梅超　余進(jìn)德　隋文靜　張夢(mèng)秋　楊俊聰　陳玉惠　李靖

摘要：從感石楠葉銹病病菌的球花石楠葉片上獲得的3株重寄生菌SYC4、SYC23和SYC63，為確定其分類地位及在銹菌孢子誘導(dǎo)下菌絲體基因的表達(dá)情況，采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子序列分析將菌株鑒定到種，并對(duì)重寄生效果較好的菌株SYC63進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明，經(jīng)鑒定SYC4、SYC23為Cladosporium anthropophilum，SYC63為枝狀枝孢菌（C. cladosporioides）。對(duì)菌株SYC63獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與不同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中有11 002個(gè)基因被注釋到，除其他物種外，枝孢菌SYC63與南極枝孢菌（Rachicladosporium antarcticum）有2 130個(gè)基因相似，所占物種匹配最高；在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到8 088個(gè)基因，基因數(shù)量最多的是生物學(xué)過(guò)程，其次是分子功能和細(xì)胞組分。在差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)，與重寄生相關(guān)的凝集素、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路及抗性次級(jí)代謝物有關(guān)的基因經(jīng)銹菌孢子誘導(dǎo)后顯著上調(diào)表達(dá)。以上研究為重寄生枝孢菌在植物病害的生物防治應(yīng)用中提供了菌株來(lái)源，并為其重寄生機(jī)制的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：重寄生；分子鑒定；石楠銹孢銹菌；枝孢菌；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：S476.1；S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0019-11

在自然界中，重寄生（mycoparasitism）在銹病中普遍存在，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系使寄主植物、病原菌與重寄生菌形成一條完整的食物鏈［1］。因而利用重寄生菌防治寄主植物的病原菌，是保護(hù)生物多樣性和植物病害生物防治方面的新途徑［2］。目前，已有大量研究利用重寄生菌防治銹病，例如從花棒銹病菌［Uromyces onobrychidis （Desm.） Lev.］［3］、樟子松皰銹病病原菌松芍柱銹菌［Cronartium flaccidum （Alb.et Schw.） Wint.］［4］、小駁骨銹?。?］和茶藨生柱銹菌（Cronartium ribicola J.C.Fischer）［6］等中分離得到的重寄生菌株在銹病中表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

園林綠化樹(shù)種石楠的葉銹病是因石楠銹孢銹菌（Aecidium pourthiaea）［現(xiàn)被更正為文山春孢銹菌（Aecidium wenshanese）］寄生而致病的，其重寄生菌主要包括擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）、枝孢屬（Cladosporium sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）及木霉屬（Trichoderma sp.）等多種真菌［7-9］。1815年，Link建立和描述了枝孢屬，現(xiàn)在它主要分為三大復(fù)合體，即枝狀枝孢（C. cladosporioides）、多主枝孢（C. herbarum）和球孢枝孢（C. sphaerospermum），已知的枝孢菌有一半以上屬于C. cladosporioides復(fù)合體［10］。高度寄生的枝孢菌形態(tài)特征主要體現(xiàn)在無(wú)性形態(tài)上，由于形態(tài)鑒定是一個(gè)難點(diǎn)，但使用形態(tài)及分子聯(lián)合的方法，200個(gè)物種被重新定義，具有較清晰的形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育界限［10］。分子分析已成為鑒定枝孢屬種的有效方法。

近幾年，對(duì)于重寄生作用機(jī)制已經(jīng)從生理生化及分子水平上展開(kāi)了相關(guān)研究。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，重寄生作用機(jī)制主要包括酶和毒素2個(gè)方面，其中酶方面指的是重寄生菌可產(chǎn)生降解寄主真菌細(xì)胞壁的酶，而毒素是重寄生菌與寄主菌相互作用產(chǎn)生的抗菌次級(jí)代謝物，能殺死寄主真菌［7，11-13］。隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組、轉(zhuǎn)錄組及代謝組學(xué)測(cè)序等已被廣泛應(yīng)用于對(duì)重寄生菌的研究之中。轉(zhuǎn)錄組是指一個(gè)細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)期或生長(zhǎng)環(huán)境下，自身基因的表達(dá)情況不完全相同，具有特定的時(shí)間性和空間性特征［14］。范海娟通過(guò)不同誘導(dǎo)物對(duì)哈茨木霉ACC30317進(jìn)行誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)有311條Unigene基因與重寄生機(jī)制相關(guān)，認(rèn)為該菌的生防機(jī)制是以重寄生為主［15］。Reithner等同樣利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段，分析發(fā)現(xiàn)重寄生菌木霉IMI206040與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）相互作用后參與細(xì)胞壁降解的各類基因協(xié)同轉(zhuǎn)錄［16］。

