王鵬，李雯，王悅，武志鑫，臺蓮梅，靳學(xué)慧，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省作物有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點實驗室，大慶 163319；2.黑龍江省植物抗性研究中心）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）種植面積廣，適應(yīng)性強，營養(yǎng)價值高，能夠滿足人體營養(yǎng)需求，深受人們喜愛。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，出現(xiàn)倒茬困難和連作障礙問題，這使馬鈴薯土傳病害日益加重[1]。由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的馬鈴薯黑痣病是馬鈴薯主要的土傳病害，也是世界性土傳真菌病害[2]。病原菌寄主范圍廣泛，已知可侵染200 多種植物[3]。病菌以菌絲體或菌核在馬鈴薯塊莖、病殘體或土壤中越冬，主要危害馬鈴薯根莖、匍匐莖和薯塊，發(fā)生嚴(yán)重時可影響馬鈴薯出苗率和產(chǎn)量[4]。在國內(nèi)每年多省份均有不同程度發(fā)生，重病田病株率高達(dá)80%以上，病害制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。長期以來，防治馬鈴薯黑痣病主要依靠化學(xué)藥劑，而化學(xué)藥劑的長期使用會影響土壤質(zhì)量、農(nóng)作物生產(chǎn)力、藥劑殘留等問題[6]。因此，需要尋找對環(huán)境、人類以及作物本身更安全的方法，利用微生物防治土傳病害具有對環(huán)境安全、投入低、資源充足等特點，是解決這些問題的有效途徑[7]。

目前，國內(nèi)外已有不少學(xué)者對生防菌防治土傳病害進行研究，使用生防微生物防治馬鈴薯黑痣病已經(jīng)成為當(dāng)下熱點。Hussain 等[8]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以產(chǎn)生蛋白酶，能夠降解病原體細(xì)胞壁，降低病原體生長或感染植物的能力，減輕馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。王天君等[9]從17 株木霉菌中篩選得到一株擬康寧木霉（Trichoderma pseudokoningii）78 無菌發(fā)酵液對立枯絲核菌的抑制率為92.90%，利用木霉菌劑處理薯塊，顯著降低馬鈴薯黑痣病的病情指數(shù)，盆栽試驗防效達(dá)59.07%～70.11%。芽孢桿菌因其能形成芽孢，對外界抵抗能力強，并且分布廣，在植物病害防治上具有巨大潛力，因此成為研發(fā)微生物殺菌劑的重要資源。關(guān)小敏等[10]從甘肅省連作馬鈴薯田分離得到一株類芽孢桿菌（Paenibacillus jamilae）G1 對馬鈴薯黑痣病菌有較強的拮抗效果。朱明明等[11]從河北省和內(nèi)蒙古馬鈴薯根際土中分離得到141 株芽孢桿菌，其中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HN-Q-8 發(fā)酵液對馬鈴薯黑痣病防效最強，該菌株在15 ℃以上就可以對病原菌起到抑制作用。許麗婷等[12]從馬鈴薯根際土壤分離篩選得到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XC-1 并分析了該菌株的生防特性，該菌株可以產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶抑制病原菌的生長，小區(qū)試驗，XC-1 對馬鈴薯黑痣病的防效達(dá)54.51%，增產(chǎn)22.02%。而黑龍江省此方面的研究報道較少，另外，地域不同，同種微生物所處環(huán)境條件不同，其防治效果和機理也不同[13-14]。

因此，從馬鈴薯黑痣病發(fā)病的連作田取樣，通過平板對峙培養(yǎng)篩選獲得對黑痣病菌有較好的拮抗菌株，進一步盆栽試驗確定其防效，鑒定其分類地位，為防治馬鈴薯黑痣病的生物菌劑研發(fā)提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試品種：延薯4 號（原種2 代），由訥河市鑫豐種業(yè)有限公司提供。

