李佳思，劉迎慶，張永恒，張迎澳，肖燁子，劉露，余有本

西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100

脫落酸（Abscisic acid，ABA）是一種重要的植物激素，在植物種子休眠、萌發(fā)、生長(zhǎng)、開(kāi)花、果實(shí)成熟等生理活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-5]。同時(shí)，ABA 也是植物中的關(guān)鍵抗逆因子，參與了植物對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程，如植物在遭受干旱[6]、低溫[7]、鹽害[8]、病害[9]等脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)迅速積累ABA，從而誘導(dǎo)一系列依賴(lài)于 ABA 信號(hào)的抗逆基因上調(diào)表達(dá)，引起植物抗逆性的增加[10]。近年來(lái)，大量的研究揭示了植物體內(nèi)ABA 的合成途徑，其中，9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）被鑒定為ABA 合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，它的表達(dá)往往受到逆境脅迫誘導(dǎo)并與植物抗逆性相關(guān)[11-12]。水稻中的研究表明，干旱脅迫能誘導(dǎo)OsNCED5的表達(dá)，從而促進(jìn)ABA 合成，增加了水稻的抗旱性[13]。而抑制GhNCED1會(huì)導(dǎo)致棉花體內(nèi)的ABA 含量降低，增加了棉花對(duì)干旱和鹽脅迫的敏感度[12]。

研究表明，轉(zhuǎn)錄因子可以介導(dǎo)脅迫所誘導(dǎo)的NCED轉(zhuǎn)錄水平變化，一些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)激活NCED的表達(dá)來(lái)增加植物的抗逆性，也有一些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制其表達(dá)從而降低植物的抗逆性。例如，擬南芥AtWRKY57 通過(guò)結(jié)合到AtNCED3的啟動(dòng)子并激活其表達(dá)，促進(jìn)ABA 的積累，提高擬南芥的抗旱性[14]。在鹽脅迫下，水稻OsERF19 可以通過(guò)激活OsNCED5的表達(dá)，進(jìn)而影響水稻體內(nèi)的ABA 含量和耐鹽性[15]。番茄中，bHLH 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子SlBZR1通過(guò)直接激活SlNCED1的表達(dá)來(lái)增加番茄中的ABA 含量以提升番茄的抗寒能力[16]。也有一些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制NCED的表達(dá)從而在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮負(fù)面作用，如水稻OsWRKY67 能抑制OsNCED3和OsNCED4的表達(dá)，過(guò)量表達(dá)OsWRKY67，導(dǎo)致水稻的抗旱性降低[17]。

茶樹(shù)中鑒定了5 個(gè)NCED基因，它們的表達(dá)量在茶葉加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生顯著變化[18-19]。此外，茶樹(shù)NCED成員在茶樹(shù)對(duì)低溫[20]和干旱脅迫[21-22]的響應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，但茶樹(shù)中NCED響應(yīng)脅迫條件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。 本研究通過(guò)對(duì)CsNCED2上游調(diào)控因子進(jìn)行挖掘，并探究它們?cè)诓煌{迫下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步了解CsNCED2響應(yīng)脅迫的轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

試驗(yàn)材料為一年生龍井長(zhǎng)葉無(wú)性系水培苗，培養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室。培養(yǎng)條件為白天25 ℃，晚上22 ℃，自然光照；選取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的茶苗進(jìn)行不同脅迫處理。鹽、干旱處理：將茶苗根部用水洗凈后移入配制好的NaCl（200 mmol·L-1）和20% PEG 6000溶液中分別進(jìn)行高鹽和干旱脅迫；低溫處理：使用光照培養(yǎng)箱進(jìn)行4 ℃低溫脅迫。3 個(gè)處理均在處理后0、1、4、6、8、12、24、48 h 剪取幼嫩葉片，用液氮快速冷凍后保存于-80 ℃冰箱用于提取RNA，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 酵母單雜交文庫(kù)篩選