實(shí)際上多種重寄生菌，特別是枝孢屬和銹生座孢屬（Tuberculina sp.）的真菌已經(jīng)克服寄主障礙，顯示出寄生物的進(jìn)化，這將有利于生防菌的開(kāi)發(fā)與利用［17］。筆者所在課題組前期從患石楠銹孢銹菌的球花石楠葉片上分離得到3株重寄生菌，其具有破壞銹孢子壁，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外溢而使銹孢子死亡的重寄生能力，而對(duì)寄主植物是安全的［7］。對(duì)重寄生效果最好的菌株SYC63進(jìn)行了基因組測(cè)序并初步分析了重寄生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其真菌細(xì)胞壁降解酶類中的幾丁質(zhì)酶（GH18、GH20家族）基因、β-1，3-葡聚糖酶（GH17、GH64和GH81家族）基因在經(jīng)銹菌孢子壁誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上調(diào)［18］。本研究擬將3株枝孢菌鑒定到種，同時(shí)利用課題組前期獲得的枝孢菌SYC63轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為促進(jìn)枝孢菌SYC63重寄生作用機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)時(shí)間為2020年9月至2021年12月。試驗(yàn)地點(diǎn)位于云南省西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

試驗(yàn)菌株為編號(hào)是SYC4、SYC23和SYC63的3株重寄生菌，于2012年9月分離自患石楠葉銹病的球花石楠葉片上，并保存于4 ℃［7］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枝孢菌的鑒定

對(duì)分離得到的3株重寄生菌采用PDA培養(yǎng)基［6］進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)常規(guī)形態(tài)學(xué)方法并結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行重寄生菌的種鑒定。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，主要是記錄菌株培養(yǎng)性狀、分生孢子的形態(tài)及大小等。分子鑒定參照隋國(guó)強(qiáng)等的方法［19］，提取菌株DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訧TS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因；以EF-1-F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF-1-R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）為引物擴(kuò)增翻譯延伸因子1-α基因；以ACT-F（5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′）/ACT-R（5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′）為引物擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白基因［20-22］。擴(kuò)增產(chǎn)物純化和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)測(cè)序所得的3個(gè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，確定最可能的近緣類群。然后進(jìn)行基因序列查找及多序列拼接，再查閱文獻(xiàn)下載已報(bào)道的近緣種基因序列片段，將基因序列數(shù)據(jù)集通過(guò)MAFFT（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，再利用BioEdit手工編輯并將聯(lián)合基因序列校正，以fasta格式的組合數(shù)據(jù)集在ClustalX中存為nexus格式。利用PAUP4.0b10軟件，輸入程序，以非加權(quán)最大簡(jiǎn)約（MP）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［20-21］。最后結(jié)合形態(tài)觀察的菌落形狀、顏色和分生孢子形態(tài)特征等，對(duì)比Bensch等研究［23］中菌株形態(tài)特征，通過(guò)分子鑒定結(jié)合形態(tài)鑒定將3株重寄生菌鑒定到種。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

在前期研究中參照周航等的銹菌孢子壁誘導(dǎo)方法［24］，采集西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園內(nèi)的石楠葉銹病病菌銹孢子，對(duì)重寄生效果較好的菌株SYC63進(jìn)行誘導(dǎo)后提取菌絲體RNA，檢測(cè)合格的RNA用于文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到整潔數(shù)據(jù)（Clean Data），與指定的參考基因組（枝孢菌SYC63：GCA_022457075.1）進(jìn)行序列比對(duì)，得到映射數(shù)據(jù)（Mapped Data），進(jìn)行插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估；根據(jù)基因在不同樣品中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等表達(dá)水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重寄生菌的鑒定

