彭明沙,周翼,劉剛,馮雪雅,彭洪

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院,1.肛腸外科;2.超聲科,四川 南充 637000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的胃腸道惡性腫瘤。2020年全球新增190萬例CRC病例,有93.5萬例死亡,占所有癌癥死亡的1/10[1]。大多數(shù)CRC患者在早期沒有明顯癥狀,大約40%～50%的患者在診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2-3]。因此深入研究CRC的發(fā)病機(jī)制有利于該病的準(zhǔn)確診斷、精準(zhǔn)治療和早期預(yù)防,也是降低CRC死亡率的有效途徑。SLC16基因家族由14個(gè)成員組成,也稱為單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)家族[4]。SLC16家族成員參與多種代謝途徑,包括能量代謝、糖異生、T淋巴細(xì)胞活化、腸道代謝、甲狀腺激素代謝和腦、骨骼肌、心臟和腫瘤細(xì)胞中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)[5-6]。SLC16A8作為該基因家族成員之一,主要負(fù)責(zé)單羧酸代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸,如丙酮酸鹽、L-乳酸鹽和酮體[7]。然而尚不清楚SLC16A8與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是具有基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族,可調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)合成和攝取途徑的基因[8]。SREBP1由SREBF1基因編碼,是控制細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)器,可通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸的合成及攝入[9]。越來越多的證據(jù)表明SREBP1參與了不同癌癥的代謝重編程,如前列腺癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[10]。既往研究[11]發(fā)現(xiàn),肝癌微環(huán)境中乳酸濃度的增加可負(fù)反饋促進(jìn)MCT1介導(dǎo)的乳酸攝取并下調(diào)SREBP1的表達(dá),然而CRC中SREBP1是否參與SLC16A8介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)尚無報(bào)道。

本研究擬探討SLC16A8通過調(diào)控腫瘤酸性微環(huán)境促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和侵襲,以及轉(zhuǎn)錄因子SREBP1上調(diào)SLC16A8表達(dá)促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)參與CRC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載619名CRC患者的病例資料,分析SLC16A基因家族14個(gè)成員與CRC患者預(yù)后的關(guān)系。通過UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)網(wǎng)站分析SLC16A8在結(jié)腸癌和直腸癌中的表達(dá)。通過STRING(https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bg39Tea7hbww)數(shù)據(jù)庫篩選出38個(gè)SLC16A8結(jié)合蛋白,通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)獲得與SLC16A8基因表達(dá)相關(guān)的前100個(gè)基因,結(jié)合這兩個(gè)數(shù)據(jù)集共138個(gè)基因。通過Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對(duì)SLC16A8的功能富集進(jìn)行分析。通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/)查詢SLC16A8潛在的轉(zhuǎn)錄因子,再通過JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)網(wǎng)站分析SLC16A8啟動(dòng)子序列與轉(zhuǎn)錄因子SREBP1可能的結(jié)合位點(diǎn)。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析SREBP1 mRNA的表達(dá)。使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)分析SREBP1表達(dá)水平與CRC預(yù)后的關(guān)系,再通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析SREBF1與SLC16A8表達(dá)的相關(guān)性。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

FHC(正常結(jié)直腸粘膜上皮細(xì)胞)、SW620、SW480、HCT116及HT29細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。FHC和HT29使用1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng);SW620和SW480使用L-15培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng);HCT116細(xì)胞使用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(HyClone;Cytiva)培養(yǎng);由GenePharma合成并構(gòu)建SREBP1過表達(dá)載體(OE-SREBP1)、SLC16A8過表達(dá)載體(OE-SLC16A8)及SLC16A8 siRNA。根據(jù)制造商的說明,使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)將其轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞中。陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列到HCT116細(xì)胞。SLC16A8 siRNA序列如下:5′-GCCUGUUGUUGCAGAGGAA-3′。通過拯救實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SREBP1是否通過正調(diào)控SLC16A8表達(dá)促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn),分組如下:空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組,SREBP1過表達(dá)組和SREBP1過表達(dá)+SLC16A8 siRNA組。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中SLC16A8的表達(dá)水平