用課題組前期克隆的CsNCED2的啟動(dòng)子做模板，將-836 至-1415 區(qū)域構(gòu)建至pABAi載體上獲得誘餌載體（引物見(jiàn)表1）。用限制性?xún)?nèi)切酶BstbI線性化誘餌載體并轉(zhuǎn)化至Y1HGold 酵母中，涂布于SD/-Ura 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng) 3 d。挑取單克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 進(jìn)行菌落PCR 鑒定，獲得誘餌菌株 Y1H-pAbAi-proCsNCED2。取適量Y1H-pAbAi-proCsNCED2涂布于含有不同金擔(dān)子素A（Aureobasidin A，AbA）濃度的SD/-Ura 培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，以確定能夠完全抑制Y1H-pAbAi-proCsNCED2自激活的 AbA 濃度。按照SK2400 經(jīng)典酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（酷來(lái)搏，北京）說(shuō)明書(shū)制作Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受態(tài)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的茶樹(shù)葉片文庫(kù)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后的菌涂布于 SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d 后，挑取單克隆進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 酵母單雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證互作蛋白

測(cè)序信息提交到NCBI 進(jìn)行BLASTx 比對(duì)后，根據(jù)候選轉(zhuǎn)錄因子CsDof5.4（GenBank登錄號(hào)XP_028116390.1） 和CsERF38（GenBank 登錄號(hào)XP_028084536.1）序列信息設(shè)計(jì)特異引物（表1），以龍井長(zhǎng)葉cDNA為模板將它們的編碼序列（CDS）構(gòu)建至pGADT7(AD)載體上，形成 AD-Dof5.4 和AD-ERF38重組載體，并轉(zhuǎn)化至Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌斑生長(zhǎng)狀況，AD 空載體轉(zhuǎn)化Y1H-pAbAi-proNCED2菌株為陰性對(duì)照。

1.4 轉(zhuǎn)錄活性鑒定

設(shè)計(jì)特異引物（表 1）將CsDof5.4與CsERF38的CDS 序列構(gòu)建至pGBKT7(BD)載體，獲得BD-Dof5.4 與BD-ERF38 重組載體，并將它們分別轉(zhuǎn)化入Y2HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Trp 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，將長(zhǎng)出的單克隆轉(zhuǎn)移至SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培養(yǎng)基上，30 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察它們的生長(zhǎng)狀態(tài)及顏色變化。轉(zhuǎn)化有BD 空載體的Y2HGold 酵母菌作為陰性對(duì)照。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)特異引物（表1）構(gòu)建35S::CsDof5.4-GFP 和35S::CsERF38-GFP 用于亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。將35S::CsDof5.4-GFP、35S::CsERF38-GFP 和35S::GFP 分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101 中，在28 ℃分別培養(yǎng)至渾濁后，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用侵染液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，120 μmol·L-1AS，pH=5.7）分別重懸菌體至OD600為0.8 后注射到煙草葉片中，48 h后使用熒光顯微鏡BX63（奧林巴斯，日本）對(duì)注射區(qū)域進(jìn)行GFP 信號(hào)的觀察。

1.6 雙熒光素酶（Dual-LUC）試驗(yàn)

用實(shí)驗(yàn)室前期保存含有的CsNCED2pro::LUC 的GV3101（pSoup）作為報(bào)告菌株，轉(zhuǎn)化有 35S::CsDof5.4-GFP、35S::CsERF38-GFP 和35S::GFP 的根癌農(nóng)桿菌GV3101 作為效應(yīng)菌株。用侵染液分別將它們的OD600調(diào)整至0.8，報(bào)告菌株和相應(yīng)的效應(yīng)菌株按照體積比為1∶1 的比例混勻后注射至煙草葉片中，注射48h后按照Double-Luciferase Reporter Assay Kit（全式金，北京）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行螢火蟲(chóng)熒光素酶（LUC）和海腎螢光素酶（REN）活性測(cè)定。

1.7 RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

茶樹(shù)RNA 提取根據(jù)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)CsNCED2，CsDof5.4和CsERF38基因序列信息設(shè)計(jì)特異定量引物（表1）用于 qRT-PCR試驗(yàn)，茶樹(shù)GADPH基因作為內(nèi)參基因（TEA003029）。使用 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（諾維贊，南京）在Lightcycler480Ⅱ型定量 PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR。設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并利用 GraphPad Prism 8 作圖。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，IBM SPSS 19 軟件進(jìn)行Student’st檢驗(yàn)，P≤0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsNCED2 啟動(dòng)子互作蛋白篩選

