張海玲　許玉紅　馬麗聰　夏巖石　李榮華　黃依琳　周子苑　肖建旺　袁清華　趙偉才　郭培國

摘要：為探尋一種快速有效的煙草青枯病苗期抗性鑒定方法，以紅花大金元、青梗、長脖黃和 D101等4個(gè)煙草品種為材料，在水培條件下采用傷根和不傷根法進(jìn)行青枯菌侵染接種，依據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行抗病性鑒定。結(jié)果顯示，水培條件下采用傷根和不傷根接種法，接種后7～10 d 便可判斷出各品種的抗性，結(jié)果為 D101中抗、長脖黃高感、紅花大金元高感或感病、青梗感病，與傳統(tǒng)盆栽傷根灌菌接種法的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，而盆栽傷根灌菌接種法則需3～4周。本研究建立的水培接種法可快速、高效準(zhǔn)確鑒定和評(píng)價(jià)煙草苗期青枯病抗性。

關(guān)鍵詞：煙草青枯?。凰?；抗病性；鑒定

中圖分類號(hào)： S435.72?????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）01-0071-06

A Hydroponic Inoculation Method for Rapid and Efficient Evaluation of Tobacco Resistance to Bacterial Wilt Disease at Seedling Stage

ZHANG Hailing1， XU Yuhong1， MA Licong1， XIA Yanshi1， LI Ronghua1， HUANG Yilin1，ZHOU Ziyuan1， XIAO Jianwang1， YUAN Qinghua2， ZHAO Weicai3， GUO Peiguo1*

（1. School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou 510006， China;2. Crop Research Institute， Guangdong Academy ofAgricultural Sciences， Guangzhou 510640， China;3. Guangdong Research Institute of Tobacco Sciences， Shaoguan， Guangdong512400， China）

Abstract： In order to develop a rapid and effective method for resistance evaluation of tobacco bacterial wilt disease （BWD） at seedling stages， four tobacco varieties including Honghuadajinyuan， Qinggeng， Changbohuang and D101 were selected as materials in this study， and their BWD resistance or susceptibility were evaluated based on the disease index after inoculation of Ralstonia solanacearum? with? root-undamaged? and? root-damaged? methods? in? a? hydroponic? system. The? results? showed? that? the? BWD resistance/susceptibility for cultivars could be identified at the 7 or 10 days after inoculation by both root-damaged and undamaged inoculation methods， respectively. D101 was middle resistant， Changbohuang was highly susceptible， Honghuadajinyuan was highly susceptible or susceptible， and Qinggeng was? susceptible. These results were basically consistent with the resistance evaluation obtained by a traditional root-damaged inoculation method in pot culture experiment， which needed 3 to 4 weeks. These results indicated that the hydroponic inoculation method established in this study was a rapid， efficient and accurate method for evaluation of tobacco BWD resistance/susceptibility at seedling stages.

Keywords： tobacco bacterial wilt disease; hydroponics; disease resistance; evaluation

煙草青枯病是由青枯菌（ Ralstonia? solanacearum）引起的一種土傳性細(xì)菌病害，該病害的隱秘性、爆發(fā)性和傳播性極強(qiáng)，一旦爆發(fā)，將降低煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，給煙草生產(chǎn)帶來不可估量的損失[1]。目前國內(nèi)外主要采用農(nóng)業(yè)、生物和化學(xué)等方法防控青枯病，但防控效果欠佳[2]，而選育抗病品種是防治青枯病發(fā)生的最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑[3]。

準(zhǔn)確有效地鑒定煙草材料的抗病性對選育抗病品種至關(guān)重要。目前，煙草青枯病的抗性鑒定主要分為田間鑒定和苗期鑒定[4]。田間鑒定能較好地評(píng)價(jià)煙草材料的青枯病抗性，但易受到生態(tài)、氣候、區(qū)域分布和其他病害干擾等因素的影響，且存在工作量大、耗時(shí)長和操作繁瑣等不足[5-6]。苗期鑒定常采用傳統(tǒng)的盆栽試驗(yàn)進(jìn)行青枯菌接種[7]，但抗病性評(píng)價(jià)周期較長，一般需1個(gè)月左右[8]。目前我國普遍采用煙草漂浮育苗，劉勇等[9]建立了塑料大棚內(nèi)漂浮育苗水培接種法，該方法雖能有效避免土培煙苗再移植盆栽等復(fù)雜繁瑣的操作，但存在漂浮池面積較大青枯菌難以均勻分布等問題；范江等[10]采用塑料大棚內(nèi)漂浮育苗水培接種法對47個(gè)煙草品種進(jìn)行青枯病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)鑒定結(jié)果受季節(jié)影響，且易受其他病害干擾。