吸掉培養(yǎng)基,PBS洗1次,吸掉PBS,加入1 mL Trizol(Invitrogen),將底部細(xì)胞吹打起來,轉(zhuǎn)入1.5 mL LEP管裂解細(xì)胞,分離各細(xì)胞總RNA,在37 ℃下用RNaseR(2 U/μg)處理提取的RNA 10 min,DNA marker以ddH2O為模板作為PCR陰性對(duì)照。逆轉(zhuǎn)錄后,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。SLC16A8序列如下:5- AGCCGTGAGCGTCTTCTTC-3(sense),5- GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG-3 (antisense)。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

設(shè)立空白對(duì)照組(不作處理),陰性對(duì)照組(添加無義序列)和SLC16A8過表達(dá)組并使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。在96孔板中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞(4×105個(gè)/mL),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康霓D(zhuǎn)染48 h后向每孔添加10 μL CCK-8(Dojindo)。2 h后,測(cè)試450 nm下的OD值。

1.5 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

設(shè)立空白對(duì)照組(不作處理),陰性對(duì)照組(添加無義序列)和SLC16A8 siRNA組并通過Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,使用涂有Matrigel基質(zhì)的Transwell腔室測(cè)試細(xì)胞侵襲能力。將處理好的細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中,然后將無血清細(xì)胞懸液(500 μL)和添加FBS的培養(yǎng)基(200 μL)分別添加到上腔和下腔。進(jìn)入下腔的細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)48 h后用多聚甲醛固定,然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min后在顯微鏡下拍照及計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞上清液乳酸測(cè)定

設(shè)立空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組和SLC16A8過表達(dá)組并分析HCT116細(xì)胞上清液中乳酸表達(dá)水平,將1×104個(gè)細(xì)胞在含有10%胎牛血清和6 mmol/L葡萄糖的無糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5% CO2溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集上清液,按照制造商的說明使用熒光乳酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清液中乳酸水平。

1.7Westernblot

總蛋白通過RIPA裂解物(Beyotime)收獲,并通過BCA試劑盒(Invitrogen)檢測(cè)。在SDS-PAGE凝膠中分離蛋白質(zhì)(40 μg)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)。封閉后,將膜在4 ℃下暴露于一級(jí)抗體(Abcam)過夜,隨后使用二級(jí)抗體(Abcam)處理1 h,并通過滴加ECL顯色溶液進(jìn)行顯影。使用ECL化學(xué)發(fā)光后,蛋白質(zhì)在凝膠成像儀(Bio-Rad)上進(jìn)行顯影。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

分別合成熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-SLC16A8與熒光素酶報(bào)告基因缺失突變載體pGL3-SLC16A8-DM。將pGL3-SLC16A8或pGL3-SLC16A8-DM與pCMV-Myc-SREBP1過表達(dá)載體及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞48 h后測(cè)定熒光素酶活性。將CRC HCT116細(xì)胞接種至24孔板,將熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-SLC16A8或熒光素酶報(bào)告基因缺失突變載體pGL3-SLC16A8-DM與pCMV-Myc-SREBF1過表達(dá)載體或pCMV-Myc質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,設(shè)定熒光素酶報(bào)告基因載體、pCMV-Myc-SREBF1過表達(dá)載體與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK轉(zhuǎn)染比例為50∶50∶1。轉(zhuǎn)染48 h后,按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)說明書測(cè)定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SLC16A家族與CRC預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果表明高表達(dá)SLC16A8基因的CRC患者提示預(yù)后較差(P<0.05),其余13個(gè)基因表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后均無相關(guān)性(P>0.05)。見圖1。

2.2 SLC16A8在CRC組織中高表達(dá)

UALCAN數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明SLC16A8在結(jié)腸癌和直腸癌中均高于癌旁組織(P<0.05)。見圖2。

2.3 SLC16A8在CRC細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明,SLC16A8在CRC細(xì)胞株(SW620、SW480、HCT116和HT29)中的表達(dá)水平均高于FHC細(xì)胞(P<0.05)。既往研究[12]證實(shí)SLC16A8在HCT116細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HCT116細(xì)胞。見圖3。

