鄭煥東,李 松,向 蓉△

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東中山 528415;2.廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510006

諾卡菌是一種廣泛分布于土壤和水源的需氧放線菌,屬于條件致病菌,主要通過(guò)呼吸道吸入或者侵入皮膚、黏膜破損的傷口而感染人體[1]。免疫功能缺陷或低下患者易感染諾卡菌,如長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑治療者、自身免疫性疾病患者、艾滋病患者、糖尿病患者及腫瘤患者等,也有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道稱多達(dá)三分之一的諾卡菌病患者具有正常的免疫功能[2]。目前有醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道的北京諾卡菌感染的病例少見,筆者就1例北京諾卡菌肺部感染合并支氣管擴(kuò)張的病例報(bào)道如下。

1 病例資料

患者,女,52歲,因“咳嗽、咳痰伴咯血2周”,于2021年11月30日收治于廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院呼吸科。入院時(shí)神志清楚,精神尚可,咳嗽、咳痰,暫無(wú)咯血,痰量多,色黃黏稠,味腥臭,易咳出,深呼吸時(shí)少許胸痛,無(wú)氣促,無(wú)口干、口苦,無(wú)惡寒、發(fā)熱,無(wú)鼻塞、流涕;既往有支氣管擴(kuò)張病史,否認(rèn)冠心病、糖尿病、肝炎、高血壓、結(jié)核等病史。查體:體溫36.8 ℃,心率:103次/分,呼吸20次/分,血壓:90/67 mm Hg,雙肺叩診呈清音,雙肺聽診呼吸音清,有濕性啰音。患者曾于2019年7月24日住院期間行胸部CT檢查,示“雙肺多發(fā)感染,左肺上葉下舌段及右肺中葉支氣管擴(kuò)張”,遂以“支氣管擴(kuò)張伴感染”收治入院。入院完善相關(guān)檢查:血常規(guī)、凝血功能、肝功能、甲狀腺功能均無(wú)明顯異常,結(jié)核抗體檢測(cè)陽(yáng)性,結(jié)核DNA測(cè)定陰性,結(jié)核干擾素釋放試驗(yàn)陰性。

2 病原學(xué)檢查和治療經(jīng)過(guò)

2.1病原學(xué)檢查

2.1.1涂片 2021年12月3日采集患者深部痰標(biāo)本送檢,涂片后革蘭染色鏡檢,可見革蘭陽(yáng)性桿菌,呈細(xì)長(zhǎng)絲狀,形似串珠,分枝樣排列,見圖1。

圖1 深部痰涂片革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

2.1.2痰培養(yǎng) 采用無(wú)菌拭子挑取患者深部痰標(biāo)本的膿痰部位分別接種哥倫比亞血瓊脂平板、嗜血桿菌巧克力瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板,對(duì)標(biāo)本分區(qū)劃線后,將所有平板放置于35 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后,哥倫比亞血瓊脂平板和嗜血桿菌巧克力瓊脂平板上可見細(xì)小、干燥的白色菌落,72 h后,形成白色、表面干燥、有褶皺、邊緣陷入瓊脂的菌落。挑取培養(yǎng)72 h后的菌落涂片,進(jìn)行弱抗酸染色,鏡下可見部分細(xì)菌呈陽(yáng)性(紅色),部分細(xì)菌呈陰性(藍(lán)色)。

2.1.3基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測(cè) 采用中元公司EXS 3000質(zhì)譜儀鑒定該菌:挑取3個(gè)菌落置于1.5 mL的EP管內(nèi),加入300 μL超純水,充分懸浮,再加入900 μL無(wú)水乙醇,充分混勻后,12 000 r/min離心2 min,棄上清液,室溫下放置5 min,使沉淀物自然干燥,加入20 μL 70%的甲酸,用移液槍吹打混勻,再加入20 μL乙腈,充分混勻后,12 000 r/min離心2 min,取1 μL上清液涂靶板,干燥后加1 μL基質(zhì)液,待基質(zhì)液干燥后上機(jī)檢測(cè)。鑒定結(jié)果第一位為巴西諾卡菌,分?jǐn)?shù)1.81,結(jié)果為屬置信。

2.1.416S rRNA基因測(cè)序 采用煮沸法提取DNA模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系50 μL:正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)各2 μL,DNA 模板1 μL,2× Accurate Taq Master Mix dye plus(湖南艾科瑞生物工程有限公司)25 μL,RNase free water 20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,32個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸7 min,-4 ℃保存。將得到的PCR產(chǎn)物送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和純化后測(cè)序,測(cè)得的正向序列和反向序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接,得到長(zhǎng)度為1 357 bp的16S rRNA基因序列,將序列上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析,與該分離株序列相似度最高的菌株為北京諾卡菌DSM 44636(99.63%),登錄號(hào)為NR_118618.1。

2.2治療經(jīng)過(guò) 患者在原有頭孢他啶治療的基礎(chǔ)上,予以口服復(fù)方磺胺甲噁唑片(0.96 g,每天2次),經(jīng)過(guò)8 d的綜合治療,癥狀明顯好轉(zhuǎn),于2021年12月8日辦理帶藥出院。