對(duì)分離得到的3株重寄生菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、翻譯延伸因子（EF）-1和肌動(dòng)蛋白（ACT）基因片段進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，利用單基因及多基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖1）顯示：3株重寄生菌SYC4、SYC23和SYC63聚在同一個(gè)分支上，支持率為66%，其中SYC4和SYC23在分支上的距離相對(duì)較近，SYC63與兩者相距較遠(yuǎn)，同時(shí)三者還與枝孢屬的已知物種C. anthropophilum、C. cladosporioides、角枝孢菌（C. angustisporum）、黑星病菌（C. cucumerinum）等聚在一支，不能夠說(shuō)明其親緣關(guān)系，無(wú)法單以此系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)作為鑒定種的依據(jù)，還需進(jìn)一步證明。

基于3個(gè)基因片段聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）顯示，SYC4與SYC23聚在同一個(gè)分支，支持率為97%，又與C. anthropophilum在同一個(gè)大支上，支持率為100%，表明SYC4與SYC23親緣關(guān)系較近，且兩者與C. anthropophilum的親緣關(guān)系較近；SYC63與C. cladosporioides的2個(gè)菌株（CPC 14021和CPC 14024）在同一個(gè)大分支上，支持率為97%，而C. cladosporioides的2個(gè)菌株又聚在同一支，支持率為96%，說(shuō)明SYC63與 C. cladosporioides 的親緣關(guān)系較近。再根據(jù)菌株的菌落形態(tài)、分生孢子的大小、孢子顏色等形態(tài)特征進(jìn)行對(duì)比，最終鑒定SYC4、SYC23為C. anthropophilum，SYC63為枝狀枝孢霉（C. cladosporioides）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 RNA提取與測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

分別對(duì)對(duì)照組（SYC63-C）和銹孢子壁處理組（SYC63-S）的6個(gè)菌絲體提取RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)， 其D260 nm/D280 nm分別為1.76、1.77、1.90、2.19、2.03、2.07，說(shuō)明所提取的RNA純度高，雜質(zhì)污染較少，樣品質(zhì)量能滿足建庫(kù)要求，可進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。利用Illumina平臺(tái)對(duì)本研究的6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得41.78 GB測(cè)序數(shù)據(jù)，各樣品總堿基數(shù)（Clean Reads）均達(dá)到 6.48 GB，Q30堿基百分比在94.18%及以上。分別將各樣品的Clean Reads與枝孢菌SYC3的基因組進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)比對(duì)效率為92.06%～95.93%（表1），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

將參考基因組的12 327個(gè)基因比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量中，結(jié)果（表2）顯示，經(jīng)銹孢子壁誘導(dǎo)處理后，有95.80%的基因表達(dá)，表達(dá)豐度分布在中高表達(dá)（10

2.2.2 Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

通過(guò)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋，共有11 002個(gè)基因被注釋到，統(tǒng)計(jì)比對(duì)最多的前 9 個(gè)物種，其余劃分到其他（Other）類，物種分布如圖3所示，枝孢菌SYC63與南極枝孢菌（Rachicladosporium antarcticum）的相似基因最多，有2 130個(gè)基因，占19.36%，除其他物種外，所占物種相似性最高；其次與Rachicladosporium sp.有13%的相似基因。此外，與病原真菌Hortaea werneckii、Zasmidium cellare及Venturia nashicola等也有2%～8%[CM（20*2]的相似基因。 值得關(guān)注的是， 有41%的序列屬于其他物種，可能包含了枝孢菌SYC63與大多數(shù)物種不同的、自身特有的基因序列。

2.2.3 KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中枝孢菌SYC63共比對(duì)到4 948個(gè)基因，占總基因的38.4%，可被劃分到25類相應(yīng)的功能中。由圖4可知，數(shù)量最多的功能類別是一般功能預(yù)測(cè)（general function prediction only），其次是翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶（posttranslational modification，protein turnover，chaperones）441個(gè)基因、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（carbohydrate transport and metabolism）370個(gè)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（signal transduction mechanisms）342個(gè)基因。