2.4 SLC16A8對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果表明SLC16A8過表達(dá)組中HCT116細(xì)胞增殖能力提高(P<0.05)。見圖4。

2.5 SLC16A8對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲的影響

空白對(duì)照組(64.00±1.00)和陰性對(duì)照組(62.67±1.53)相比,SLC16A8 siRNA組(34.67±1.53)中HCT116細(xì)胞侵襲能力降低(t=27.828,22.450,P<0.05)。見圖5。

2.6 SLC16A8功能富集

使用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)SLC16A8的功能富集進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其主要功能聚集在乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)及血管生成。見圖6。

2.7 SLC16A8對(duì)細(xì)胞上清液中乳酸水平的影響

結(jié)果表明SLC16A8過表達(dá)組細(xì)胞上清液中乳酸相對(duì)表達(dá)水平增高(P<0.05)。見圖7。

2.8 SREBP1可能是SLC16A8的轉(zhuǎn)錄因子

通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SREBP1可能是SLC16A8的轉(zhuǎn)錄因子,且SREBP1蛋白與SLC16A8有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)樵u(píng)分愈高兩者結(jié)合的可能性愈大,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇評(píng)分最高的結(jié)合位點(diǎn)“CTCACCCCAT”進(jìn)行研究。見圖8。

2.9 SREBP1蛋白可與SLC16A8靶向結(jié)合

結(jié)果顯示與共轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空載體對(duì)照組(1.00±0.05)相比,過表達(dá)SREBP1可上調(diào)SLC16A8熒光素酶報(bào)告基因活性(1.79±0.03,t=-24.099,P<0.05)。將SREBP1結(jié)合位點(diǎn)“CTCACCCCAT”缺失后,SLC16A8熒光素酶報(bào)告基因活性降低(1.19±0.07,t=13.704,P<0.05),說明SREBP1能夠通過結(jié)合“CTCACCCCAT”促進(jìn)SLC16A8轉(zhuǎn)錄。見圖9。

2.10 SREBF1基因在CRC中高表達(dá)

通過UALCAN分析SREBF1在CRC中的表達(dá),結(jié)果表明SREBF1在CRC中的表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)。見圖10。

2.11 SREBF1與患者預(yù)后相關(guān)

Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析結(jié)果表明高表達(dá)SREBF1的CRC患者預(yù)后較差(P<0.05)。見圖11。

2.12 SREBP1正調(diào)控SLC16A8表達(dá)

GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明SREBP1與SLC16A8正相關(guān)(r=0.24,P<0.05)。接下來分析SREBP1對(duì)SLC16A8編碼蛋白MCT3的影響,結(jié)果表明與陰性對(duì)照組(0.174±0.001)相比,SREBP1過表達(dá)組中MCT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平增高(0.592±0.003,t=255.972,P<0.05)。見圖12。

2.13 SREBP1通過正調(diào)控SLC16A8表達(dá)促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)

拯救實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SREBP1是否通過正調(diào)控SLC16A8表達(dá)促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組(1.000±0.032)和陰性對(duì)照組(0.979±0.070)相比,SREBP1過表達(dá)組細(xì)胞上清液中乳酸表達(dá)水平增高(1.707±0.144,t=8.290,7.875,P<0.05)。但相比SREBP1過表達(dá)組,SREBP1過表達(dá)+SLC16A8 siRNA組中乳酸水平降低(1.313±0.057,t=4.403,P<0.05),說明抑制SLC16A8表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SREBP1對(duì)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)作用,證實(shí)SREBP1通過正調(diào)控SLC16A8促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)。見圖13。

3 討論

CRC是胃腸道常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年上升。大多數(shù)CRC患者確診時(shí)已處于晚期,對(duì)于這些患者來說手術(shù)和輔助治療效果有限且不良反應(yīng)多,患者預(yù)后較差。因此深入了解CRC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。

