譚暢，單瑤,2，周孝森，姚秋怡，蔡曉明，邊磊*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 河南科技學院資源與環(huán)境學院，河南 新鄉(xiāng) 453003

視覺信息是昆蟲搜索食物、定位寄主和飛行導航等行為的重要線索，昆蟲獲取的視覺信息質(zhì)量會受到自身復眼視覺能力的限制[1]。隨著昆蟲的生長發(fā)育，其復眼的尺寸和結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化，如一些蟻類和黃蜂復眼上小眼的數(shù)目會逐漸增加[2-4]，小眼直徑增大[5-7]。復眼尺寸增加可以提高昆蟲識別視覺圖像的質(zhì)量，小眼數(shù)目的增加能提高視覺分辨率[8]，小眼內(nèi)光受體的生長可以提高其光靈敏度[9]。

昆蟲復眼的生長與體型的生長存在異速差異，復眼和體型的比例會隨著個體的生長發(fā)育逐漸縮小[6]。生物體的異速生長規(guī)律符合冪函數(shù)[10]，部分器官與主體特征之間異速生長的關系可以用來預測器官在未來的變化和分析昆蟲對環(huán)境的適應策略[11]。異速生長指數(shù)和初始生長指數(shù)是衡量生物體器官異速生長的重要參數(shù)，通過參數(shù)之間的對比可以分析器官在功能上的變化特征， 如沙漠螞蟻（Cataglyphis albicans、Cataglyphis bicolor和Cataglyphis fortis）和黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）復眼上小眼間角的異速生長指數(shù)（-0.40 和-0.21）均低于小眼數(shù)目的異速生長指數(shù)（0.75 和0.58）[3,12]，說明這些昆蟲復眼的視敏度會隨著體型的增大而提高。異速生長還可以表現(xiàn)在復眼的不同區(qū)域上，使這些區(qū)域分化為不同的特異性功能區(qū)[13]，如苜蓿黃蝶（Colias eurytheme）羽化后個體之間在體型上存在差異，個體間復眼小眼間角的異速生長指數(shù)在不同區(qū)域也存在差異[14]，說明個體體型會影響苜蓿黃蝶復眼上特異性功能區(qū)的視覺能力。因此，聯(lián)系昆蟲復眼參數(shù)的異速生長和視覺能力的變化特征，對衡量昆蟲的生長發(fā)育是否伴隨著視覺能力的提升是必要的。

小眼間角是衡量并置復眼視覺分辨率的重要參數(shù)，可通過組織學方法直接測定區(qū)域小眼的理論視敏度[15-16]。除此之外，通過觀測昆蟲區(qū)分垂直光柵或水平光柵所做出的行為反應[17-19]，明確昆蟲能區(qū)分的最細光柵條紋，同樣可以從行為上評估目標昆蟲復眼的分辨率[20-21]。組織學方法得到的理論值可以提供復眼視敏度的具體范圍，由于昆蟲習性、光學像差和空間因素的影響，行為學測試得到的復眼分辨率通常低于組織學方法測定的理論上限[22-23]，但卻能更好地代表昆蟲整體的視覺分辨率[24-25]。復眼的靈敏度是指光感受器捕獲光子的能力，與區(qū)域內(nèi)的小眼直徑、小眼接受角和視桿長度相關[26]，由于這些因素都受復眼體積的制約，所以復眼的光學靈敏度與復眼的大小密切相關。

小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii）是茶樹上的重要害蟲，屬于不完全變態(tài)昆蟲，若蟲有5 個齡期[27]，每次蛻皮后體型增大，復眼尺寸和小眼數(shù)量明顯增加。為了探明葉蟬的生長發(fā)育對其視覺能力的影響，本研究采用組織學和行為學方法，測定不同齡期葉蟬的體型大小、復眼的光學靈敏度和視覺敏銳度，并采用異速生長函數(shù)分析復眼視覺能力的異速生長特征，最后通過模擬葉蟬的視覺能力評估其生長發(fā)育過程中有效視距的變化，以期為深入研究葉蟬的行為生態(tài)學和研發(fā)無公害防治的技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗昆蟲

