李力，羅盛財(cái)，王飛權(quán)，黎巷汝，馮花，石玉濤，葉江華，劉菲，趙佳林，李舒瑩，張渤*

1. 武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建 南平 354300；2. 武夷山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 南平 354300；3. 武夷學(xué)院茶葉科學(xué)研究所，福建 南平 354300；4. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002

武夷茶是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的一類(lèi)成員，以“武夷”的英文音譯而被命名為Bohea或VarBohea（Thea BoheaLinnaeus. 1762）。武夷茶生長(zhǎng)于中國(guó)福建省北部的武夷山，武夷山被認(rèn)為是烏龍茶和紅茶的發(fā)源地[1-2]。武夷山地區(qū)的先民從有性系的武夷茶樹(shù)群體中篩選分離出品質(zhì)優(yōu)良的稀有單叢單株，通過(guò)無(wú)性繁殖傳承至今，成為現(xiàn)在著名的“武夷名叢”[3]。由于武夷茶樹(shù)生長(zhǎng)在巖石土壤中，其鮮葉制作的茶葉具有“巖韻”（風(fēng)味濃郁，香味持久）的品質(zhì)特點(diǎn)，被稱(chēng)為武夷巖茶，是中國(guó)十大名茶之一，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和文化價(jià)值[4]。

歷史上記載的武夷茶樹(shù)品種有上千種。然而，許多種質(zhì)資源不斷消失，通過(guò)對(duì)茶樹(shù)性狀的長(zhǎng)期觀察，目前僅收集到百余個(gè)種質(zhì)資源[5-6]。此外，武夷山當(dāng)?shù)氐挠N過(guò)程中存在對(duì)優(yōu)良品種過(guò)度選擇的情況，將導(dǎo)致群體遺傳多樣性越漸狹窄，最終影響品種性狀的綜合改良，再加上存在茶樹(shù)同物異名的現(xiàn)象，進(jìn)一步阻礙了武夷茶樹(shù)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)。因此，對(duì)武夷茶的遺傳背景分析和品種鑒定是一項(xiàng)重要的工作。傳統(tǒng)的茶樹(shù)種質(zhì)資源分類(lèi)基于形態(tài)或農(nóng)藝性狀，容易受到環(huán)境條件的限制[7]，這給品種的確定帶來(lái)了一定的困難[8]。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）對(duì)作物品種建立了“差異性、統(tǒng)一性和穩(wěn)定性”測(cè)試制度[9]，在難以通過(guò)表型區(qū)分確認(rèn)新品種的情況下，DNA 指紋圖譜可以幫助提高品種的識(shí)別。新修改的《中華人民共和國(guó)種子法》于2022 年3 月1 日正式施行，首次建立實(shí)質(zhì)性派生品種（Essentially derived variety，EDV）制度[10]，要求對(duì)品種的基因或基因型組合進(jìn)行特異性檢測(cè)鑒定。建立真實(shí)可靠的DNA 鑒定檢測(cè)技術(shù)對(duì)新《種子法》修訂條例的實(shí)施具有重大戰(zhàn)略意義。

目前，茶樹(shù)的特異性DNA 鑒定手段仍相對(duì)落后于主要農(nóng)作物，早期的茶樹(shù)特異性DNA 鑒定方法多采用第一代或第二代分子標(biāo)記，包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLPs）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列（SSRs）等[11-14]，武夷茶樹(shù)也是如此[15-17]。雖然這些傳統(tǒng)方法各有優(yōu)勢(shì)，但所使用的標(biāo)記數(shù)據(jù)量有限，不適合大樣本量的群體分析，不能充分反映物種的遺傳多樣性。相比之下，第三代分子標(biāo)記技術(shù)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）[18-20]具有一定的優(yōu)勢(shì)，已逐步成為主流的分子標(biāo)記[21]。Lin 等[22]采用高通量SNP 技術(shù)構(gòu)建了4 個(gè)主要烏龍茶產(chǎn)區(qū)的DNA 指紋圖譜，揭示了4 個(gè)產(chǎn)區(qū)的遺傳關(guān)系。Liu 等[23]從茶樹(shù)的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出49 個(gè)SNP 位點(diǎn)，分析了武夷山及其鄰近地區(qū)137 份茶樹(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性豐富程度及遺傳關(guān)系。這表明高通量SNP技術(shù)在尋找和驗(yàn)證茶樹(shù)親本關(guān)系方面具有很大的發(fā)展空間。然而，茶樹(shù)的SNP 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)發(fā)展較晚，數(shù)量有限，仍需不斷完善補(bǔ)充。