據(jù)此，本研究在前人[9-10]研究的基礎(chǔ)上，參考番茄[11]、茄子[12]和馬鈴薯[13]等植物開展的青枯病抗性鑒定方法，應(yīng)用水培技術(shù)，采用傷根和不傷根法在煙草苗期進(jìn)行青枯菌接種，以期建立一種適用于溫室和人工氣候箱的小型、易移動(dòng)且快速有效的煙苗青枯病抗性鑒定評(píng)價(jià)體系。

1材料與方法

1.1供試材料

供試煙草品種為 D101、青梗、紅花大金元和長脖黃，由廣東省煙草科學(xué)研究所提供。其中，D101為青枯病抗病性較強(qiáng)的品種，青梗、紅花大金元和長脖黃為易感青枯病的煙草品種[14-15]。

1.2供試培養(yǎng)基

參照譚茜等[16]采用的適宜青枯菌生長的細(xì)菌瓊脂葡萄糖（BG）培養(yǎng)基，配方如下：酵母提取物1.0 g/L、酪蛋白氨基酸1.0 g/L、細(xì)菌蛋白胨10 g/L、瓊脂15 g/L、葡萄糖5 g/L 。加入1%的2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液使其終濃度為0.005%，即為 TTC 選擇性平板。

1.3病原菌的分離與鑒定

2021年7月，收集廣東省南雄市古市鎮(zhèn)溪口村呈典型青枯病癥狀的煙株，稱取約1 g 病健交界處的維管束組織，置于30 mL 的滅菌水中浸泡20min，蘸取浸出液在 TTC 平板上劃線分離，于30 C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

參考已報(bào)道的鑒定青枯病病原菌的3個(gè)特異性 PCR 引物：759F/760R 、fliC-F/R 和 pehA#3/6[17-19]（表1），進(jìn)行青枯菌的 PCR 鑒定。25?L 的 PCR 反應(yīng)體系包含 ddH2O 9.5?L ，2×Taq? PCR? Master Mix （諾唯贊生物科技股份有限公司）12.5?L，青枯菌菌液模板1?L，每對引物（10?mol/L）分別為1?L。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 C預(yù)變性5 min ，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)[95 C變性30 s ，59 C （fliC-F/R 和pehA#3/6）或60 C （759F/760R）退火1 min，72 C 延伸2 min]，最后72 C延伸10 min。

1.4水培體系的構(gòu)建

1.4.1水培設(shè)備所使用的水培設(shè)施主要包括：水培箱（長×寬×高41 cm×24 cm×14 cm ）、定植籃（長×寬×高1.7 cm×3.4 cm×3.5 cm ）、氣泵（SY-Q01）和曝氣石等。

1.4.2水培煙苗煙草種子消毒后，在26 C人工氣候箱催苗培養(yǎng)，待煙苗長至十字葉期移入定植籃，并置于含有 Hoagland 營養(yǎng)液的水培箱中；每一個(gè)水培箱內(nèi)放置一個(gè)爆氣石進(jìn)行增氧型水培，每7天更換1次營養(yǎng)液。

1.4.3水培接種將保藏的菌種在 TTC 平板上復(fù)蘇，挑取青枯菌的單菌落在 LB 溶液中擴(kuò)繁48 h，在4800 r/min 下離心20 min 收集菌體；用滅菌水調(diào)配好的 Hoagland 營養(yǎng)液懸浮菌體，濃度約為1×108 cfu/mL[20]，每一個(gè)水培箱中注入7 L 的菌懸液。

不傷根試驗(yàn)處理，將4～6葉期煙苗根部置于盛有1×108 cfu/mL 的青枯病菌懸液的水培箱中，水培接種兩周左右；傷根試驗(yàn)處理，用無菌剪刀在4～6葉期煙苗主根的根尖處剪掉1 cm，再置于上述水培箱中水培接種兩周左右。

傷根和不傷根接種試驗(yàn)，每個(gè)品種均選用12株煙苗，重復(fù)3次。水培箱置在溫度30 C、濕度80%、光周期16 h/d 的人工氣候箱中。

1.5盆栽接種

采用傷根灌菌法[21]對煙苗傷根，每株接種菌液10 mL，以無菌水為空白對照，每個(gè)品種均選用10株煙苗，重復(fù)3次。設(shè)置人工氣候箱溫度為30 C、80%濕度、光周期16 h/d。

1.6病情調(diào)查與抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照標(biāo)準(zhǔn) GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》進(jìn)行病情調(diào)查，采用 Excel 2010和 SPSS 26.0整理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析。參照 GB/T 23224—2008《煙草品種抗病性鑒定》進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)，在感病對照品種長脖黃的病情指數(shù)達(dá)到80以上時(shí)[10]，依據(jù)各品種病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果，按評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)值判斷其抗病性強(qiáng)弱（表2）。