小貫小綠葉蟬采自中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所周邊茶園，采用龍井43 水培茶枝飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲室溫度為24～27 ℃，相對濕度為65%～75%，光周期為14L∶10D。茶枝上葉蟬的卵孵化后，采集5 個齡期的若蟲和羽化1 d后的雌雄成蟲作為組織學和行為學試驗樣本。

1.2 葉蟬復眼的外部結(jié)構(gòu)分析

采集試蟲低溫麻醉后，用橡皮泥固定在觀測平臺上，采用超景深3D 顯微鏡（基恩士，VHX-6000，日本）搭載鏡頭VH-Z100 UR 在(500～700)×放大倍數(shù)下，掃描樣本的背側(cè)整體形態(tài)和單個復眼的3D 表面結(jié)構(gòu)。各齡期若蟲與雌雄成蟲的生物學重復為7 次。

通過超景深3D 顯微鏡的分析軟件測量試蟲前胸背板寬度（Inter tegular width，ITW，圖1A），復眼上小眼的數(shù)量（N），中部區(qū)域的小眼間角（Δ?）、小眼直徑（D）和視桿長度（L，圖2A 和圖2B），其中Δ?為所測小眼3 個方向上小眼間角的平均值，D為所測小眼垂直與水平兩個方向角膜直徑的平均值。

圖1 葉蟬若蟲和雌雄成蟲背側(cè)圖Fig. 1 Dorsal view of nymph and adult of E. onukii

圖2 葉蟬復眼內(nèi)結(jié)構(gòu)參數(shù)的測量Fig. 2 Measurement of structural parameters in compound eye of E. onukii

1.3 葉蟬復眼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析

將采集試蟲低溫麻醉后取下頭部，放入4%多聚甲醛中固定0.5 h，用0.1 mol·L-1pH 7.4的PBS 緩沖液沖洗3～5 次，每次沖洗10 min，70%、85%、95%梯度酒精分別脫水15 min 后，100%酒精脫水2 次，每次5 min，接著過渡至2∶1 和1∶1 的二甲苯酒精稀釋溶液，分別處理 20 min，然后采用梯度正丁醇溶液進行處理。最后用二甲苯處理10～20 min。二甲苯與液態(tài)石蠟分別以2∶1 和1∶1 混合均勻加入待浸蠟組織，真空負壓條件下浸蠟30 min 后，轉(zhuǎn)入純石蠟溶液中浸蠟1～1.5 h。浸蠟組織包埋后進行修塊，通過超薄切片機（Leica EM UC7）獲得厚3 μm 的復眼半薄切片，蘇木精-伊紅染色后，中性樹脂膠封片。

采用超景深3D 顯微鏡對制作好的復眼切片進行觀測和拍攝，放大倍數(shù)為(800～1 000)×。通過ImageJ（V1.8.0，美國）測量復眼中部區(qū)域內(nèi)視桿的長度L（圖2C），L為區(qū)域內(nèi)5個視桿長度的平均值。各齡期若蟲與雌雄成蟲的生物學重復為3 次。

1.4 行為試驗

小貫小綠葉蟬的復眼屬于并置復眼[28]，其分辨率的高低在行為上表現(xiàn)為可以遠距離識別明暗光柵的能力[21]。葉蟬若蟲對環(huán)境的光強度極為敏感，并對黑色表現(xiàn)出明顯的偏好性及趨性運動。若蟲的行為試驗設計參考Kirwan 等[21]的方法，設計明暗相間的黑白光柵作為葉蟬若蟲的刺激（吸引）目標，通過行為反應測定不同齡期葉蟬若蟲的視敏度。

行為測定裝置如圖3A 所示，圓形反應室直徑15 cm、高度2 cm，反應室下方放置輻射度為425 μw·cm-2的發(fā)光板，該亮度為晴朗天氣時下午16:00—17:00 葉蟬活躍時間段[29]，芽下第二葉處的光照強度。反應室側(cè)面背景為灰色，刺激目標為明暗相間的黑白光柵（圖3B），暗區(qū)呈黑色（反射光強度最低），兩側(cè)逐漸過渡至白色（反射光強度最高）后再過渡至灰色，反射光強度的變化符合正弦函數(shù)[21]，黑白光柵的平均反射光強度等于灰色背景的反射光強度（圖3C）。每次行為測試之前，反應室使用無水乙醇擦洗并晾干。