傳統(tǒng)的SNP 篩選方法需要大量的人力資源和較長(zhǎng)的時(shí)間，基因分型（Genotyping by sequencing，GBS）測(cè)序技術(shù)可以快速識(shí)別高密度SNP 位點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)鑒定、群體結(jié)構(gòu)分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析[24-25]。本研究收集了126 份武夷茶品種/品系，結(jié)合來(lái)自12 個(gè)省份的223 份優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源，共349份茶樹(shù)樣本進(jìn)行GBS 測(cè)序，利用高質(zhì)量SNPs對(duì)武夷茶進(jìn)行遺傳多樣性及背景分析，并開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速的茶葉SNP 分子標(biāo)記鑒定，旨在為茶樹(shù)研究領(lǐng)域EDV 制度的有效實(shí)施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與DNA 提取

樣品來(lái)自武夷山市龜巖茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)基地（福建省優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)閩茶圃004，N 27°43'42.46"，E 118°0'14.40"）和武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃（N 27°61'01.34"，E 117°96'63.51"），包括126 個(gè)武夷茶品種/品系及223 個(gè)來(lái)自12 個(gè)省份的茶樹(shù)品種/品系，共349 個(gè)（包含同一品種/品系的6 對(duì)）。樣本信息見(jiàn)附表1（掃文后二維碼查看附表1）。

新鮮葉片基因組 DNA 采用植物基因組DNA 提取試劑盒（康威CW0553S）提取，DNA濃度和純度采用 NanoDrop 紫外分光亮度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測(cè)定。DNA 完整性使用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，基因組DNA 保存于-80 ℃。

1.2 基因分型測(cè)序及建庫(kù)

GBS 庫(kù)的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[26]，用限制性?xún)?nèi)切酶（EcoRⅠ和NiaⅢ）酶解質(zhì)檢合格的基因組DNA，在酶切后的片段兩端加上相應(yīng)的適配接頭，利用PCR 擴(kuò)增兩個(gè)接頭之間的片段，共構(gòu)建了349 個(gè)對(duì)應(yīng)樣本的多重庫(kù)，每個(gè)庫(kù)DNA 樣本都有唯一的適配接頭。將樣品混合后進(jìn)行電泳回收純化，純化產(chǎn)物質(zhì)檢合格后使用Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)（上海凌恩生物科技有限公司）進(jìn)行雙末端測(cè)序。

測(cè)序獲得的原始序列數(shù)據(jù)（Raw read）去除低質(zhì)量序列，有效的高質(zhì)量序列（Clean read）數(shù)據(jù)經(jīng)BWA v0.7.10 軟件[27]比對(duì)茶樹(shù)基因組[28]，利用SAMTOOLS v1.9 軟件將sam 轉(zhuǎn)換為bam 文件。GATK v4.1.2.0 軟件用于檢測(cè)SNP，初始SNP 質(zhì)量過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為“QD＜2.0 ||MQ ＜40.0 || FS ＞60.0 || SOR ＞3.0 ||MQRankSum ＜-12.5 || ReadPosRankSum ＜-8.0”。使用VCF v0.1.11 軟件對(duì)SNP 進(jìn)行嚴(yán)格過(guò)濾[29]，經(jīng)過(guò)測(cè)序深度4X，缺失率（Miss rate）＜10%、次等位基因頻率（MAF）＞0.05，多態(tài)信息含量（PIC）＞0.15，SNP 位點(diǎn)兩側(cè)150 bp 無(wú)變異的過(guò)濾，最終共獲得12 937 679個(gè)SNP。從12 937 679 個(gè)SNP 中篩選出遺傳多樣性較高且均勻分布在15 個(gè)染色體上的核心SNP（去除重組率為0 的冗余位點(diǎn)、MAF＞0.15、Miss rate＜5%、PIC＞0.15）用于后續(xù)分析。使用PowerMaker v3.25 軟件[30]計(jì)算觀察到的雜合度（Observed heterozygosity，Ho）值和基因多樣性（Gene diversity，GD）值。