誘餌載體pAbAi-proNCED2用限制性?xún)?nèi)切酶BstbⅠ線性化后轉(zhuǎn)化Y1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Ura 培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落進(jìn)行 PCR 鑒定，獲得Y1H-pAbAi-proCsNCED2誘餌菌株，將其涂布于SD/-Ura 培養(yǎng)基上，AbA 質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150 ng·mL-1。結(jié)果顯示，誘餌菌株在不含AbA 的SD/-Ura 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好（圖1A），而在含50 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（圖1B），因此選擇質(zhì)量濃度為50 ng·mL-1的AbA 作為CsNCED2啟動(dòng)子酵母單雜交的工作濃度。文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至誘餌菌株后，篩選到17 個(gè)單克隆能在50 ng·mL-1AbA 的SD/-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖1C），對(duì)它們分別進(jìn)行菌落PCR 鑒定后得到16 個(gè)條帶大小為1 000～2 000 bp 的PCR 產(chǎn)物（圖1D）。

圖1 CsNCED2 啟動(dòng)子酵母單雜交文庫(kù)篩選結(jié)果Fig. 1 Yeast single hybrid library screening results of CsNECD2 promoter

2.2 EST 序列的功能注釋

將16 個(gè)PCR 產(chǎn)物測(cè)序得到的EST 序列提交到NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST 比對(duì)和注釋?zhuān)绫? 所示，多個(gè)EST 編碼的蛋白參與脅迫響應(yīng)過(guò)程，如與植物病蟲(chóng)害免疫相關(guān)的 GDSL 酯酶/脂肪酶[23]（EST5），與干旱、鹽脅迫相關(guān)的水通道蛋白[24]（EST11），脫落酸、脅迫、成熟誘導(dǎo)蛋白ASR[25]（EST10）和甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶[26]（EST13）等。同時(shí)，EST6 被注釋為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，EST15 被注釋為Dof 轉(zhuǎn)錄因子，說(shuō)明它們可能直接參與了CsNCED2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。根據(jù)他們與其他植物的同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系（圖2）將它們分別命名為 CsERF38 和CsDof5.4。

表2 EST 序列對(duì)比結(jié)果Table 2 Comparison of EST sequence

圖2 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of transcription factors

2.3 CsDof5.4 和CsERF38 轉(zhuǎn)錄激活鑒定和亞細(xì)胞定位分析

CsDof5.4和CsERF38的CDS 構(gòu)建至BD載體上用于轉(zhuǎn)錄活性分析，結(jié)果如圖3A 所示，在 SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化有BD 空載體的Y2HGold 菌株不能生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化有BD-CsDof5.4和BD-CsERF38的Y2HGold能激活報(bào)告基因HIS3、ADE2和MEL1的表達(dá)，從而正常生長(zhǎng)并顯示藍(lán)色，說(shuō)明CsDof5.4和CsERF38均具有轉(zhuǎn)錄激活的作用。煙草葉片中的亞細(xì)胞定位顯示 35S::CsDof5.4-GFP 和35S::CsERF38-GFP 的熒光均只在細(xì)胞核中觀察到，說(shuō)明CsDof5.4和CsERF38均定位于細(xì)胞核（圖3B）。

圖3 CsDof5.4 和CsERF38 的轉(zhuǎn)錄活性鑒定和亞細(xì)胞定位分析Fig. 3 Transcriptional activity identification and subcellular localization analysis of CsDof5.4 and CsERF38

2.4 CsDof5.4 和CsERF38 對(duì)CsNCED2 的表達(dá)調(diào)控

為了進(jìn)一步分析CsDof5.4 和CsERF38 與CsNCED2啟動(dòng)子結(jié)合情況，將CsDof5.4和CsERF38的全長(zhǎng)CDS 分別構(gòu)建至AD 載體并轉(zhuǎn)化至誘餌菌株進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4A 所示，轉(zhuǎn)化有 AD-ERF38 和 AD-Dof5.4 的菌株在SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化AD 空載體質(zhì)粒的菌株則不能，說(shuō)明CsDof5.4 和CsERF38 能結(jié)合CsNCED2的啟動(dòng)子。同時(shí)，在煙草葉片進(jìn)行熒光素酶試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證CsDof5.4 和CsERF38 對(duì)CsNCED2表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果如圖4B 所示，在煙草葉片中表達(dá)CsDof5.4 和CsERF38 都顯著增強(qiáng)了CsNCED2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 LUC 信號(hào)，說(shuō)明CsDof5.4 和CsERF38 都能激活CsNCED2的表達(dá)。