2結(jié)果

2.1供試煙草青枯病菌的分離篩選

蘸取1?L 的病株浸出液，在 TTC 平板上劃線分離，待長出形態(tài)不一的單菌落（圖1A），挑取疑似青枯菌形態(tài)的單菌落繼續(xù)分離。經(jīng)純化后，供試菌株的單菌落為不規(guī)則圓形，中央為粉色，邊緣為乳白色，且具有較強(qiáng)的流動(dòng)性（圖1B ）。

2.2煙草青枯病病菌的 PCR 鑒定

采用已報(bào)道鑒定青枯菌的3對引物組合（759F/760R 、flic-F/R 、pehA#3/6）對初步篩選出的菌株進(jìn)行 PCR 鑒定（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3對引物均能在待測的菌株中擴(kuò)增出特異性條帶，大小分別約為281、400和504 bp，與前人[17-19]報(bào)道的青枯菌特征擴(kuò)增片段的大小一致，故判定從煙草感病材料中分離篩選出的菌株為青枯病病菌。

2.3煙草青枯病病原菌的致病性

對水培煙苗（4～6葉期）接種分離出的青枯菌，接種后的第3天，煙株有1片葉開始出現(xiàn)半邊萎蔫（圖3A）；隨著病情的加重，煙株一側(cè)的葉片萎蔫，呈典型的“半邊瘋”癥狀[22]（圖3B）；發(fā)病后期，整株葉片全部凋萎且莖部出現(xiàn)明顯的黑色條斑（圖3C ）；而未接種青枯菌的對照則正常生長（圖3D ）；選取病株莖部流溢的乳白色懸浮液（即菌膿）為模板，以青枯菌種的特異性引物組合759F/760R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，可檢測到281 bp 的特征條帶（圖3E ），而對照則無此條帶。這些結(jié)果表明，分離出的病原菌可侵染煙苗，且具較強(qiáng)的致病力，導(dǎo)致煙苗出現(xiàn)典型的青枯病癥狀。

2.4水培傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

供試的4個(gè)煙草品種水培煙苗剪除根尖1 cm 后，接種青枯病病原菌。在接種后的第3天，長脖黃、紅花大金元和青梗3個(gè)品種，已有部分煙株出現(xiàn)半邊葉片萎蔫的發(fā)病癥狀但仍為綠色；而 D101葉片只有零星病癥，且癥狀較輕（表3）。接種后第5天，4個(gè)煙草品種的感病表型較為明顯，其中長脖黃、紅花大金元和青梗的葉片均萎蔫下垂，病指明顯上升，但 D101的發(fā)病相對較緩。在接種后的第7天，4個(gè)品種的發(fā)病率均大幅度增加，伴隨有葉片黃化，部分煙株莖稈上出現(xiàn)黑色條斑，甚至蔓延至煙株頂部繼而枯死；長脖黃、紅花大金元和青梗3個(gè)品種與D101的病情指數(shù)差異顯著，其抗性等級(jí)評(píng)價(jià)分別屬于高感、高感、感病和中抗。說明水培傷根法僅需7 d 便可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

2.5水培不傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

由表4可知，4個(gè)煙草品種的病情指數(shù)在接種后的前3天無顯著差異。接種后第5天，長脖黃、紅花大金元和青梗的病癥逐漸加重，病情指數(shù)增加較快，D101的下部葉片亦開始出現(xiàn)輕度萎蔫癥狀。接種后第7天，感病對照長脖黃的病情指數(shù)大幅度上升，紅花大金元和青梗次之， D101的病情指數(shù)最低。接種后第10天，紅花大金元和長脖黃的葉片明顯黃化與枯萎，青梗病癥加重亦有枯萎現(xiàn)象，而 D101的葉片只出現(xiàn)輕微發(fā)病癥狀；依病情指數(shù)，長脖黃、紅花大金元、青梗和 D101的抗性等級(jí)分別屬于高感、感病、感病和中抗。說明水培不傷根法只需10 d 就可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