SLC16A8屬于SLC16A基因家族,可編碼單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(MCT3)。既往研究發(fā)現(xiàn),MCT1-4蛋白主要功能為介導(dǎo)質(zhì)子耦連的乳酸等單羧酸類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),通過參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝和腫瘤微環(huán)境酸化影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[5-6]。關(guān)于SLC16A8(MCT3)的研究較少,研究[13]發(fā)現(xiàn)SLC16A8在乳腺癌中低表達(dá),但SLC16A8與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚無報(bào)道。TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果表明SLC16A8與患者預(yù)后相關(guān),高表達(dá)SLC16A8的CRC患者預(yù)后明顯較差(P<0.05)。與癌旁組織相比,SLC16A8在結(jié)腸癌和直腸癌組織及CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平均增高,表明SLC16A8可能與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CCK-8及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SLC16A8可促進(jìn)CRCHCT116細(xì)胞的增殖和遷移,證實(shí)SLC16A8在CRC發(fā)生發(fā)展中扮演著促癌因子的角色。為明確SLC16A8發(fā)揮促癌作用的具體機(jī)制,本研究對(duì)SLC16A8的功能富集進(jìn)行分析并發(fā)現(xiàn)其主要功能聚集在乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)及血管生成。

在實(shí)體腫瘤中,由于腫瘤組織迅速增長(zhǎng)及腫瘤組織內(nèi)部血管系統(tǒng)不完備會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)氧氣供應(yīng)不足。由于氧氣供給不足,腫瘤細(xì)胞只能夠通過無氧酵解的方式進(jìn)行能量代謝,其會(huì)造成乳酸的積累并反饋抑制糖酵解,同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制;而SLC16A8編碼的MCT3蛋白可特異性的將乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,這對(duì)于調(diào)控糖酵解具有重要生理意義[13]。且轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的乳酸可造成腫瘤微環(huán)境pH值降低,整體呈現(xiàn)酸性環(huán)境,而腫瘤酸性微環(huán)境可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,重塑細(xì)胞外基質(zhì)使腫瘤細(xì)胞侵入并轉(zhuǎn)移到周圍和遠(yuǎn)處的器官,還有助于建立利于免疫逃逸的免疫抑制微環(huán)境等[14]。本研究發(fā)現(xiàn)SLC16A8過表達(dá)組HCT116細(xì)胞上清液中乳酸表達(dá)水平明顯增高,證實(shí)SLC16A8可將乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)到CRC細(xì)胞外形成腫瘤酸性微環(huán)境,從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和遷移。

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用,并對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白。使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對(duì)SLC16A8的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其可與SREBP1結(jié)合,通過JASPAR網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)SLC16A8啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子SREBP1有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),且熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SLC16A8可與SREBP1靶向結(jié)合。SREBP1蛋白由SREBF1基因編碼,是控制細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)器,但其與腫瘤酸性微環(huán)境的關(guān)系尚無報(bào)道[15]。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SREBF1在CRC中高表達(dá),且高表達(dá)SREBF1的CRC患者預(yù)后較差,說明SREBF1參與CRC的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)果表明SREBF1基因與SLC16A8基因在CRC中的表達(dá)正相關(guān),且高表達(dá)SREBP1可促進(jìn)MCT3蛋白表達(dá),證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子SREBP1可通過促進(jìn)SLC16A8基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)MCT3蛋白表達(dá)。通過拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SREBP1通過正調(diào)控SLC16A8表達(dá)促進(jìn)腫瘤酸性微環(huán)境的形成,結(jié)果表明SREBP1過表達(dá)組中的乳酸表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組增高,但與SREBP1過表達(dá)組相比,SREBP1過表達(dá)+ SLC16A8 siRNA組中的乳酸水平有所降低,說明抑制SLC16A8表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SREBP1對(duì)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)作用,證實(shí)SREBP1通過正調(diào)控SLC16A8增加乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)以形成腫瘤酸性微環(huán)境,并最終促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上,本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子SREBP1可對(duì)SLC16A8的轉(zhuǎn)錄起到正調(diào)控作用,導(dǎo)致SLC16A8編碼的MCT3蛋白在結(jié)直癌中高表達(dá)并促進(jìn)乳酸外排以形成腫瘤酸性微環(huán)境,最終參與CRC的發(fā)生發(fā)展。SLC16A8在CRC中的研究尚少,本研究為完善CRC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和CRC的防治提供了新的依據(jù)和作用靶點(diǎn),后續(xù)還需要更多的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。