(jié)果顯示殘存的MCA 植入物周圍形成纖維包裹，植入物內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，注射部位皮膚和植入物周圍均未發(fā)現(xiàn)炎癥或病變（見圖2E）。皮下注射MCA第3天和第7 天，注射部位皮膚HE 染色結(jié)果中未見明顯的炎癥反應(yīng)（見圖2C、D）。

圖2 A. 不同浸提液濃度的細胞增殖率；B. 小鼠皮下注射MC@MAH水凝膠第60天時解剖圖；C. 注射MC@MAH水凝膠第3天時注射部位皮膚的HE染色；D. 注射MC@MAH水凝膠第7天時注射部位皮膚的HE染色；E. 注射MCA第60天皮膚的HE染色（比例尺：200 μm）

2.3 顱骨臨界骨缺損修復(fù)效果

從Micro-CT掃描的3D重建結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MCA 組在術(shù)后2 周和4 周時，原顱骨缺損中心位置出現(xiàn)了新生的骨組織。在術(shù)后第8 周時，原顱骨缺損處形成了更多的新生骨組織（見圖3），說明含有MC 的水凝膠具有成骨作用。用HE 染色進行組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在第2 周時MCA 組顱骨缺損處的MCA 凝膠已經(jīng)開始降解，同時有細胞向MCA凝膠內(nèi)部生長現(xiàn)象，這說明MCA有很好的降解性和組織相容性（見圖4）。實驗組大鼠的主要臟器HE 染色結(jié)果顯示各臟器，特別是顱骨缺損部位下方的大腦皮質(zhì)，細胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，核質(zhì)界限清晰，細胞之間結(jié)合緊密（見圖5）。

圖3 將ALG水凝膠和MCA填充于顱骨缺損處與對照組相比，第2、4、8周的顱骨臨界骨缺損修復(fù)的Micro-CT 3D圖片（紅色虛線表示臨界顱骨缺損范圍）

圖4 將ALG水凝膠和MCA填充于顱骨缺損處與對照組相比，第2、4、8周的顱骨臨界骨缺損修復(fù)的HE染色圖片（比例尺：200 μm）

圖5 將對照組和各個實驗組大鼠的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）進行HE染色圖片（比例尺：200 μm）

3 討論

為了滿足顱骨缺損修復(fù)的目的，開發(fā)一種在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能上都能模仿天然骨，同時滿足不同形狀骨缺損的水凝膠骨修復(fù)材料是十分必要的[15]。本研究中使用的礦化膠原（MC）采用仿生策略制備，結(jié)合海藻酸鹽（ALG）制備的水凝膠具有可注射性，并且不受骨缺損形狀的限制。這歸因于ALG在與Ca2+結(jié)合前是流體狀態(tài)，并且ALG具有良好的生物相容性和降解性[11]。另外，在ALG中加入MC時并不會使其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，也不會干擾凝膠的交聯(lián)過程[16]。相較于其他的利用光和熱產(chǎn)生交聯(lián)作用的水凝膠，ALG水凝膠的另一大優(yōu)勢在于可以利用體內(nèi)生理的Ca2+濃度產(chǎn)生交聯(lián)作用，更方便后期向骨缺損部位再次補充MCA。

大量研究工作表明，利用仿生原理制備的MC 具有天然骨結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能，并且被廣泛用于多種復(fù)合骨修復(fù)材料中[17-19]。MC中所包含的膠原、鈣和磷是成骨過程所需原料，并且MC 在骨缺損部位能更好地降解及促進新生骨的形成[20-21]。本研究的降解實驗和骨缺損修復(fù)結(jié)果也同樣證實這一結(jié)論。首先，小鼠右側(cè)腹部皮下注射MCA 后60 d，仍然觀察到大量殘留的MCA，HE 染色結(jié)果顯示殘留的MCA 內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻。其次，使用MCA 修復(fù)，顱骨臨界骨缺損2 周時，HE 染色結(jié)果顯示MCA 被分割成多個小的MCA團塊。隨著修復(fù)時間的延長，MCA逐步被分解吸收。第8 周時，相較于皮下注射第60 天HE 染色結(jié)果，填充于骨缺損處的MCA 已全部被分解吸收，取而代之的是新生骨和血管。由此可見，MCA 在骨缺損部位可以緩慢降解，促進新生骨和血管的形成。

在本研究中，為了評價MCA 對骨再生的影響，在SD大鼠顱骨臨界骨缺損中植入MCA。使用MCA 修復(fù)顱骨臨界骨缺損2 周時，HE 染色結(jié)果顯示MCA 被分割成多個小的MCA團塊，同時有細胞向MCA內(nèi)部生長以及新生血管形成，這對骨再生至關(guān)重要[22]。第4 周時，骨缺損處殘留少許MCA，同時出現(xiàn)新生骨。新骨的形成不是從原生骨的斷裂端開始，而是從缺損中心開始，說明新骨的形成是由MCA 誘導(dǎo)的。移植8 周后，Micro-CT 和HE 染色結(jié)果分析顯示，MCA組缺損處再生出許多新生骨和血管。這一結(jié)果可以證明MCA 具有很好的骨傳導(dǎo)性和成骨特性，可以促進營養(yǎng)物質(zhì)和成骨細胞向水凝膠內(nèi)部轉(zhuǎn)移。與MCA 組相比，ALG組和對照組的缺損區(qū)域主要為纖維組織填充，僅在邊緣處有極少量的新骨形成。

在這項工作中，體內(nèi)實驗結(jié)果表明MCA 顯著改善了臨界尺寸顱骨缺損的骨再生。然而，MCA 仍有不足之處。與水凝膠相關(guān)的最突出的問題是機械強度不足，這使得水凝膠不適合用于承重部位的骨缺損修復(fù)[23]。第8 周時骨再生明顯，但仍有少部分缺損未被修復(fù)，這一結(jié)果的原因可能是MCA的遷移和骨再生所需原料的需求量增加[15]。在后續(xù)研究中，可以在未修復(fù)的缺損處再次注射MCA，觀察其再修復(fù)的效果。另外，還可以增加MCA中MC的含量，研究增加MC含量后對水凝膠交聯(lián)程度的影響，并與MCA再注射相對比，比較兩種方式的骨修復(fù)效果。

本研究將ALG 溶液與MC 兩者結(jié)合制備出流體狀MCA水凝膠，注射至骨缺損部位后，體內(nèi)的Ca2+與流體狀MCA 水凝膠中的ALG 通過交聯(lián)效應(yīng)在骨缺損處原位形成固態(tài)MCA 水凝膠。MCA 在活體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物相容性和促進骨再生能力，是一種安全可靠的骨修復(fù)材料。