1.2 供試病原菌

病原真菌：立枯絲核菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)病理實驗室保存。

1.3 供試培養(yǎng)基

LB、NA、PDA、PDB 培養(yǎng)基參照《植病研究法》進行配置[15]。

1.4 試驗方法

1.4.1 細(xì)菌的分離和純化

采用土壤稀釋法分離細(xì)菌（土樣采集自黑龍江省克山農(nóng)場馬鈴薯黑痣病發(fā)病地塊根際土），吸取100 μL 土壤懸浮液涂布到LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d。挑選不同菌落形態(tài)、顏色和大小，平板劃線純化培養(yǎng)后編號保存。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的篩選及病原菌菌絲形態(tài)觀察

首先進行拮抗細(xì)菌初篩，PDA 培養(yǎng)基中心接種5 mm 活化好的黑痣病菌，十字交叉法接種待測菌株。每處理3 次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d，將對黑痣病菌有抑菌圈的細(xì)菌菌株進一步復(fù)篩。

復(fù)篩采用平板對峙法。將初篩獲得的菌株劃線活化，取單菌落接種于LB 培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d，將菌液調(diào)至OD600=0.8 備用。PDA 培養(yǎng)基中心接種5 mm 黑痣病菌，十字交叉法接種待測菌株菌液5 μL，接無菌水為對照，每處理3 次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d。將抑制效果最好的拮抗菌株保存?zhèn)溆?。同時，利用顯微鏡觀察拮抗效果最好的菌株在峙平板上對馬鈴薯黑痣病菌菌絲的影響。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.4.3 拮抗細(xì)菌分泌胞外酶測定

拮抗菌株分泌纖維素酶的測定參考穆春雷[16]的方法；拮抗菌株分泌蛋白酶的測定參考尹春筱[17]的方法；拮抗菌株分泌葡聚糖酶的測定參考趙軍崗[18]的方法。

1.4.4 拮抗菌株對馬鈴薯黑痣病盆栽防效的測定

在室外條件下采用桶栽接種測定菌株對馬鈴薯黑痣病的防治效果。選取大小一致健康馬鈴薯種薯，切成大小相近的薯塊備用。將活化好的立枯絲核菌10 個菌餅（5 mm）接種至PDB 培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)7 d，利用豆?jié){機將菌落打散，調(diào)節(jié)濃度為1×103cfu·mL-1備用。將拮抗菌株單菌落接種于LB 培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d，調(diào)節(jié)拮抗菌濃度為1×108cfu·mL-1備用。用口徑20 cm、深25 cm的桶種植馬鈴薯，每桶裝土15 kg，將150 mL 立枯絲核菌菌懸液和土壤充分混合配成帶菌土。

試驗設(shè)計如下，處理1：每桶加入240 mL 無菌水為空白對照；處理2：每桶加入240 mL 無菌LB 培養(yǎng)液；處理3：每桶加入240 mL 的拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)液。每桶種植3 塊馬鈴薯薯塊，每個處理5 桶，3 次重復(fù)。每桶播種出苗60 d 后調(diào)查發(fā)病情況，同時測量株高、莖粗、側(cè)根長、側(cè)根數(shù)、匍匐莖數(shù)，并計算防效。

馬鈴薯黑痣病病害分級標(biāo)準(zhǔn)參照Weinhold[19]地下莖分級標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=Σ（發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級別/調(diào)查總株數(shù)×最高發(fā)病級別）×100

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.4.5 拮抗菌株的鑒定

將拮抗菌株劃線接種至NA 平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，并參照東秀珠和劉波等[20-21]描述進行生理生化特征鑒定。

采用北京天根生化科技有限公司的試劑盒提取菌體DNA；參考陳志垚等[22]擴增16S rRNA 基因，PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS 22.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離篩選及病原菌菌絲形態(tài)觀察

從馬鈴薯根際土樣中分離得到303 株細(xì)菌，最終篩選出一株細(xì)菌菌株對立枯絲核菌抑制效果最好，抑制率達(dá)78.91%（圖1B），將其編號為KSD17。顯微鏡觀察，CK 對照菌絲表面光滑、勻稱，內(nèi)容物均勻（圖1C）；菌株KSD17 處理過的菌絲膨大、彎曲、表面干癟、皺縮，內(nèi)容物不均勻（圖1D）。

圖1 菌株KSD17 對立枯絲核菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain KSD17 on Rhizoctonia solani