2.2.4 GO分類

GO數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，旨在建立基因及其產(chǎn)物知識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)詞匯體系，適用于各個(gè)物種。對(duì)枝孢菌SYC63轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行GO功能注釋，共8 088個(gè)基因被注釋到。將基因的功能從細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程等3個(gè)方面進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)后，結(jié)果如表3所示。枝孢菌SYC63編碼的基因主要富集在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程等生物過(guò)程；其次是在催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能中；較少的基因被注釋到細(xì)胞組分中的細(xì)胞主體、胞內(nèi)區(qū)和含有蛋白質(zhì)的復(fù)合體。

2.2.5 差異基因篩選與功能注釋

將差異倍數(shù)（fold change）≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01作為差異表達(dá)基因（DEGs）篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到3 196個(gè)DEGs，其中有1 674個(gè)上調(diào)基因、1 522個(gè)下調(diào)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類注釋，結(jié)果表明注釋數(shù)量最多的生物過(guò)程主要是代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單一生物體過(guò)程及定位；其次是催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能組成；以及膜（membrane）和膜成分（membrane part）等細(xì)胞組分。這與枝孢菌SYC63的GO注釋結(jié)果在整體上是一致的，但經(jīng)銹菌孢子壁誘導(dǎo)后細(xì)胞組分則是富集到細(xì)胞器、膜和膜成分等類別（圖5）。

進(jìn)一步對(duì)1 674個(gè)上調(diào)基因的GO注釋進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在生物學(xué)過(guò)程中，主要富集在幾丁質(zhì)生物合成過(guò)程（chitin biosynthetic process）、肌動(dòng)蛋白絲的過(guò)程（actin filament-based process）及肌動(dòng)蛋白絲的調(diào)節(jié)過(guò)程（regulation of actin filament-based process）等； 而細(xì)胞組分主要是膜，比如高爾基體相關(guān)囊泡（Golgi-associated vesicle）、囊泡外套（vesicle coat）、囊泡膜（vesicle membrane）等類型的基因富集；分子功能也顯示基因主要在幾丁質(zhì)合成酶活性（chitin synthase activity）、鐵結(jié)合（ferric iron binding）及氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）等的類別富集。

分析差異表達(dá)基因在某一通路上是否發(fā)生顯著差異即為差異表達(dá)基因的通路富集分析，選取顯著性Q值最小的前20個(gè)通路進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖6所示，可以看出，差異表達(dá)基因KEGG通路（pathway）數(shù)量最多的是碳水化合物（carbon metabolism），其次是色氨酸代謝（tryptophan metabolism）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解（valine，leucine and isoleucine degradation）及氨基酸糖和核苷酸糖的代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）。表明經(jīng)銹菌孢子壁誘導(dǎo)后差異基因在碳水化合物代謝途徑存在顯著差異，其可能是枝孢菌SYC63重寄生作用的一個(gè)重要組成部分。

2.2.6 重寄生相關(guān)的差異基因分析

凝集素是一種糖結(jié)合蛋白，可以特異地結(jié)合某種單糖或復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)，真菌凝集素是一類主要的凝集素，可以結(jié)合宿主的特定碳水化合物結(jié)構(gòu)，起到識(shí)別和黏附的作用，或作為一種毒性因子在真菌對(duì)捕食者和寄生蟲(chóng)的防御中發(fā)揮作用［25］。枝孢菌SYC63基因組編碼14個(gè)凝集素基因，包括10個(gè)蓖麻毒素B類的凝集素、 2個(gè)類似于伴刀豆蛋白的凝集素、1個(gè)甘露糖結(jié)合凝集素和1個(gè)H型凝集素（表4）。在經(jīng)銹菌孢子誘導(dǎo)后，檢測(cè)到5個(gè)凝集素基因上調(diào)表達(dá)，其中類似于伴刀豆蛋白的凝集素（g4093、g9203）和甘露糖結(jié)合凝集素（g4694）的基因顯著上調(diào)，2個(gè)蓖麻毒素B類的凝集素（g5790、g6964）基因上調(diào)不顯著（圖7）。