1.3 茶樹(shù)群體遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)分析

使用Admixture 軟件分析種群結(jié)構(gòu)[31]。根據(jù)隸屬度系數(shù)（Q）的取值對(duì)所有品種進(jìn)行劃分，根據(jù)交叉驗(yàn)證誤差（CV 誤差）確定最優(yōu)K 值。主成分分析（PCA）使用Plink 軟件進(jìn)行，使用 R v3.4 進(jìn)行可視化繪圖[32]。利用MEGA 軟件的鄰接法（ Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，軟件分析均采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，使用iTOL 在線軟件編輯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[33]。

1.4 基因流分析

根據(jù)茶樹(shù)文獻(xiàn)資料[34-35]按茶樹(shù)原產(chǎn)地（以省/直轄市為單位）對(duì)349 個(gè)茶樹(shù)進(jìn)行分組，為探索武夷山地區(qū)茶樹(shù)的歷史遺傳基因流，進(jìn)一步將福建省的地區(qū)劃分為福建武夷山區(qū)（FJW）、閩東區(qū)（FJE）、閩南區(qū)（FJS）和福建未知區(qū)（FJU）。為減少誤差，少于5 個(gè)品種的地區(qū)組被排除分析。最后，共采用11地區(qū)組進(jìn)行分析（附表1）。使用TreeMix v1.01軟件進(jìn)行基因流分析[36]，分別設(shè)定假設(shè)有1～11 次基因流事件（-m=1～11），以箭頭表示不同組之間的基因滲入。

1.5 遺傳相似度分析

使用軟件NTSYSpc v2.11[37]進(jìn)行遺傳相似度分析，計(jì)算SNP 的分布頻率和遺傳相似系 數(shù)（ Genetic similarity ， GS） ，GS=NS/(NS+ND)。式中，NS為相同SNP 基因型數(shù)量，ND為不同SNP 基因型數(shù)量[38]。缺失的基因型被視為無(wú)效基因型。

根據(jù)國(guó)際種子聯(lián)合會(huì)[39]的建議，GS 值大于0.9 可作為實(shí)質(zhì)派生關(guān)系的有力證據(jù)。因此，GS＞0.9 的品種對(duì)被認(rèn)為是近似品種，具有派生關(guān)系。349 個(gè)茶樹(shù)中有6 對(duì)來(lái)自不同生長(zhǎng)地的同一品種/品系，作為明確為實(shí)質(zhì)派生關(guān)系的陽(yáng)性對(duì)照，將其中最小的GS 值作為具有無(wú)可爭(zhēng)議的派生關(guān)系的閾值。當(dāng)茶樹(shù)樣本的GS 值大于該閾值，將這對(duì)樣本明確為具有派生關(guān)系。

1.6 簡(jiǎn)易鑒定SNP 開(kāi)發(fā)

在973 個(gè)核心SNP 的基礎(chǔ)上，使用Perl方法以349 個(gè)樣本成對(duì)比較的可辨性為過(guò)濾條件，選擇一組數(shù)量最少且可辨性高的SNP標(biāo)記用于品種簡(jiǎn)單快速鑒定[40-41]。在SNP 側(cè)翼兩個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，隨機(jī)進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組SNP 篩選

349 份茶樹(shù)種質(zhì)資源共獲得829.05 G 高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣品獲得2.38 G 數(shù)據(jù)，Q20（堿基錯(cuò)誤率在1%以下）平均占比98%，Q30（堿基錯(cuò)誤率在0.1%以下）平均占比93.05%，平均獲得高質(zhì)量序列條數(shù)5 737 108 966，平均有5 668 097 099 條序列可以匹配到茶樹(shù)參考基因組，平均覆蓋率為98.83%，表明測(cè)序質(zhì)量較高。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾篩選（Miss rate＜20%、MAF＞10%），共獲得12 937 679 個(gè)SNP。測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)上傳 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（項(xiàng)目號(hào)：PRJNA924950）。以去除重組率為0 的冗余位點(diǎn)、MAF＞0.15、Miss rate＜5%、PIC＞0.15 且較均勻分布在茶樹(shù)基因組15 條染色體上為篩選條件，共獲得973 個(gè)核心SNPs。

