褚慶華 洪娟 鄭曉頡 王茜青△

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200072;2.上海市浦東新區(qū)浦興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科,上海 200129)

脂肪肝是指脂肪在肝內(nèi)的沉積超量,使肝臟細(xì)胞發(fā)生脂肪樣變性的一種疾病,其作為世界第二大肝病,已被公認(rèn)為是隱蔽性肝硬化的一個(gè)重要誘因,并且朝年輕化趨勢(shì)方向發(fā)展[1]。脂肪肝按病因分為非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精性脂肪肝(AFLD),以前者較為常見(jiàn)。目前肝組織活檢病理是此病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),而組織活檢的有創(chuàng)性和取樣局限限制了其臨床應(yīng)用[2]。組織蛋白酶家族史人溶酶體重要水解酶家族,其中組織蛋白酶D(CTSD),在細(xì)胞中發(fā)揮剪切、降解多種蛋白質(zhì)和多肽的作用,并參與免疫調(diào)控進(jìn)程[3]。本文探討酶聯(lián)免疫吸附下血清組織蛋白酶d(CTSD)和細(xì)胞因子對(duì)診斷非酒精性脂肪肝(NAFLD)的臨床觀察。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院及社區(qū)醫(yī)院2019年10月至2022年10月收治的NAFLD患者300例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡18歲以上;脂肪肝患者診斷符合《超聲醫(yī)學(xué)》[3]對(duì)脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn);患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):肝癌,其他病毒性肝炎,遺傳性肝病等疾病;存在脂肪肝之外可能會(huì)對(duì)血脂、肝功能指標(biāo)表達(dá)產(chǎn)生影響的疾病;合并心肺腎等臟器功能及呼吸功能不全;酒精性脂肪肝;智力及精神障礙者;哺乳期、孕期者;生存時(shí)間<6個(gè)月。其中男189例,女111例,年齡32～75歲,平均年齡(53.51±2.64)歲,其中輕度154例,中度97例,重度49例;同期隨機(jī)選取同期健康體檢腹部B超、生化檢查均正常的人群為健康對(duì)照組,共300例,其中男200例,女100例,年齡25～70歲,平均年齡(53.28±3.41)歲。兩組患者一般資料比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法 所有患者于清晨空腹抽取靜脈血5 mL,置于真空無(wú)菌采血管中,以2 500 rmin-1離心10 min,分離血清后取上清置于-20℃冰柜中保存待測(cè),標(biāo)本由專(zhuān)人管理。監(jiān)測(cè)肝功能指標(biāo),包括天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)。血脂指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)。采用(儀器:日立7600全自動(dòng)生化儀),具體方法為:TC采用GPO-POD法、TG選擇酶法;運(yùn)用丙氨酸底物法檢測(cè)ALT,天門(mén)冬氨酸底物法檢測(cè)AST,其余肝功能指標(biāo)采用速率法檢測(cè)。ELISA檢測(cè)試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法,酶標(biāo)儀(450 nm檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片,570 nm或630 nm校正波長(zhǎng)濾光片),從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條,未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)封存于2～8℃;分別將標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中(100 μl/孔),溫育后,加入生物素標(biāo)記抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。經(jīng)過(guò)溫育和洗滌結(jié)合形成的免疫復(fù)合物,去除未結(jié)合的酶,然后加入顯色底物TMB。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子濃度呈正相關(guān)。最后,在450 nm處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD)值,通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CTSD濃度、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6)。

1.3質(zhì)量控制及量化標(biāo)準(zhǔn) 在檢驗(yàn)開(kāi)始前,嚴(yán)格按照儀器自帶的操作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。同時(shí),定期請(qǐng)計(jì)量局前來(lái)對(duì)儀器進(jìn)行測(cè)定,確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。所有工作人員在上崗前均要參加培訓(xùn)并通過(guò)考試。嚴(yán)格掌握各種測(cè)定方法和測(cè)定標(biāo)準(zhǔn),減少測(cè)定誤差。血液標(biāo)本的采集、離心、轉(zhuǎn)運(yùn)、檢測(cè)等均嚴(yán)格按照我院生化室的要求進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1兩組人群的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)情況對(duì)比 NAFLD組血脂指標(biāo)中TG、TC和肝功能指標(biāo)中AST、ALT和GGT、CTSD均高于對(duì)照組,細(xì)胞因子中TNF-α、IL-6同樣高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組人群的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)情況對(duì)比