其他重寄生或生物防治功能相關(guān)的基因，主要涉及到轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞壁修復(fù)信號(hào)通路（MAPK singal pathway）及與抗生素代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的細(xì)胞色素P450等。枝孢菌SYC63轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋到了87個(gè)P450基因，此外，還有71個(gè)基因在KEGG pathway中注釋為MAPK信號(hào)途徑（ko04011），在經(jīng)銹孢子誘導(dǎo)后分別檢測(cè)到22及15個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因，大部分基因都表現(xiàn)出極顯著（P<0.000 1）上調(diào)（圖8）。

3 討論與結(jié)論

枝孢菌具內(nèi)生、人類致病、植物致病、腐生營(yíng)養(yǎng)和極端環(huán)境生長(zhǎng)等多種生態(tài)適應(yīng)性［10］。已知的大多數(shù)枝孢菌物種是與植物相關(guān)的，常在植物葉片上產(chǎn)生危害且形成病斑。利用重寄生菌專性寄生而減少寄主植物受到的傷害特性，防治植物病害是生物防治的新措施［11，26］。近期的研究也表明，枝孢菌分泌的次生代謝產(chǎn)物在提高植物適應(yīng)新生境能力，免受生物和非生物脅迫方面具有保護(hù)作用，因而作為植物生物刺激劑在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中具有指導(dǎo)意義［27］。

將分子生物學(xué)的方法用于枝孢菌的分類鑒定，利用多基因復(fù)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并結(jié)合形態(tài)學(xué)，解決了形態(tài)特征分類上的難題。目前，枝孢屬真菌的物種鑒定主要基于3種遺傳標(biāo)記，即rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、肌動(dòng)蛋白和翻譯延伸因子（EF-1α）基因的部分片段，前者不能提供良好的物種分辨率，后兩者卻表現(xiàn)出物種間高度的差異［28］。Bensch等利用三者組合對(duì)三大復(fù)合體中的其他類群進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育研究，來(lái)解釋枝孢屬的多樣性和進(jìn)化趨勢(shì)［29］。Iturrieta-González等也利用此系統(tǒng)鑒定了不同環(huán)境來(lái)源中的枝孢菌，并報(bào)道其中發(fā)現(xiàn)的新物種，擴(kuò)大了枝孢菌物種資源［30-31］。此外，也有學(xué)者用ITS和核糖體小亞基（SSU）編碼SSU序列鑒定了香蕉煤污病病原菌為枝狀枝孢霉［32］，為枝孢屬的分子鑒定提供了可供選擇的多個(gè)基因片段。

重寄生是微生物微觀世界中一個(gè)重要現(xiàn)象，了解其發(fā)生機(jī)制可以有效提高對(duì)植物病原體的生物防治。在對(duì)廣譜生防真菌木霉的重寄生機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，其主要是通過(guò)分泌一系列胞壁降解酶如葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和殼聚糖等參與重寄生作用［33］。本研究對(duì)重寄生枝孢菌SYC63利用銹菌孢子壁誘導(dǎo)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)，其在KOG功能中有370個(gè)基因注釋到碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，且受銹菌孢子壁的誘導(dǎo)后差異基因的KEGG通路也顯著富集到該方面，說(shuō)明該菌有較好的碳水化合物代謝能力，其可能是重寄生作用中重要的一部分。