2.2 茶樹(shù)群體遺傳多樣性分析

973 個(gè)SNP 較均勻地分布在茶樹(shù)的15 條染色體上，在第1 至第15 條染色體上的個(gè)數(shù)分別為94、75、62、73、67、63、70、59、69、60、47、44、64、68 和58（圖1A）。在349 個(gè)茶樹(shù)中的Ho 值為0.355，53.04%以上Ho 值大于0.3；GD 平均值為0.319，51.28%以上GD 值大于0.3；茶樹(shù)群體PIC 平均值為0.262。973 個(gè)SNP 在武夷茶樹(shù)品種/品系中的Ho 值為0.334，GD 平均值為0.302，PIC 平均值為0.248（圖1B）。

圖1 973 個(gè)核心SNP 在茶樹(shù)基因組15 條染色體上分布情況及多樣性分析Fig. 1 Distribution and diversity analysis of 973 core SNPs on 15 chromosomes of tea plant genome

基于973 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)349 個(gè)茶樹(shù)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。基于模型的群體結(jié)構(gòu)分析表明，5 個(gè)群體（K=5）為最佳模型（圖2A）。通過(guò)PCA 對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出了5 個(gè)聚類(lèi)，與K=5 時(shí)的結(jié)構(gòu)分析推斷結(jié)果一致（圖2B）。NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與種群結(jié)構(gòu)分析及PCA結(jié)果基本吻合，但少部分個(gè)體在分支聚類(lèi)上有所差異（圖2C）。亞群1～5 分別有茶樹(shù)個(gè)體159、72、51、50 個(gè)和17 個(gè)。亞群1 主要以福建省武夷山地區(qū)茶樹(shù)、浙江地區(qū)茶樹(shù)及安徽地區(qū)茶樹(shù)為代表，亞群2 主要是以福建省閩南地區(qū)鐵觀音和黃旦等茶樹(shù)為代表，亞群3 主要是以福鼎大白茶及其相關(guān)品種類(lèi)型為代表，亞群4 主要是以湖南地區(qū)茶樹(shù)為代表，亞群5主要是廣東地區(qū)茶樹(shù)為代表。武夷山茶樹(shù)資源大部分集中于亞群1，共108 個(gè)，15 個(gè)處于亞群2，1 個(gè)處于亞群3，2 個(gè)處于亞群4。

2.3 基因流分析

在預(yù)估的1～11 次基因流事件中（11 個(gè)場(chǎng)景），共有5 個(gè)場(chǎng)景涉及武夷山地區(qū)茶樹(shù)的基因流動(dòng)。其中2 個(gè)場(chǎng)景發(fā)現(xiàn)武夷山地區(qū)茶樹(shù)群體（FJW）的基因主要向浙江地區(qū)茶樹(shù)群體（ZJ）流動(dòng)（圖3B 和3C），沒(méi)有發(fā)現(xiàn)外地省份的茶樹(shù)群體直接向武夷山地區(qū)茶樹(shù)群體的基因滲入情況，但3 個(gè)場(chǎng)景發(fā)現(xiàn)存在本省閩南地區(qū)（FJS）茶樹(shù)群體向武夷山地區(qū)（FJW）的基因滲入（圖3D～F）。

圖3 基因流分析Fig. 3 Gene flow analysis

2.4 遺傳相似性分析

基于973 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行349 個(gè)品種之間遺傳相似度分析（圖4），經(jīng)過(guò)兩兩比較，GS 在0.524 0～0.996 9，平均值為0.661 8。其中，GS 在0.6～0.7 的最多（90.60%），為55 018 對(duì)；GS 在0.8～0.9 的最少，為80 對(duì)；GS＞0.9 的共有136 對(duì)。126 個(gè)武夷茶品種/品系（含6 對(duì)已知實(shí)質(zhì)性派生關(guān)系的茶樹(shù)）之間的GS 在0.617 7～0.996 9，平均值為0.686 0。GS＞0.9 的共24 對(duì)，在0.8～0.9 的共7 對(duì)，在0.7～0.8 的共831 對(duì)，在0.6～0.7 的最多（89.05%），共7 013 對(duì)。

