高宇 徐暢 劉強

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192

在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居第4 位[1]。2020 年，全球有60.4 萬宮頸癌新發(fā)病例和34.2 萬宮頸癌死亡病例；中國約有11.0 萬例宮頸癌患者，其中包括5.9 萬死亡病例[2]。目前，宮頸癌的治療方法包括手術、化療和放療等[3]。宮頸癌Ⅰ B3～ⅣB 期患者均需行放療，然而約30%接受放療的患者會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)[4]。因此，研究影響宮頸癌細胞在放療后DNA損傷修復的分子機制對提高宮頸癌的放療效果具有重要意義。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是由原癌基因c-erbB1 編碼的Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶受體（TKR），其由1 210 個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約為170 000。EGFR 分為3個部分：與配體結(jié)合的細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有酪氨酸激酶活性的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。EGFR被認為與多種癌癥的預后有關，如頭頸癌、肺癌、食道癌和胃癌[5]。有研究報道，EGFR 信號通路在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要作用，其過表達或擴增在宮頸癌中發(fā)揮調(diào)控細胞輻射抗性的作用[6]。

核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，NRF2）在保護細胞免受氧化、親電等多種環(huán)境因素威脅，維持暴露在輻射或藥物下的細胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡方面具有重要作用。有研究結(jié)果證明，腫瘤細胞中NRF2 的過表達通常與輻射和化學耐藥性有關[7]。有文獻報道，在黑色素瘤細胞中，NRF2 可以促進EGFR 的激活，而在口腔癌細胞中EGFR 可以促進NRF2 的激活[8-9]。但在宮頸癌細胞中，關于EGFR 和NRF2 在輻射誘導的DNA 損傷修復中的關系目前鮮見報道。本研究旨在探討輻射后的宮頸癌HeLa 細胞中EGFR 和NRF2 對DNA 損傷修復的影響及其二者之間的相互關系，為指導宮頸癌的放療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 EGFR 與宮頸癌患者生存率的關系

通過cBioPortal（http://www.cbioportal.org）對癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者的數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 試劑與儀器

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、β-Tubulin抗體、Lamin B 抗體、NRF2 抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)親和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G、Cy3 標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G 購于美國Proteintech公司；EGFR 抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；p-共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因Rad3相關激酶（ataxia telangiectasia mutated gene and Rad3-related kinase，ATR）（Thr1989）抗體購于美國GeneTex 公司；p-細胞周期檢查點激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）（Ser345）和血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；磷酸化組蛋白H2A變異體（phosphorylated histone 2A variant，γ-H2AX）（Ser139）抗體購自英國Abcam 公司；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；RNAimax轉(zhuǎn)染試劑、NE-PER 細胞核和細胞質(zhì)提取試劑購自美國Thermo Fisher 公司；胎牛血清（FBS）購于日本HAKATA 公司；DMEM液體培養(yǎng)基購于美國HyClone 公司；4%組織固定液、牛血清白蛋白（BSA）、Opti MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；PBS緩沖液、Loading buffer、Tween-20、碘化丙錠（PI）溶液多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）購自北京索萊寶科技有限公司；快速RNA提取試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片劑購于北京Vectorlabs 公司；三乙醇胺緩沖液（tris buffered saline，TBS）為天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室自制；微型離心管（eppendorf，EP）購于天津本生健康科技公司；低溫臺式離心機（5424R 型）購于德國Eppendorf 公司；DMI3000B倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；37℃ 恒溫培養(yǎng)箱購自上海力申科學儀器有限公司；CFXConnect實時定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源購自加拿大Best Theratronics 公司。

1.3 細胞的培養(yǎng)、照射處理和分組

人宮頸癌HeLa 細胞由中國國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心提供。人宮頸癌HeLa 細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔48 h 傳代1 次，細胞消化液為胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）。

細胞經(jīng)137Cs γ 射線照射源進行單次8 Gy 照射，吸收劑量率為0.875 Gy/min。

將人宮頸癌HeLa 細胞按2 種處理方式分組：（1）采用siRNA 敲降HeLa 細胞中的EGFR，采用137Cs γ 射線照射源照射細胞。將HeLa 細胞分為對照組（HeLa siCtrl）、敲降EGFR 組（HeLa siEGFR）、照射組（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降EGFR+照射組（HeLa siEGFR+8 Gy）。采用免疫熒光實驗檢測細胞中γ-H2AX foci的數(shù)量；采用流式細胞術檢測細胞周期；采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測NRF2 下游靶基因；采用核質(zhì)分離實驗分離胞質(zhì)、胞核蛋白；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測NRF2、EGFR、HO-1 和ATR 在Thr1989 位點的磷酸化水平，CHK1 在Ser345 位點的磷酸化水平。（2）采用siRNA 敲降HeLa 細胞中的NRF2，采用137Cs γ 射線照射源照射細胞。將HeLa 細胞分為對照組（HeLa siCtrl）、敲降NRF2 組（HeLa siNRF2）、照射組（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降NRF2+照射組（HeLa siNRF2+8 Gy）。采用免疫熒光實驗檢測細胞中γ-H2AX foci 的數(shù)量。