圖3 小貫小綠葉蟬若蟲的行為試驗裝置Fig. 3 Apparatus for the behavioral experiment of E. onukii nymphs

試蟲暗適應10 min 后，在反應室距離光柵的最遠端釋放（圖3D），觀測若蟲的運動軌跡并通過反應室上方的高速攝像機（Reverler，中國）記錄。行為測試的時間上限為10 min，超過10 min 則認定為若蟲對光柵無反應。每次試驗重復時將反應室隨機旋轉(zhuǎn)90°，避免光柵方向產(chǎn)生的影響。每個齡期的若蟲各重復15 只。

行為軌跡采用視頻分析軟件 Tracker（V6.0.8，美國）進行分析，將葉蟬若蟲產(chǎn)生趨性反應的起始位置標記為識別點 R，點 R與黑色刺激區(qū)域之間的夾角即為若蟲的小眼間角（圖3D）。不同齡期若蟲的行為學小眼間角Δ?’取各重復試驗的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 視覺敏銳度和光學靈敏度

復眼的視覺敏銳度（A）為小眼間角（Δ?）的倒數(shù)，單位為cpd（Cycles per degree，周/度）；視距評估中采用行為試驗得到的小眼間角（Δ?’）進行計算。

復眼的光學靈敏度（S）采用公式（2）計算，單位為μm2·sr。

式中，D為小眼直徑，Δ?為組織學試驗得到的小眼間角，L為視桿長度，k值（0.006 7 μm-1）為節(jié)肢動物光受體的光吸收系數(shù)[26]。

1.5.2 復眼的異速生長規(guī)律

復眼的異速生長符合冪函數(shù)方程，

式中，Y為表征復眼不同特征的變量，包括N、D、Δ?、L，x為表征葉蟬生長指標的變量ITW，a為復眼不同特征變量的異速生長指數(shù)，b為該變量的初始生長指數(shù)[10]。

1.5.3 有效視距評估

AcuityView 是R 語言中評估生物體有效視距的常用模型[30]。可通過生物體的視覺敏銳度、目標圖像和不同觀測距離，生成以生物體視覺敏銳度為標準的不同距離下觀察到的目標圖像。以葉蟬視覺敏銳度為標準，以與實物大小一致的茶梢圖像（10 cm×10 cm，分辨率為1 024×1 024）為識別目標，采用R（4.2.0）生成不同齡期葉蟬識別茶梢的靜態(tài)圖像，模擬距離分別為2、5 cm 和10 cm，最后通過生成圖像的清晰度評估試蟲對茶梢的有效視距。

1.5.4 差異顯著性分析

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中不同齡期葉蟬的前胸背板寬度和復眼的視覺參數(shù)采用單因素方差分析（ANOVA 和Duncan）進行差異顯著性檢驗；前胸背板寬度和復眼的視覺參數(shù)采用冪函數(shù)（公式3，2個參數(shù)）進行線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同齡期葉蟬復眼的形態(tài)變化

隨著齡期的增長，葉蟬復眼的整體形態(tài)和小眼形狀發(fā)生顯著變化。復眼整體形態(tài)由近似橢圓形變?yōu)槟I形，1～3 齡若蟲復眼中部的小眼呈圓形，排列松散且密度較小，每個小眼周圍毗鄰4 個小眼；4 齡之后，復眼中部的小眼呈六邊形，排列緊密，每個小眼周圍有6 個小眼（圖4）。

圖4 各齡期小貫小綠葉蟬復眼的形態(tài)Fig. 4 External morphology of compound eyes of E. onukii in different instars