2.2 拮抗菌株KSD17 胞外酶測定

對菌株KSD17 產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶及β-1，3-葡聚糖的能力進行測定（圖2）。菌株KSD17 在羧甲基纖維素酶鑒別培養(yǎng)基和蛋白酶鑒別培養(yǎng)基中產(chǎn)生明顯的水解圈（圖2A，B），在β-1，3-葡聚糖檢測培養(yǎng)基中產(chǎn)生較小的水解圈（圖2C）。說明該菌株具有產(chǎn)羧甲基纖維素酶、蛋白酶能力以及β-1，3-葡聚糖的能力。

圖2 菌株KSD17 在鑒定培養(yǎng)基上的透明圈Fig.2 The transparent circle of strain KSD17 on the identification medium

2.3 拮抗菌株KSD17 對馬鈴薯黑痣病的盆栽防效

采用盆栽試驗進行了菌株KSD17 對馬鈴薯黑痣病的防效試驗。結(jié)果表明，CK 空白對照和LB 培養(yǎng)液對照處理的馬鈴薯地下莖發(fā)病重，發(fā)病率分別為98.33%、95.00%，病情指數(shù)分別為59.11、64.00，處理間差異不顯著，但顯著高于菌株KSD17 發(fā)酵液處理的病情指數(shù)（P＜0.05）（表1）。CK 空白對照和LB 培養(yǎng)液處理馬鈴薯植株莖部出現(xiàn)大面積褐色病斑，病害程度比較嚴(yán)重（圖3）。 KSD17 發(fā)酵液處理黑痣病發(fā)病率為56.67%，病情指數(shù)20.00，菌株KSD17 對黑痣病的防效為66.17%。說明菌株KSD17 對馬鈴薯黑痣病有較好的防治效果。

表1 菌株KSD17 對馬鈴薯黑痣病的盆栽防效Table 1 Determination of potted control effect of strain KSD17 against potato black scurf

圖3 菌株KSD17 的盆栽防效Fig.3 Determination of potted control effect of strain KSD17

2.4 拮抗菌株KSD17 對馬鈴薯植株生長的影響

拮抗細(xì)菌對馬鈴薯形態(tài)指標(biāo)的影響，LB 培養(yǎng)液和CK 空白對照對馬鈴薯植株形態(tài)指標(biāo)差異不顯著（P＜0.05）（表2）。但菌株KSD17 處理的株高和匍匐莖較CK 差異顯著，分別增加了9.05%和22.04%。試驗結(jié)果表明，菌株KSD17 對馬鈴薯的生長具有促生作用。

表2 菌株KSD17 對馬鈴薯形態(tài)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of strain KSD17 on morphological indicators of potato

2.5 拮抗菌株KSD17 的鑒定

2.5.1 拮抗菌株KSD17 的形態(tài)及生理生化特性鑒定

菌株KSD17 在NA 培養(yǎng)基上呈乳白色，菌落表面無褶皺，邊緣不規(guī)則，挑起菌落時較為粘稠、無色素產(chǎn)生（圖4A）。經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株KSD17 菌體呈桿狀，有芽孢（圖4B）。

圖4 菌株KSD17 的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of strain KSD17

測定菌株KSD17 的生理生化特性的檢測結(jié)果（表3）。菌株KSD17 厭氧或兼性厭氧生長，氧化酶活性反應(yīng)為陽性，不產(chǎn)生硫化氫氣體；在高于5% NaCl培養(yǎng)基中生長受抑制；水解淀粉成陽性；菌株能利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、甘露醇且產(chǎn)酸；吲哚反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P 反應(yīng)、MR 反應(yīng)均呈陽性；脲酶、檸檬酸鹽反應(yīng)、丙二酸鹽反應(yīng)、精氨酸雙水解酶、明膠反應(yīng)呈陰性。

表3 菌株KSD17 的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain KSD17

通過菌株KSD17 菌落形態(tài)和生理生化特征與布坎南、東秀珠和劉波等所列出的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）描述一致。