1.4 siRNA 的轉(zhuǎn)染

EGFR 的siRNA 序列為：5′-GGAGAUAAGU GAUGGAGAUTT-3′

NRF2 的siRNA 序列為：5′-GGCAUUUCACU AAACACAATT-3′

轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的HeLa 細胞按5×105個/孔接種于6 孔板中，待細胞密度為50%左右時，更換為1 ml 新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取4 μl siRNA 和4 μl RNAimax 轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于200 μl Opti MEM 培養(yǎng)基中，將2 種溶液混合，使用移液器緩慢吹打混勻，室溫放置5 min。將混合液加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，緩慢晃動培養(yǎng)皿使其分布均勻。培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育8 h，加入1 ml 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（不含抗生素），繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 核質(zhì)分離實驗

照射后6 h，收集HeLa 細胞至EP 管，使用預冷的PBS 洗2 次，吸干PBS，加入含蛋白酶抑制劑的細胞質(zhì)提取試劑Ⅰ（CER Ⅰ），渦旋EP 管15 s，使細胞顆粒完全懸浮。將EP 管放在冰上孵育10 min，向EP 管中加入細胞質(zhì)提取試劑Ⅱ（CER Ⅱ），渦旋EP 管5 s；再將EP 管在冰上孵育1 min，渦旋5 s。將EP 管在離心機（16 000×g，4℃）中離心5 min，立即將上清液（細胞質(zhì)提取液）轉(zhuǎn)移到另一個干凈的EP 管中，加入1/3 體積的4×Loading buffer，混勻，100℃裂解變性10 min。將產(chǎn)生的含核的不溶性（球團）部分懸浮于含有蛋白酶抑制劑的核提取試劑（NER）中，將渦旋調(diào)至最高，渦旋15 s。將樣本放在冰上孵育，每10 min 渦旋15 s，共渦旋5 次。將樣本在離心機中以最大速度（16 000×g）離心10 s，立即將上清液（核提取液）轉(zhuǎn)移到一個干凈的預冷EP 管中，加入1/3 體積的4×Loading buffer，于100℃下進行10 min 裂解變性。

1.6 細胞免疫熒光實驗

將對數(shù)生長期的HeLa 細胞按1×105個/孔接種到12 孔板中的載玻片上，待細胞完全貼壁后進行8 Gy 照射，分別在照射6、12、24 h 后取出載玻片，用PBS 洗3 次，每次5 min；加入4%組織固定液，室溫固定20 min，之后再用PBS 洗3 次，每次5 min；使用預冷的0.3% 聚乙二醇辛基苯基醚（Trinton X-100）室溫處理載玻片30 min，PBS洗3 次，每次5 min。使用1% BSA（PBS 配置）4℃封閉載玻片2 h，在γ-H2AX 抗體中4℃孵育12 h，用PBS 洗3 次，每次5 min。用Cy3 標記的山羊抗鼠和兔免疫球蛋白G 室溫避光孵育載玻片1 h；用PBS 洗3 次，每次5 min。用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片劑封片，將載玻片轉(zhuǎn)移至倒置熒光顯微鏡下拍照并記錄細胞中γ-H2AX foci的數(shù)量。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

采用Western blot 法檢測EGFR、NRF2、ATR、p-ATR、CHK1、p-CHK1 的蛋白表達水平。分別提取各組HeLa 細胞的總蛋白，檢測蛋白濃度，取30 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入p-ATR（Thr1989）（1∶1 000）、p-CHK1（Ser345）（1∶1 000）、EGFR（1∶1 000）、NRF2（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、β-Tubulin（1∶5 000）、Lamin B（1∶5 000）一抗稀釋液，4℃ 孵育過夜，使用TBST（tris buffered saline with Tween-20）洗滌30 min，加入二抗（HRP偶聯(lián)親和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G）（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌30 min 后顯影。