2.2 不同齡期葉蟬復眼視覺參數(shù)的異速生長

小貫小綠葉蟬在生長發(fā)育過程中，每次蛻皮后其體型和各視覺參數(shù)均會發(fā)生顯著性變化。葉蟬的前胸背板寬度（體型）隨著生長發(fā)育會逐漸增大（F=204.6，df=6，P＜0.05，圖1），復眼的小眼數(shù)目（F=483.62，df=6，P＜0.05，圖4）和小眼直徑顯著增長（F=36.94，df=6，P＜0.05），小眼間角持續(xù)減小（F=22.3，df=6，P＜0.05），即葉蟬復眼的視敏度會隨齡期增長而提高。葉蟬復眼的視覺參數(shù)符合典型的異速生長規(guī)律，其中復眼視敏度（a=-0.65＜1）和小眼直徑（a=0.35＜1）的增長慢于葉蟬體型的增速，小眼數(shù)目（a=1.37＞1）的增速比體型高（表1），即葉蟬在生長過程中視覺能力的提升主要依靠增加小眼的數(shù)目和增大復眼的體積來實現(xiàn)。

表1 各齡期葉蟬的前胸背板寬度、視覺參數(shù)（mean±SE）及其異速生長參數(shù)Table 1 The width of the pronotum, visual parameters (mean±SE) and their allometric growth parameters for each instar of E. onukii

2.3 不同齡期葉蟬復眼的光學靈敏度和視覺敏銳度

隨著葉蟬齡期增加，復眼中部區(qū)域的視桿長度顯著增長（F=278.59，df=6，P＜0.05，圖5A），同樣符合異速生長規(guī)律（a=1.22，b=0.036 ，R2=0.924） ， 從 1齡若蟲的(17.51±0.42)μm 增長至5 齡的(63.06±0.88)μm，待若蟲羽化后，雌雄蟲之間視桿長度存在顯著性差異（雌蟲L=86.46 μm，雄蟲L=78.14 μm，P＜0.05）。伴隨復眼中視桿長度的增長，其光學靈敏度從1 齡若蟲的0.04 μm2·sr 逐步提升至 5 齡的 0.11 μm2·sr，符合異速生長規(guī)律（a=0.88，b=4.47×10-4，R2=0.822，P=0.034）；但若蟲羽化后復眼視覺靈敏度降低，雌蟲復眼的靈敏度顯著低于雄蟲（雌蟲S=0.069 μm2·sr，雄蟲S=0.08 μm2·sr，P＜0.05），成蟲復眼光學靈敏度的下降導致其不再符合異速生長規(guī)律（R2=0.467，P=0.091，圖5B）。

圖5 各齡期葉蟬復眼中部區(qū)域視桿的長度和光學靈敏度的異速生長特征Fig. 5 The rhabdom lengths of each instar and the allometric growth characteristics of optical sensitivity in the center partial of compound eye of E. onukii

行為試驗中，空白對照內(nèi)若蟲的行為軌跡無方向性，呈曲線和螺旋狀（圖6A）；存在刺激光柵的情況下，葉蟬若蟲釋放后會在反應室內(nèi)隨機運動，待若蟲探測到刺激光柵后，開始進行無往返的趨向運動（圖6B～F），并且所有齡期的若蟲在行為試驗中均對黑色光柵呈現(xiàn)出趨向運動，1 齡和2 齡若蟲爬行速度緩慢，在搜尋過程中會有短暫的停頓，3 齡后的若蟲爬行速度變快，能夠很快接觸到刺激光柵。通過對行為試驗中R 點和刺激光柵的夾角分析，1 齡若蟲到5 齡若蟲的小眼間角顯著降低（F=22.15，df=6，P＜0.05），分別為(11.62±0.21)°、(11.48±0.27)°、(10.60±0.24)°、(9.80±0.25)°、(8.90±0.13)°，介于組織學結(jié)構(gòu)得到的小眼間角范圍內(nèi)（表1），葉蟬1～5 齡若蟲的視敏度分別為 0.086、0.088、0.094、0.102、0.112 cpd，若蟲復眼的視敏度符合異速生長規(guī)律（a=0.28，b=0.019，R2=0.925）。

圖6 行為試驗中若蟲的運動軌跡圖Fig. 6 Movement behavior trajectories of nymph of E. onukii in behavioral experiments