研究表明，木霉的重寄生過(guò)程是復(fù)雜的，除胞壁降解酶外，次級(jí)代謝物、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、熱激蛋白及效應(yīng)因子等也參與了重寄生過(guò)程［34］。凝集素具有獨(dú)特的識(shí)別和可逆結(jié)合特定碳水化合物配體的能力，無(wú)需任何化學(xué)修飾，這一特征使凝集素有別于其他碳水化合物結(jié)合蛋白和酶［35］。通過(guò)對(duì)輪枝菌凝集素（SRL）及其推定的內(nèi)源性受體的研究結(jié)果表明，細(xì)胞壁相關(guān)的凝集素在真菌發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能［36］。據(jù)報(bào)道，一種具有生物活性的向日葵甘露糖結(jié)合凝集素（Helja）參與了植物對(duì)真菌的識(shí)別和防御，其與真菌孢子表面的相互作用穿透質(zhì)膜，也可內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Del Rio等提出它最初是與真菌細(xì)胞壁碳水化合物相互作用，并進(jìn)一步內(nèi)化，通過(guò)被定位到不同的細(xì)胞器，從而激活與細(xì)胞死亡相關(guān)的信號(hào)通路的抗菌機(jī)制［35］。從Parkia platycephala種子中分離純化得到一個(gè)凝集素PPL2，能水解幾丁質(zhì)中連接 2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖單元的β-1，4糖苷鍵，通過(guò)N末端測(cè)序、基因克隆全長(zhǎng)及X射線結(jié)晶學(xué)建立三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該凝集素與GH18家族的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶同源，具有 N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合和幾丁質(zhì)水解酶活性［37］。在本研究中，重寄生枝孢菌SCY63基因組中有14個(gè)凝集素編碼基因，在銹菌孢子誘導(dǎo)后，檢測(cè)到5個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，其中1個(gè)甘露糖結(jié)合凝集素顯著上調(diào)表達(dá)。推測(cè)在重寄生過(guò)程中其可能與真菌細(xì)胞壁表面的碳水化合物結(jié)合產(chǎn)生間接的影響，從而引起細(xì)胞損傷，造成寄主死亡。

MAPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的糖基化狀態(tài)敏感，可調(diào)控胞壁蛋白的表達(dá)并修復(fù)極端環(huán)境下細(xì)胞壁的損傷，保持細(xì)胞壁完整，是脅迫環(huán)境下菌絲體正常生長(zhǎng)的必要信號(hào)途徑，并在生防菌對(duì)病原菌的攻擊以及菌絲形成中起著重要作用［38］。幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，它是由尿苷二磷酸 N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）經(jīng)幾丁質(zhì)合成酶生物合成的，真菌中的細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通?？赡軐?dǎo)致幾丁質(zhì)生物合成途徑的激活［39］。細(xì)胞色素P450可催化某些具有重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)的生物合成，并在次級(jí)代謝產(chǎn)物的修飾中起重要作用，其含量高表明可能存在更多類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物［40］。本研究中，枝孢菌SYC63在經(jīng)銹菌孢子誘導(dǎo)后差異基因中上調(diào)表達(dá)數(shù)量明顯多于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量，進(jìn)一步分析顯示上調(diào)表達(dá)的基因功能主要富集在質(zhì)膜成分和幾丁質(zhì)合成酶活性等功能，同時(shí)MAPK信號(hào)通路基因也顯著上調(diào)表達(dá)。推測(cè)可能是枝孢菌SYC63在接觸病原菌后啟動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)動(dòng)重寄生功能相關(guān)基因或存在不利環(huán)境相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，而MAPK信號(hào)和幾丁質(zhì)合成酶參與合成的幾丁質(zhì)都保持了細(xì)胞壁的完整性，從而有利于寄生菌成功進(jìn)入寄主，完成利于自身的侵染過(guò)程，即重寄生過(guò)程。

本研究利用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終將SYC4、SYC23鑒定為C. anthropophilum，將SYC63鑒定為C. cladosporioide，明確了菌株分類地位；對(duì)菌株SYC63的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與重寄生相關(guān)的基因受銹菌孢子壁誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其可能參與了菌株SYC63重寄生的過(guò)程，為后續(xù)深入研究該菌的重寄生機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)與基因數(shù)據(jù)資源。

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收稿日期：2022-03-09

基金項(xiàng)目：云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)面上項(xiàng)目［編號(hào)：2017FG001（-043）］；中央引領(lǐng)地方科技發(fā)展專項(xiàng)資金（編號(hào)：219001）；云南省教育廳科學(xué)研究基金（編號(hào)：2021Y270）。

作者簡(jiǎn)介：梅 超（1996—），女，云南昭通人，碩士研究生，主要從事資源微生物的開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：1498789618@qq.com。

通信作者：李 靖，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物生理生化研究。E-mail：lijingcas@163.com。