圖4 349 個(gè)茶樹(shù)之間的遺傳相似度分析Fig. 4 Genetic similarity analysis among 349 tea resources

349 個(gè)茶樹(shù)中涉及武夷茶品種/品系GS＞0.9 的有26 對(duì)（含已知具有派生關(guān)系的6 對(duì)），被認(rèn)為是近似品種，具有派生關(guān)系，以6 對(duì)來(lái)自不同生長(zhǎng)地的同一品種/品系的兩株茶樹(shù)作為具有明確派生關(guān)系的陽(yáng)性對(duì)照，其中GS 最小的為0.972 3，涉及武夷茶品種/品系遺傳相似系數(shù)大于0.972 3 的共有23 對(duì)（含已知具有派生關(guān)系的6 對(duì)），被明確為具有無(wú)爭(zhēng)議的派生關(guān)系（表1）。其中FJ84（JM051 肉桂）、FJ204（JM046 紅海棠）、FJ73（JM037 王母桃）、FJ200（JM035 金雞母）、FJ191（黃肉桂）5 個(gè)品種/品系之間遺傳相似系數(shù)均大于0.972 3，明確具有派生關(guān)系。大紅袍2 號(hào)株FJ91（JM062-2 大紅袍2）與FJ192（奇丹），大紅袍4 號(hào)株FJ93（JM062-4 大紅袍4）與FJ82（JM049 不知春），F(xiàn)J108（JM081 醉墨）與FJ48（JM005 雀舌），F(xiàn)J67（JM029 向天梅）與FJ71（JM034 醉貴姬），F(xiàn)J76（JM042胭脂柳）與FJ77（JM043 醉八仙），F(xiàn)J13（1113）與FJ12（1114），以及FJ86（JM054 金毛猴）與FJ149（白毛猴）相似系數(shù)均大于0.972 3，明確具有派生關(guān)系。而FJ52（JM011 石中玉）與FJ161（0205D），F(xiàn)J63（JM025 石觀音）與FJ187（SR），F(xiàn)J17（0204）與FJ18（0205）相似系數(shù)在0.90～0.97，被認(rèn)為是近似品種/品系，具有一定派生關(guān)系。以上品種/品系對(duì)之間均可被視為分別屬于同一類(lèi)型。

表1 126 個(gè)武夷茶樹(shù)中遺傳相似系數(shù)大于0.9 的品種/品系對(duì)及派生關(guān)系分析Table 1 The information of cultivar/strain pairs with genetic similarity greater than 0.9 and essentially derived relationship analysis in 126 Wuyi tea cultivars

2.5 簡(jiǎn)易鑒定茶樹(shù)品種SNP 的篩選

在973 個(gè)核心SNPs 基礎(chǔ)上，通過(guò)349 個(gè)樣本的成對(duì)比較，選擇出具有高辨識(shí)度的21個(gè)SNPs 可用于區(qū)分349 個(gè)茶樹(shù)（圖5A），其中18 個(gè)SNPs 即可用于126 個(gè)武夷茶品種/品系建立DNA 指紋圖譜（圖5B）。進(jìn)一步在21個(gè)SNP 位點(diǎn)兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（表2），使用21 對(duì)引物對(duì)隨機(jī)抽取的10 個(gè)茶樹(shù)樣本進(jìn)行PCR 與一代測(cè)序驗(yàn)證，分型結(jié)果均顯示與位點(diǎn)一致，可用于茶樹(shù)種質(zhì)資源的快速鑒定（圖6）。

圖5 349 個(gè)茶樹(shù)（A）及126 個(gè)武夷茶（B）的SNP 指紋圖譜Fig. 5 SNP fingerprints of 349 tea cultivars (A) and 126 Wuyi tea cultivars (B)

表2 21 對(duì)可區(qū)分349 個(gè)茶樹(shù)樣本的引物信息Table 2 Information of 21 pairs of primers that can distinguish 349 tea resources