2.4 不同齡期若蟲復眼的有效視距評估

依托行為試驗得到的葉蟬小眼間角，模擬葉蟬在0、2、5 cm 和10 cm 下識別的茶梢圖像（圖7），隨著齡期的增大，葉蟬復眼對茶梢的有效識別視距逐漸增加；但是隨著觀測距離的增大，感知圖像的清晰度迅速降低，說明葉蟬若蟲對圖像細節(jié)的分辨能力非常有限，葉蟬若蟲的復眼僅具有低分辨率視覺。

圖7 各齡期葉蟬復眼對靜態(tài)圖像感知的模擬圖Fig. 7 Simulations of viewing distance of each instar of E. onukii

3 討論

昆蟲在生長發(fā)育過程中各部位的異速生長是為了適應外界環(huán)境進化保留下來的重要的發(fā)育特征[31]。小貫小綠葉蟬孵化后，1 齡若蟲往往只在其孵化的茶枝上活動，3 齡之后則善爬善跳，活動范圍明顯擴大[32]。復眼視敏度的逐步提高，使葉蟬可以感知臨近葉片或枝干的圖像細節(jié)，準確地判斷跳躍的位點，若蟲羽化后開始具備飛行能力，復眼視敏度可達到0.14 cpd 以上，有效視距進一步增大。但是為了優(yōu)先體型和運動相關器官的生長，葉蟬復眼整體視敏度的增速減緩，只有小眼數(shù)目的增速比體型快，表明葉蟬復眼在生長過程中更注重視野的增加，以便于捕捉更大范圍內(nèi)的視覺信號。

相較于視敏度，葉蟬復眼的光學靈敏度在生長過程中雖然也在增加，但并不符合異速生長規(guī)律。節(jié)肢動物在每次蛻皮后，新的小眼會出現(xiàn)在復眼的前端，導致原有的小眼會向后方移動。復眼后部區(qū)域的小眼直徑通常很大，由于受到前端小眼的擠壓，視桿會繼續(xù)生長而變長，因此節(jié)肢動物在停止生長后，復眼后部區(qū)域的小眼光學靈敏度也最高[2]，導致復眼不同區(qū)域在視覺功能上出現(xiàn)異質(zhì)化。葉蟬羽化后中部區(qū)域的光學靈敏度降低，但是復眼后部小眼的靈敏度顯著提升，同時在背側(cè)的復眼形成了高視敏度的“敏銳區(qū)”，符合復眼不同區(qū)域異速生長形成特殊功能區(qū)的策略[13]。如歐洲熊蜂（Bombus terrestris）和皺猛蟻（Rhytidoponera inomata）均是通過在有限的復眼上分化出特殊功能區(qū)，滿足對應齡期的行為需求[8-9]。雄性長尾管蚜蠅（Eristalis tenax）的復眼上存在高靈敏度的“亮區(qū)”，用來在明亮的環(huán)境中捕捉獵物或?qū)ふ遗渑糩33]。

值得注意的是，在尚未明確視覺信息到達視神經(jīng)后處理機制的情況下，組織學測量得到的視覺參數(shù)僅僅是基于復眼結(jié)構(gòu)的理論值。一些研究認為復眼視敏度在結(jié)構(gòu)分析和行為測試得到結(jié)果差異不大[24-25]，而另一些研究則認為行為測試遠低于組織學方法[22-23]，造成這種現(xiàn)象的原因多是由于復眼的區(qū)域化異速生長。由于行為試驗建立在昆蟲復眼的整體功能上，所以將復眼結(jié)構(gòu)分析與行為試驗相結(jié)合，能更精確地揭示昆蟲視覺在特定環(huán)境下的視敏度[34]。雖然葉蟬復眼的視敏度和靈敏度在生長發(fā)育后都有顯著提升，但是相較于活動范圍更大或者飛行能力更強的昆蟲，如蜜蜂、蝴蝶和蒼蠅的視敏度通常介于0.3～1.0 cpd，蜻蜓、螳螂等捕食性天敵的視敏度在1.0 cpd 以上[35]，葉蟬依然屬于低視覺分辨率的昆蟲。