圖4 酵母單雜交驗(yàn)證CsDof5.4 和CsERF38 與CsNCED2 啟動(dòng)子結(jié)合Fig. 4 Y1H verification of CsDof5.4 and CsERF38 binding to CsNCED2 promoter

2.5 CsNCED2、CsERF38 和CsDof5.4 在脅迫下的表達(dá)分析

利用qRT-PCR 分別檢測(cè)了CsNCED2、CsERF38和CsDof5.4對(duì)鹽、干旱和低溫脅迫的響應(yīng)，結(jié)果如圖5 所示，CsNCED2的表達(dá)量在鹽脅迫和干旱脅迫下上升，而在低溫處理下沒(méi)有顯著變化。同樣地，鹽脅迫和干旱脅迫也誘導(dǎo)了CsERF38的表達(dá)，且在鹽脅迫和干旱脅迫下CsERF38表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與CsNCED2表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相關(guān)性分別為0.79 和0.77。CsDof5.4的表達(dá)水平不受干旱脅迫和低溫脅迫的影響，但在鹽脅迫下逐漸上升，且在鹽脅迫下CsDof5.4表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與CsNCED2表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相關(guān)性高達(dá)0.85。

圖5 鹽、干旱和低溫脅迫下的表型及CsNCED2，CsERF38 和CsDof5.4 的表達(dá)分析Fig. 5 Phenotype and expression analysis of CsNCED2, CsERF38 and CsDof5.4 under salt, drought and low temperature stresses

3 討論

酵母單雜交技術(shù)庫(kù)篩文選能高效的鑒定到與目的基因啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子，因此被廣泛運(yùn)用到葡萄[27]、香蕉[28]、桃[29]等多種植物的研究中。本研究通過(guò)酵母單雜交技術(shù)鑒定到CsERF38 和CsDof5.4 能結(jié)合CsNCED2的啟動(dòng)子，同時(shí)，通過(guò)CsERF38 和CsDof5.4 的亞細(xì)胞定位分析、轉(zhuǎn)錄活性鑒定及在煙草中的熒光素酶試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 CsERF38 和CsDof5.4 可以直接激活CsNCED2的表達(dá)，表明它們?cè)诓铇?shù)在CsNCED2轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

NCED基因的表達(dá)能響應(yīng)逆境脅迫并調(diào)控內(nèi)源ABA 的含量水平，從而提高植物的抗性[30-31]。同樣地，茶樹(shù)中的研究發(fā)現(xiàn)，ABA含量在干旱脅迫下快速上升，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉以減少水分散失[22]；Wan 等[32]研究表明，ABA信號(hào)在茶樹(shù)對(duì)鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CsNCED2的表達(dá)量在干旱和鹽脅迫下上升，表明它在茶樹(shù)中參與了干旱和鹽脅迫導(dǎo)致的ABA 積累過(guò)程。另外，Ni等[33]研究表明低溫脅迫增強(qiáng)了茶樹(shù)葉片中ABA 的合成過(guò)程，王贊等[20]的研究證實(shí)了1個(gè)茶樹(shù)NCED基因參與了低溫誘導(dǎo)的ABA 合成過(guò)程，而本研究結(jié)果表明CsNCED2的表達(dá)不受低溫脅迫誘導(dǎo)。綜上所述，茶樹(shù)不同NCED基因成員在響應(yīng)脅迫過(guò)程存在差異，CsNCED2主要參與了茶樹(shù)對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

已有大量研究表明，植物中的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控NCED的表達(dá)來(lái)響應(yīng)脅迫環(huán)境[34-35]。本研究證實(shí)，CsERF38和CsDof5.4參與了茶樹(shù)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程，同時(shí)CsERF38參與了茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程。盡管它們?cè)诓铇?shù)響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫過(guò)程中的具體功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證，但CsERF38和CsDof5.4在鹽脅迫下與CsNCED2的表達(dá)高度相關(guān)，同時(shí)，CsERF38的表達(dá)在干旱脅迫下與CsNCED2也高度相關(guān)，結(jié)合它們對(duì)CsNCED2表達(dá)的激活作用，我們推測(cè) CsERF38 能通過(guò)調(diào)控CsNCED2的轉(zhuǎn)錄從而參與茶樹(shù)對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程，而CsDof5.4 能通過(guò)調(diào)控CsNCED2的轉(zhuǎn)錄參與茶樹(shù)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。本研究結(jié)果為茶樹(shù)中CsNCED2響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。