3 討論

3.1 GBS-SNP 及茶樹(shù)遺傳多樣性

本研究收集了126 個(gè)武夷茶品種/品系及223 個(gè)來(lái)自其他不同地區(qū)的茶樹(shù)種質(zhì)資源，共349 個(gè)茶樹(shù)樣本，利用GBS-SNPs 方法分析了武夷茶的基因遺傳多樣性與背景，共鑒定出12 937 679 個(gè)高質(zhì)量SNPs，所有樣本均通過(guò)質(zhì)量評(píng)估，平均準(zhǔn)確率達(dá)98.8%。高通量和高質(zhì)量的SNP 表明，GBS 是進(jìn)行種群遺傳多樣性分析的有效方法。本研究進(jìn)一步篩選出多樣性較高（缺失率＜5%、MAF＞0.15、PIC＞0.15）并均勻分布在15 個(gè)染色體上的973 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析。973 個(gè)SNPs 在349個(gè)茶樹(shù)樣本中雜合度Ho 平均值（0.355）和GD 平均值（0.319）均較高，表明這973 個(gè)SNP信息豐富，具有較高的基因多樣性，可用于遺傳多樣性分析。973 個(gè)SNPs 在349 個(gè)茶樹(shù)與126 個(gè)武夷茶樹(shù)中的PIC 平均值分別為0.262與0.248，茶樹(shù)群體多態(tài)性信息含量中等，這暗示著茶樹(shù)群體中存在一定數(shù)量親緣關(guān)系較近的茶樹(shù)。以12 937 679 個(gè)高質(zhì)量SNPs 和973個(gè)SNPs 構(gòu)建的群體遺傳結(jié)構(gòu)、主成分和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系均表明，349 個(gè)茶樹(shù)樣本可劃分為5個(gè)種群。這5 個(gè)茶樹(shù)種群主要基于茶樹(shù)之間的親緣關(guān)系進(jìn)行聚類(lèi)，而不是樹(shù)型或葉形等形態(tài)特征，這與以往的研究一致[42]。

圖6 隨機(jī)抽取10 個(gè)茶樹(shù)樣本進(jìn)行一代測(cè)序的分型結(jié)果示例Fig. 6 The sequencing and genotyping result of the random sampling of 10 tea plant samples

3.2 武夷茶歷史遺傳背景與基因流

中國(guó)西南地區(qū)是茶樹(shù)的發(fā)源地[28]，同源茶種以不同的傳播演化路徑發(fā)展。早前有學(xué)者根據(jù)茶樹(shù)的生態(tài)型和地質(zhì)變化提出茶樹(shù)五大演化區(qū)[43]，即黔區(qū)系群、三江區(qū)系群、南嶺區(qū)系群、武夷區(qū)系群及江漢區(qū)系群，指出茶樹(shù)在經(jīng)歷自然傳播后，因地質(zhì)和氣候變化在第四紀(jì)冰期后形成隔離分布和演化。武夷山地處福建西北，在中生代白堊紀(jì)時(shí)候由海洋逐漸變?yōu)殛懙?，到第四紀(jì)末冰期地殼上升，產(chǎn)生褶皺和斷裂成山間谷地。武夷山的地質(zhì)年代，形成土壤的巖性以及存在野生茶等一系列特點(diǎn)，暗示武夷山茶樹(shù)是由“隔離分布”的同源演化成“武夷類(lèi)群”[44]。本研究中基因流分析未發(fā)現(xiàn)其他省份茶樹(shù)直接向武夷山茶樹(shù)群體的基因流動(dòng)，其結(jié)果符合該說(shuō)法。此外，基因流分析顯示武夷茶主要是向浙江地區(qū)茶樹(shù)基因流動(dòng)，這與種群結(jié)構(gòu)分析中大部分浙江茶樹(shù)品種與武夷山茶樹(shù)聚在一起的結(jié)果一致，也與Zhang 等[45]研究結(jié)果一致。因此，福建北部武夷山與浙江茶區(qū)在地質(zhì)和演化過(guò)程可能為同一演化區(qū)，這也暗示著浙江地區(qū)的部分茶樹(shù)種與武夷山茶樹(shù)種存在一定的基因交流，在近代的茶樹(shù)育種中，人為的跨省之間的茶樹(shù)雜交育種非常常見(jiàn)，這些品種是否經(jīng)由武夷山茶樹(shù)傳播發(fā)展而來(lái)還有待進(jìn)一步研究。