2.6盆栽傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

為檢測水培法接種青枯菌鑒定煙苗青枯病抗病性的可應(yīng)用性，采用傳統(tǒng)的土壤盆栽傷根灌菌法進(jìn)行比較試驗(yàn)。由表5可知，在接種后的前10天，4個(gè)煙草品種的病情指數(shù)呈緩慢上升的趨勢。在接種后的第15天，青梗和紅花大金元的病情指數(shù)急劇上升，有明顯萎蔫與黃化的葉片，長脖黃的病情指數(shù)次之，而 D101病指上升較緩慢。當(dāng)接種時(shí)間延長至第21天，長脖黃、紅花大金元和青梗的病指明顯上升，有較多葉片枯萎，莖稈上的黑色條斑蔓延至葉柄和煙株頂部，尤其青梗病情表現(xiàn)最重，多數(shù)葉片干枯壞死，有的煙株自下而上枯萎至死亡。以青梗為感病對照，依據(jù)病情指數(shù)，4個(gè)煙草品種的抗性等級(jí)分別是青梗為高感、紅花大金元和長脖黃為感病， D101為抗病。此外，當(dāng)接種時(shí)間至第30天，以長脖黃為感病對照，依據(jù)病情指數(shù)，紅花大金元、青梗與長脖黃的抗性級(jí)別均為高感，而 D101仍屬于抗病等級(jí)。說明盆栽傷根灌菌法需3～4周才可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

3討論

植物青枯病抗病性是植物與青枯菌在一定環(huán)境條件下相互作用的結(jié)果，而在不同環(huán)境條件下進(jìn)行青枯病抗病性鑒定試驗(yàn)，抗病性評(píng)價(jià)效果不盡相同[23]。目前常見青枯菌的接種方法有葉片注射法[24]、傷根灌菌法[25]、灌根法[26]等。在自然環(huán)境條件下，青枯菌一般可從新生的側(cè)根和根尖處或植株傷口處入侵[27]，因而，多數(shù)研究常采用傷根灌菌法和灌根法。其中，傷根灌菌法常用于煙草[28]等植物的青枯病抗病性鑒定，且效果相對穩(wěn)定。

本研究采用煙草水培傷根法和不傷根法接種青枯菌，均可導(dǎo)致葉片枯萎、黃化且莖部一側(cè)出現(xiàn)黑色條斑，甚至蔓延到葉柄等部位。以上癥狀作為本研究煙苗感染青枯病的典型特征，與番茄[29]在水培條件下接種青枯菌所表現(xiàn)的青枯病癥狀相同，亦與本研究的煙草盆栽傷根灌菌法所觀察到煙株發(fā)病表型一致。針對4個(gè)煙草品種采用的水培傷根法、水培不傷根法及盆栽傷根灌菌法，接種青枯菌鑒定青枯病抗性的結(jié)果基本一致，D101均具有較強(qiáng)的青枯病抗性，其余3個(gè)品種的青枯病抗性基本上均表現(xiàn)為易感青枯病。這些結(jié)果表明該煙草水培接種體系是一種鑒定煙草青枯病抗性行之有效的方法。

在選用4個(gè)煙草品種煙苗水培接種青枯菌的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)傷根接種法導(dǎo)致青枯菌侵染煙苗的速度稍快于不傷根法；在接種后第7天，感病對照品種長脖黃病情指數(shù)超過80，達(dá)到高感水平；而不傷根接種法煙草青枯病的發(fā)病速度則相對較緩，接種后第10天長脖黃的病情指數(shù)值才達(dá)到80以上，說明傷根接種法有利于加快青枯病病原菌的入侵與定殖，這與 WANG 等[30]研究的馬鈴薯水培接種青枯菌鑒定品種抗性所得的結(jié)果一致；而采用盆栽傷根灌菌法接種煙苗，易感對照品種長脖黃在接種后4周，病指才達(dá)到80以上，表明該接種方法煙苗青枯病的發(fā)病速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水培傷根和不傷根的接種方法。

水培法接種青枯菌所需水培設(shè)施簡便，鑒定試驗(yàn)可在溫室或人工氣候箱里完成，不受季節(jié)影響，一年可開展多次，方法易于操作[31-33]；與土壤盆栽或田間的青枯病抗性鑒定方法相比，青枯菌在水培條件下能均勻地接觸到根系，減少了試驗(yàn)誤差及避免田間土傳病害的干擾，提高了抗病性鑒定的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[32-33]；同時(shí)，水培法接種青枯菌，青枯病發(fā)病迅速，抗性鑒定需時(shí)短而快速[33]。因此，本研究建立的煙苗水培傷根或不傷根法接種青枯菌鑒定煙草材料抗病性的體系，是一種簡捷、準(zhǔn)確有效和快速的體系。

4結(jié)論

本研究建立了一種鑒定煙草苗期青枯病抗性的水培接種法，利用該方法鑒定評(píng)價(jià)了4個(gè)煙草品種的青枯病抗性，在接種后7～10d 就可判斷出各品種的抗性，與傳統(tǒng)盆栽傷根灌菌接種法需要3～4周才能獲得的鑒定結(jié)果基本一致，表明所建立的水培接種法是一種快速和準(zhǔn)確有效鑒定煙草材料青枯病抗性的方法。

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