1.8 RT-PCR

采用快速RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA），檢測EGFR、HO-1 基因的表達，同時檢測GAPDH基因的表達，作為內(nèi)參。擴增條件：95℃ 激活10 min；95℃ 變性 15 s、60℃ 退火1 min，循環(huán)35次。應用RT-PCR 儀分析熒光強度，采用2???Ct法對數(shù)據(jù)進行分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下。

GAPDH 引物序列：

正向5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′

反向5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′

EGFR 引物序列：

正向5′-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3′

反向5′-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3′

HO-1 引物序列：

正向 5′-CTTCTTCACCTTCCCCAACA-3′

反向 5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′

1.9 細胞周期的檢測

將對數(shù)生長期的HeLa 細胞按5×105個/孔接種于6 孔板中。待細胞完全貼壁后，對細胞進行8 Gy照射，6 h 后收集細胞，用PBS 清洗2 次，去除PBS后用預冷的70%乙醇4℃固定細胞2 h，4℃離心（2 000 r/min，離心半徑為10 cm，5 min）去除乙醇，使用預冷的PBS 清洗細胞1 次，去除PBS，使用碘化丙啶（PI）緩沖液重懸細胞，37℃避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.10 統(tǒng)計學方法

應用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗（方差齊）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 與宮頸癌患者生存率的關系

宮頸癌患者中存在5%的EGFR 基因突變，其中擴增型突變是主要的突變類型（圖1A）。與未發(fā)生EGFR 基因突變的宮頸癌患者相比，突變患者的生存期更短（圖1B）。以上結(jié)果提示EGFR 對宮頸癌患者的生存率至關重要，可作為宮頸癌的潛在治療靶標。

圖1 宮頸癌患者的EGFR 遺傳改變及與生存率的關系 A 為宮頸癌患者EGFR 基因突變的統(tǒng)計圖；B 為 EGFR 基因突變與宮頸癌患者生存率相關性的統(tǒng)計圖。EGFR 為表皮生長因子受體Figure 1 Genetic alterations of epidermal growth factor receptor in cervical cancer patients and its relationship with survival rate

2.2 EGFR、NRF2 對HeLa 細胞DNA 損傷修復能力的影響

細胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示，在8 Gy 照射后6、12、24 h，HeLa siEGFR 組細胞中γ-H2AX foci的數(shù)量均多于HeLa siCtrl 組[（94.00±1.00）% 對（89.67±2.03）%、（72.33±1.76）% 對（60.00±1.73）%、（43.00±2.31）% 對（26.33±1.20）%]，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）（圖2A）。8 Gy 照射后6、12、24 h，HeLa siNRF2 組細胞中γ-H2AX foci 的數(shù)量均多于HeLa siCtrl組[（96.67±0.88）%對（89.67±2.03）%、（77.33±1.20）% 對（60.00±1.73）%、（54.33±2.19）% 對（26.33±1.20）%]，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）（圖2B）。上述實驗結(jié)果表明，敲降EGFR 或者NRF2 均可降低人宮頸癌HeLa 細胞的DNA 損傷修復能力。

圖2 EGFR、NRF2 對人宮頸癌HeLa 細胞DNA 損傷修復的影響 A 為HeLa siCtrl 和HeLa siEGFR 組細胞經(jīng)8 Gy 照射后不同時間γ-H2AX foci 的形成圖及比較；B 為HeLa siCtrl 和HeLa siNRF2 組細胞經(jīng)8 Gy 照射后不同時間γ-H2AX foci 的形成圖及比較。a 表示與HeLa siCtrl 組細胞比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.919、4.919、6.402，均P<0.05）；b 表示與HeLa siCtrl 組細胞比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.166、4.989、11.220，均P<0.05）。EGFR 為表皮生長因子受體；NRF2 為核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子2；DNA 為脫氧核糖核酸；HeLa siCtrl 為對照組；HeLa siEGFR 為小干擾RNA 敲降EGFR 組；γ-H2AX 為磷酸化組蛋白H2A 變異體；HeLa siNRF2 為小干擾RNA 敲降NRF2 組；DAPI 為4，6-二脒基-2-苯基吲哚Figure 2 Effect of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 on DNA damage and repair of cervical cancer HeLa cells