在基因流分析中，福建省內(nèi)存在閩南地區(qū)茶樹(shù)向武夷山茶樹(shù)的基因流動(dòng)。一些武夷茶品種/品系，例如紫羅蘭、正太陽(yáng)、金毛猴、白毛猴、金丁香和留蘭香等在種群結(jié)構(gòu)分析中也與閩南茶樹(shù)聚在一起。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[46-47]記載，明朝年間，部分閩南茶農(nóng)大舉內(nèi)遷武夷山地區(qū)，部分武夷茶品種/品系可能是由閩南茶流入后經(jīng)過(guò)雜交傳播發(fā)展而來(lái)。此外，近期培育的小紅袍茶樹(shù)因在遺傳相似度分析中顯示與閩南地區(qū)的毛蟹茶樹(shù)遺傳相似系數(shù)為0.983 6，具有明顯的派生關(guān)系，未被列入本研究的126個(gè)武夷茶樹(shù)之中。盡管如此，茶樹(shù)的原產(chǎn)地溯源分析反映的是茶樹(shù)品種的遺傳背景，以便于后期的茶樹(shù)種質(zhì)資源利用與開(kāi)發(fā)。

3.3 茶樹(shù)EDV 及武夷茶親緣關(guān)系

隨著育種技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)原始品種進(jìn)行修飾性育種可能出現(xiàn)大量的派生品種。盡管派生品種可提高原始品種的遺傳貢獻(xiàn)，但也使育種的遺傳基礎(chǔ)變窄，不利于作物遺傳改良，甚至可能造成對(duì)糧食安全的威脅。2022 年3 月1日，新《中華人民共和國(guó)種子法》第28 條和第90 條首次規(guī)定了EDV 制度[10]，對(duì)作物品種的遺傳基因相似度提出了要求。茶樹(shù)為異花授粉植物，其遺傳組成高度雜合，表現(xiàn)型上千姿百態(tài)，對(duì)茶樹(shù)親緣關(guān)系的分析有助于茶樹(shù)種質(zhì)資源的合理開(kāi)發(fā)利用，然而茶樹(shù)品種的EDV 研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次依據(jù)遺傳相似度對(duì)349 個(gè)茶樹(shù)進(jìn)行了EDV 初步調(diào)查。在349 個(gè)茶樹(shù)的遺傳相似度分析中，共發(fā)現(xiàn)136對(duì)茶樹(shù)遺傳相似系數(shù)大于0.9，其中26 對(duì)涉及武夷茶，這說(shuō)明在茶樹(shù)品種資源的大量引種、頻繁的種質(zhì)雜交以及品種選育過(guò)程中過(guò)度使用優(yōu)良品種，已出現(xiàn)一定量的茶樹(shù)EDV，造成“同物異名”的情況[48-49]。