2.5.2 拮抗菌株KSD17 的分子生物學(xué)鑒定

拮抗菌株KSD17 經(jīng)PCR 擴增，獲得16S rRNA基因序列長度為1 420 bp（登錄號MV821402）。經(jīng)BLAST 進行同源性比對，菌株KSD17 與多粘類芽孢桿菌相似度最高達(dá)99.15%，下載與KSD17 相似率高且有代表性的菌株。采用Mega7.0 軟件進行遺傳距離分析，KSD17 菌株與多粘類芽孢桿菌聚在一個分支（圖5）。再結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)測定，最終將菌株KSD17 鑒定為多粘類芽孢桿菌。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree

3 討論

研究從馬鈴薯根際土中分離得到多株細(xì)菌，通過平板對峙篩選得到菌株KSD17 對馬鈴薯黑痣病菌拮抗效果最好。菌株可以使立枯絲核菌菌絲膨大、彎曲、表面干癟、皺縮，平板抑制率達(dá)78.91%，盆栽試驗表明，KSD17 發(fā)酵液接種量240 mL 時對馬鈴薯黑痣病防治效果達(dá)66.17%，并促進馬鈴薯植株株高生長和匍匐莖數(shù)量，較CK 分別增加9.05%和22.04%。通過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA 鑒定，將菌株KSD17 鑒定為多粘類芽孢桿菌。

生防菌株能夠分泌水解酶類物質(zhì)抑制或消除病原真菌。其中，羧甲基纖維酶和蛋白酶能夠水解病原真菌細(xì)胞壁，而β-1，3-葡聚糖酶能夠水解真菌侵染過程形成的芽管，芽管最外層的結(jié)構(gòu)胞壁主要成分為葡聚糖[23]。Kim 等[24]從果樹根際土壤中分離得到一株多粘類芽孢桿菌APEC136，對蘋果炭疽病和白腐病具有很好的防治效果，菌株具有較高的蛋白酶活性，但纖維酶活性較低。Prapagdee[25]研究表明β-1，3-葡聚糖酶通過水解或抑制膠孢炭疽菌和齊整小核菌細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖的合成，從而抑制其病原菌生長。研究獲得的多粘類芽孢桿菌KSD17 菌株能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶，這可能是抑制馬鈴薯黑痣病菌機理之一，其產(chǎn)生羧甲基纖維素酶和蛋白酶的活力均較強，產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖酶的活力較低。

關(guān)于多粘類芽孢桿菌的防治土傳病害已有一些報道。黃藝爍等[26]通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌ZF197 可以在發(fā)生白菜莖基腐病的土壤中定值，顯著降低白菜莖腐病病情指數(shù)，其防效達(dá)78.57%。張亮等[27]研究多粘類芽孢桿菌可以在發(fā)生番茄青枯病的土壤中定值，顯著降低青枯病菌（Ralstonia solanacearum）豐富度。在分析菌株KSD17 拮抗效果的基礎(chǔ)上，通過室外盆栽試驗表明，菌株KSD17 處理對馬鈴薯黑痣病有較好的防效，達(dá)66.17%，推測多粘類芽胞桿菌KSD17 能在馬鈴薯根際土中定植。菌株KSD17 處理后對馬鈴薯植株株高和匍匐莖均顯著提高；側(cè)根數(shù)較CK 降低了26.65%。這與孫中華等[28]研究相類似，使用5%～20%枯草芽孢桿菌B67 菌液處理均能黃瓜幼苗莖粗、株高、根長和根管比均顯著性增加，使用超過20%菌液濃度使黃瓜幼苗莖粗、株高、根長和根管比顯著下降。菌株KSD17 的應(yīng)用最適濃度還需要進一步探索。多粘類芽孢桿菌KSD17能顯著降低馬鈴薯黑痣病發(fā)生，是一株具有開發(fā)潛力的生防菌，將對馬鈴薯黑痣病的綠色防控具有重要意義。

4 結(jié)論

從采集馬鈴薯根際土中分離得到一株多粘類芽孢桿菌KSD17，促進馬鈴薯植株生長，有效防治馬鈴薯黑痣病的發(fā)生，是一株具有較強開發(fā)潛力的生防菌。