2.3 EGFR 對NRF2 功能的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，HeLa 細胞經(jīng)8 Gy照射后，EGFR 和NRF2 蛋白水平均升高，在6 h時達到最大值（圖3A），提示在HeLa 細胞中EGFR和NRF2 可能在調(diào)控DNA 的損傷修復過程中發(fā)揮了重要作用。RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示，正常條件下敲降EGFR 對HO-1 表達無明顯影響，且差異無統(tǒng)計學意義（t=0.925，P>0.05）。與HeLa siCtrl 組細胞比較，HeLa siEGFR+8 Gy 的HO-1 表達下降66.66%（1.35±0.10 對0.45±0.02），且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），輻射可以導致NRF2 靶基因HO-1的表達水平升高（圖3B）。流式細胞術結(jié)果顯示，HeLa siCtrl、HeLa siEGFR、HeLa siCtrl+8 Gy、HeLa siEGFR+8 Gy 組細胞的G2 周期細胞比例分別是（18.83±0.44）%、（17.07±0.94）%、（44.90±2.81）%、（29.53±2.10）%，與HeLa siCtrl+8 Gy 組細胞相比，HeLa siEGFR+8 Gy 組的HeLa 細胞G2/M 期阻滯明顯受損，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3C）。Western blot 實驗結(jié)果顯示，敲降EGFR 顯著抑制了輻射導致的CHK1 的磷酸化和HO-1 蛋白水平的升高（圖3D）。以上實驗結(jié)果表明，電離輻射可以引起NRF2 和EGFR 蛋白水平升高、NRF2 下游的DNA 損傷響應信號通路和靶蛋白的激活以及G2/M期阻滯。敲降EGFR 會抑制電離輻射導致的NRF2下游的ATR-CHK1 信號通路的活化和HO-1 的激活，并且G2/M 期阻滯受損。

圖3 敲降EGFR 對HeLa 細胞中NRF2 下游信號通路及靶蛋白的影響 A 為Western blot 實驗檢測HeLa 細胞8 Gy 照射后2、4、6 h時EGFR 和NRF2 蛋白的表達水平；B 為RT-qPCR 實驗檢測HeLa 細胞敲降EGFR 后HO-1 基因的相對表達變化；C 為細胞周期實驗檢測EGFR 對輻射引起的HeLa 細胞G2/M 周期阻滯的影響；D 為Western bolt 實驗檢測EGFR 對CHK1-ATR 信號通路及HO-1 的影響。a 表示與HeLa siCtrl+8 Gy 組細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.782，P<0.05）；b 表示與HeLa siCtrl+8 Gy 組細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.384，P<0.05）。EGFR 為表皮生長因子受體；NRF2 為核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子2；RT-qPCR 為 實時熒光定量聚合酶鏈式反應；HO-1 為血紅素氧合酶1；CHK1 為細胞周期檢查點激酶1；ATR 為共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因Rad3 相關激酶；siCtrl 為對照組；β-Tubulin 為β-微管蛋白；siEGFR 為小干擾RNA 敲降EGFR 組；mRNA 為信使核糖核酸；DNA 為脫氧核糖核酸Figure 3 Effects of epidermal growth factor receptor knockdown on nuclear factor-E2-related factor 2 downstream signaling pathway and target protein in HeLa cells

2.4 敲降EGFR 對NRF2 核定位的影響

NRF2 進入細胞核中才能發(fā)揮輻射抵抗的作用，NRF2 的核定位對于響應電離輻射至關重要，我們采用核質(zhì)分離實驗來檢測EGFR 對NRF2 核定位的影響，結(jié)果如圖4 所示，敲降EGFR 會導致NRF2 蛋白水平下降；輻射使在細胞核內(nèi)定位的NRF2 蛋白增加，而敲降EGFR 會減少輻射導致的NRF2 蛋白在細胞核中的定位，說明EGFR 很可能通過促進NRF2 的核定位來調(diào)控輻射誘導的DNA損傷修復。

圖4 照射和未照射條件下敲降EGFR 后HeLa 細胞中EGFR、NRF2 蛋白在細胞質(zhì)和細胞核中表達水平的比較 EGFR 為表皮生長因子受體；NRF2 為核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子2；siCtrl為對照組；siEGFR 為小干擾RNA 敲降EGFR 組；Lamin B 為核纖層蛋白B；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 4 Comparison of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 protein expression levels in cytoplasm and nucleus of HeLa cells after knocking down epidermal growth factor receptor under irradiation and nonirradiation conditions