國(guó)際種子聯(lián)合會(huì)（ International seed federation，ISF）[39]將GS 值大于0.9 作為實(shí)質(zhì)派生關(guān)系的基本閾值，基于SNP 標(biāo)記遺傳相似度的派生關(guān)系閾值的設(shè)定建議高于 ISF頒布的標(biāo)準(zhǔn)，且無(wú)法對(duì)所有作物品種適用統(tǒng)一的EDV 判定標(biāo)準(zhǔn)，必須根據(jù)不同作物品種進(jìn)行確定[50]。茶樹(shù)品種具體的實(shí)質(zhì)派生關(guān)系閾值需要進(jìn)一步深入研究。實(shí)質(zhì)派生品種除表型與原始品種存在差異外，基因型/基因型組合與原始品種大致相同?？紤]到即使同一品種在不同的地方栽培時(shí)間較長(zhǎng)，也會(huì)存在極少量基因突變的積累，若兩個(gè)表型存在差異的個(gè)體的遺傳相似系數(shù)大于兩個(gè)不同栽培地的相同品種的遺傳相似系數(shù)，則可以被確認(rèn)為具有派生關(guān)系。本研究基于遺傳相似度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大紅袍2 號(hào)株（FJ91）與奇丹（FJ192）相似系數(shù)為0.988 7，大紅袍4 號(hào)株（FJ93）與正本不知春（FJ82）相似系數(shù)為0.986 7，均具有派生關(guān)系，屬于同一類(lèi)型。4 株大紅袍茶樹(shù)與北斗（FJ33）、雀舌（FJ48）的遺傳相似系數(shù)均較低（0.7 左右），這與先前的研究結(jié)果一致[51]。醉墨（FJ108）與雀舌（FJ48）的形態(tài)特征與芽葉生長(zhǎng)特性十分相似，在葉江華等[17]的ISSR 分子標(biāo)記鑒定中，相似系數(shù)僅為0.82，被認(rèn)為是不同類(lèi)型品種。本研究基于SNP 的分子標(biāo)記顯示兩者相似系數(shù)為0.989 7，應(yīng)為同一類(lèi)型的品種，這可能是因?yàn)镮SSR 分子標(biāo)記是多等位基因系統(tǒng)，內(nèi)部存在復(fù)雜變異，易產(chǎn)生誤差的緣故[52]。留香澗不知春（FJ42）與正本不知春（FJ82）相似系數(shù)為0.686 1，為不同類(lèi)型茶樹(shù)，這與先前研究一致[17]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肉桂（FJ84）、紅海棠（FJ204）、王母桃（FJ73）、金雞母（FJ200）和黃肉桂（FJ191）5 個(gè)品種/品系之間均具有明確派生關(guān)系，屬于同一類(lèi)型。金毛猴（FJ86）與白毛猴（FJ149），向天梅（FJ67）與醉貴姬（FJ71），胭脂柳（FJ76）與醉八仙（FJ77），1113（FJ13）與1114（FJ12）的遺傳相似系數(shù)均大于0.97，也具有明確派生關(guān)系，屬于同一類(lèi)型。石中玉（FJ52）與0205D（FJ161），石觀音（FJ63）與SR（FJ187），0204（FJ17）與0205（FJ18）的遺傳相似系數(shù)在0.90～0.97，均為近似品種，也可認(rèn)為具有一定派生關(guān)系。武夷茶種質(zhì)資源歷史悠久、種類(lèi)繁多，在引種栽培過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)亂或混雜在所難免。本研究通過(guò)SNP 分子標(biāo)記的遺傳相似度分析詮釋了武夷茶品種/品系之間的關(guān)系，不僅為茶樹(shù)育種提供了依據(jù)，而且對(duì)遺傳多樣性的保護(hù)具有重要作用。

3.4 茶樹(shù)的SNP 分子標(biāo)記鑒定

SNP 分子標(biāo)記技術(shù)具有基因型信息豐富、檢出效率高且準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，目前已被廣泛地應(yīng)用于作物品種的鑒定[53]。盡管近年來(lái)茶樹(shù)的SNP 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)展快速，并有相關(guān)的報(bào)道[54-56]，但茶樹(shù)品種資源豐富，基因組龐大且復(fù)雜度高，還需要不斷地補(bǔ)充完善。本研究篩選出的973 個(gè)SNP 位點(diǎn)均勻地覆蓋在茶樹(shù)基因組上，具有較高的基因多樣性，可對(duì)349 個(gè)茶樹(shù)進(jìn)行有效區(qū)分和指紋圖譜構(gòu)建。數(shù)量少且辨別度高的SNP 標(biāo)記有利于降低構(gòu)建指紋圖譜成本，本研究從973 個(gè)位點(diǎn)中篩選21 個(gè)SNP 位點(diǎn)作為一組可快速100%區(qū)分349個(gè)茶樹(shù)樣本的組合，并設(shè)計(jì)相關(guān)引物進(jìn)行驗(yàn)證，且其中18 個(gè)位點(diǎn)即可區(qū)分126 個(gè)武夷茶品種/品系。這些SNP 標(biāo)記在未來(lái)茶樹(shù)品種分子鑒定中可起到一定的應(yīng)用，可作為篩選茶樹(shù)品種真實(shí)性、特異性、純度鑒定以及類(lèi)群劃分的候選位點(diǎn)組合，為分子標(biāo)記輔助育種中背景分析提供研究基礎(chǔ)。