2.2不同程度NAFLD患者相關(guān)血清指標(biāo)比較 隨著NAFLD病情嚴(yán)重程度的增加,TG、TC、AST、ALT 和 GGT 、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趨勢(shì),各組上述指標(biāo)相比差異有意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同程度NAFLD患者相關(guān)血清指標(biāo)比較

2.3各項(xiàng)指標(biāo)診斷NAFLD的ROC曲線分析 根據(jù)ROC曲線分析顯示,兩項(xiàng)指標(biāo)在NAFLD診斷中以聯(lián)合預(yù)測(cè)診斷的價(jià)值最高,曲線下面積(AUC)(95%CI)為0.765(0.686～0.843);其中CSTD診斷價(jià)值稍高于IL-6,AUC(95%CI)為0.700(0.614～0.787)。二者P值均<0.05,說(shuō)明CSTD與IL-6聯(lián)合的診斷效能最優(yōu)。見(jiàn)圖1。

圖1 各項(xiàng)指標(biāo)診斷NAFLD的ROC曲線

3 討 論

NAFLD是由糖脂代謝紊亂誘發(fā)的以肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積為特征的肝臟疾病[4]。NAFLD早期將對(duì)全身各系統(tǒng)造成影響,多種疾病與NAFLD存在發(fā)病關(guān)聯(lián),現(xiàn)把NAFLD的危害從代謝綜合征擴(kuò)展到全身多系統(tǒng)多疾病[5]。CTSD是一種蛋白質(zhì),在人類(lèi)中由CTSD基因編碼。該基因編碼的是一種溶酶體天冬氨酸蛋白酶,由二硫鍵重鏈和輕鏈組成的蛋白質(zhì)二聚體,都是由一個(gè)蛋白質(zhì)前體產(chǎn)生[6]。組織蛋白酶D是一種天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶,普遍分布在溶酶體中,它的主要功能是降解蛋白質(zhì)和激活溶酶體前室中生物活性蛋白的前體。臨床已有研究證實(shí)其在胃癌、結(jié)腸癌中的應(yīng)用,但在NAFLD中的應(yīng)用報(bào)道極少[7]。

腫瘤壞死因子(TNF),主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬,抗感染引起發(fā)熱,誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成,促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化,是重要的炎癥因子。IL-6是趨化因子家族的一員,是免疫細(xì)胞作用于其它細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì),當(dāng)肝臟受到不同程度的損傷,由于肝臟對(duì)細(xì)胞因子的清除能力下降,使體內(nèi)細(xì)胞因子通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體各個(gè)部位導(dǎo)致IL-6升高。同時(shí)它由核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生,可通過(guò)自分泌旁分泌作用于組織細(xì)胞刺激細(xì)胞生長(zhǎng),促細(xì)胞外基增生參與炎癥。側(cè)面反應(yīng)了它與肝纖維化的程度相關(guān)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著NAFLD病情嚴(yán)重程度的增加,TG、TC、AST、ALT和GGT、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趨勢(shì)(P<0.05),根據(jù)ROC曲線分析顯示,兩項(xiàng)指標(biāo)在NAFLD診斷中以CSTD與IL-6聯(lián)合預(yù)測(cè)診斷的價(jià)值最高,分析其患者水平升高的原因主要為,當(dāng)人體處于高膽固醇環(huán)境下,與膽固醇結(jié)合的溶媒體大量分泌,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)通路紊亂,而CTSD作為溶酶體中主要的水解酶,水平也隨之升高,并定位在細(xì)胞膜附近,這就導(dǎo)致在肝臟發(fā)生脂肪變形時(shí),血清CTSD水平升高[8]。

綜上,血清CTSD和細(xì)胞因子聯(lián)合檢測(cè)可以有效提高預(yù)測(cè)診斷非酒精性脂肪肝的敏感度和特異度,臨床診斷價(jià)值顯著。