3 討論

放療是宮頸癌的主要治療方法之一，一半以上的宮頸癌患者需要接受放療[10]。近年來，隨著放療技術的發(fā)展，以三維體外照射及三維腔內(nèi)照射為主的放療新技術被廣泛應用，宮頸癌患者的治療取得了良好的效果，但輻射抗性仍是導致腫瘤復發(fā)或持續(xù)的主要因素，因此抑制腫瘤細胞DNA 的損傷修復仍非常必要[11]。有研究報道，大約70%的宮頸癌患者中存在EGFR 過表達的情況，并且EGFR過表達與疾病特異性生存期（DSS）的縮短相關[12]。本研究對癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)EGFR 突變的宮頸癌患者比例僅為5%，遠低于之前的研究結(jié)果[12]，但疾病特異性生存期（DSS）的縮短確實與EGFR 過表達相關，所以EGFR 的過表達可能更多發(fā)生在mRNA 或者蛋白水平。本研究的結(jié)果表明，照射后HeLa 細胞中EGFR 蛋白的表達水平明顯升高。為了進一步評估EGFR 對宮頸癌細胞DNA 損傷修復的影響，我們通過免疫熒光實驗觀察敲降EGFR后受照HeLa 細胞中的DNA 損傷情況，結(jié)果表明敲降EGFR 會降低HeLa 細胞的DNA 損傷修復能力。

輻射通過直接導致DNA 雙鏈斷裂或者產(chǎn)生活性氧間接對DNA 造成損傷。為了減輕對遺傳物質(zhì)的傷害，細胞會啟動DNA 損傷反應（DDR）促進對損傷DNA 的修復，使細胞周期進程停滯，為修復受損的DNA 提供足夠的時間[13-14]。通過Western blot、RT-qPCR 和流式細胞術實驗，我們發(fā)現(xiàn)敲降EGFR 后，受照射HeLa 細胞中ATR-CHK1 信號通路的激活受到抑制，HO-1 的表達水平降低、細胞G2/M 期阻滯受損。這提示EGFR 可能通過影響NRF2 的功能發(fā)揮輻射抵抗作用。

NRF2 是基礎亮氨酸拉鏈家族的成員，通過抗氧化反應元件（ARE）激活細胞內(nèi)編碼抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶的基因轉(zhuǎn)錄。一般情況下，Kelch 樣ECH 關聯(lián)蛋白1（Keap1）通過泛素介導的蛋白酶體降解負向調(diào)節(jié)NRF2 活性[15]。當細胞暴露于氧化、親電或外來生物刺激時，NRF2 會擺脫Kelch 樣ECH 關聯(lián)蛋白1（Keap1）的控制，轉(zhuǎn)位到細胞核中，與Maf 家族的一個小蛋白形成異源二聚體，調(diào)控含有抗氧化反應元件（ARE）的下游基因的轉(zhuǎn)錄[5,15]。有研究報道，NRF2 的細胞保護功能也可導致對腫瘤細胞的保護，從而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化、生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的形成[16]。有研究結(jié)果表明，NRF2 通過促進ATR 激活和G2/M 期阻滯來保持基因組的完整性，DNA 發(fā)生損傷時，ATR調(diào)控的一個主要應答過程是細胞周期阻滯。ATR可通過自身活化并磷酸化蛋白激酶CHK1 引起細胞周期阻滯[17]。通過核質(zhì)分離實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)敲降EGFR 明顯減少了輻射誘導的細胞核內(nèi)NRF2蛋白水平的增加。通過免疫熒光實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)敲降NRF2 后，HeLa 細胞的DNA 損傷修復能力降低，表明敲降EGFR 會導致NRF2 下游信號通路受阻，即電離輻射誘導HeLa 細胞DNA 損傷修復有賴于EGFR 的表達。但目前我們還不確定EGFR是如何調(diào)控NRF2 在胞內(nèi)的分布，在今后的研究中，將進一步探索EGFR 對NRF2 作用的具體機制。

綜上所述，本研究采用人宮頸癌HeLa 細胞，從細胞及分子水平證實電離輻射后EGFR 可促進NRF2 蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而激活NRF2 下游的ATR/CHK1 信號通路及靶基因HO-1 的表達，提高細胞的DNA 損傷修復能力。因此，我們發(fā)現(xiàn)了EGFR 在人宮頸癌HeLa 細胞輻射抗性中發(fā)揮作用的一種可能機制，為靶向EGFR 在宮頸癌臨床治療中的應用提供了分子基礎及理論依據(jù)。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明高宇負責實驗的實施、論文的撰寫與修訂；徐暢負責方法的建立、數(shù)據(jù)的分析、論文的審閱；劉強負責研究命題的設計、論文的修訂