3 討 論

北京諾卡菌于2001年由我國(guó)學(xué)者在北京西山土壤中分離發(fā)現(xiàn)[3]。2004年KAGEYAMA等[4]報(bào)道,通過(guò)對(duì)450株臨床分離的諾卡菌菌株進(jìn)行分類學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)其中有18株是北京諾卡菌,這是北京諾卡菌可引起人類感染的首次報(bào)道。諾卡菌屬于條件致病菌,感染好發(fā)于免疫力低下人群,但也可以在正常免疫宿主中發(fā)病,尤其是伴有慢性阻塞性肺氣腫、支氣管擴(kuò)張等肺部基礎(chǔ)疾病的患者[5]。支氣管擴(kuò)張患者氣道防御功能受損,分泌物排出受阻,相比于健康人更容易發(fā)生感染[6],本例患者可能正是由于支氣管擴(kuò)張而繼發(fā)北京諾卡菌感染。肺部是諾卡菌感染的主要部位,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是最常見的播散部位,它還可引起皮膚和軟組織感染、肌肉膿腫和眼部感染[7]。肺諾卡菌病患者臨床表現(xiàn)沒(méi)有特異性,多數(shù)表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困難等癥狀,影像學(xué)也需與肺結(jié)核、肺部惡性腫瘤和肺真菌病等疾病鑒別診斷[8]。

病原學(xué)檢查是診斷諾卡菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床工作中,革蘭染色鏡下找到細(xì)長(zhǎng)絲狀、形似串珠、分枝樣排列的革蘭陽(yáng)性桿菌,弱抗酸染色陽(yáng)性,應(yīng)考慮諾卡菌感染的可能性。本例患者痰標(biāo)本革蘭染色鏡下找到可疑細(xì)菌形態(tài),為病原菌鑒定提供了方向,確診諾卡菌感染的時(shí)間大大縮短。實(shí)際上由于口腔正常菌群及一些呼吸道定植菌的存在,且諾卡菌的生長(zhǎng)周期長(zhǎng),痰標(biāo)本分離培養(yǎng)時(shí)往往容易出現(xiàn)漏檢。故懷疑諾卡菌感染時(shí),最好留取肺泡灌洗液、氣管鏡標(biāo)本等高質(zhì)量標(biāo)本,如條件不允許,也盡量留取深部痰標(biāo)本,并將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),一般至少培養(yǎng)2周[1]。目前鑒定諾卡菌最常用的方法為MALDI-TOF MS技術(shù)和基因測(cè)序。MALDI-TOF MS是基于不同微生物蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比差異,將單個(gè)菌株的蛋白指紋圖譜信息與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)分析,得到鑒定結(jié)果。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用,但受限于廠家自建的商品化數(shù)據(jù)庫(kù),廠家提供的數(shù)據(jù)庫(kù)包含的菌株有限,且大多為模式菌株,缺少足夠的臨床菌株蛋白指紋圖譜,對(duì)少見諾卡菌的鑒定結(jié)果不理想,由于質(zhì)譜儀自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏北京諾卡菌的蛋白指紋圖譜信息,所以本例北京諾卡菌無(wú)法得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果?；驕y(cè)序是通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因序列,將得到的序列信息與已知的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析得到鑒定結(jié)果,最常用的是16S rRNA基因測(cè)序。16S rRNA序列存在高度保存和變異的區(qū)域,是穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記,可將諾卡菌鑒定至種水平,但也無(wú)法區(qū)分親緣關(guān)系非常接近的諾卡菌。有文獻(xiàn)指出hsp65、recA1、gyrB和rPoB基因比16S rRNA在諾卡菌中具有更高的基因序列多態(tài)性,可彌補(bǔ)16S rRNA基因測(cè)序鑒定諾卡菌的不足[9]。

目前臨床上治療諾卡菌感染首選磺胺類藥物,常用復(fù)方磺胺甲噁唑進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療。近年來(lái)隨著諾卡菌檢出率的提高,磺胺類耐藥率也呈升高趨勢(shì)。有文章指出,諾卡菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥情況存在差異,受地理因素及不同醫(yī)院抗菌藥物使用情況的影響,不同種諾卡菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性也存在差異,建議將諾卡菌鑒定至種水平[10]。HUANG等[11]通過(guò)研究國(guó)內(nèi)8家三甲醫(yī)院共53株諾卡菌對(duì)常見抗菌藥物的敏感性,發(fā)現(xiàn)諾卡菌對(duì)阿米卡星、亞胺培南和利奈唑胺高度敏感,或許可以作為國(guó)內(nèi)諾卡菌感染的經(jīng)驗(yàn)性治療藥物。肺諾卡菌病治療時(shí)間較長(zhǎng),一般需要3～6個(gè)月,如感染累及中樞神經(jīng)系統(tǒng),則需延長(zhǎng)療程,至少1年。支氣管擴(kuò)張合并諾卡菌感染患者預(yù)后一般較好,免疫缺陷患者合并感染后預(yù)后差,應(yīng)延長(zhǎng)治療時(shí)間,防止復(fù)發(fā)[12]。

綜上所述,諾卡菌感染臨床特征無(wú)特異性,確診依賴于病原學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)可疑鏡下形態(tài)應(yīng)延長(zhǎng)標(biāo)本培養(yǎng)時(shí)間,諾卡菌的鑒定可采用MALDI-TOF MS技術(shù)和基因測(cè)序方法,臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提高對(duì)諾卡菌的鑒定能力,為臨床診斷諾卡菌感染提供依據(jù)。