馬天星 李金田 張毅 梁建慶

甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，蘭州 730000

目前，放療已成為治療惡性腫瘤的重要方法[1]。放療過程中產(chǎn)生的放射生物學效應不僅局限于腫瘤細胞，正常組織也不可避免地會受到輻照，導致旁細胞發(fā)生相似的生物學效應[2]。輻射旁效應（radiation bystander effect, RIBE）的研究方法包括體內(nèi)和體外2 種；其發(fā)生機制可通過輻照細胞和旁細胞之間的直接接觸，由間隙連接細胞間通訊（gap junctional intercellular communication，GJIC）傳遞，或由外泌體、可溶性的損傷信號或應激信號（如活性氧、NO、細胞因子等）通過被動擴散與旁細胞或質(zhì)膜上的受體相互作用[2]。筆者就RIBE 的研究方法及發(fā)生機制進行綜述。

1 RIBE 的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

自倫琴發(fā)現(xiàn)X 射線以來，輻射在疾病的診斷和治療中發(fā)揮了重要作用。輻射在殺傷靶細胞的同時，也會損傷周圍正常組織，即輻射產(chǎn)生的非靶向效應[3]，它是指輻照靶細胞通過一定的途徑將輻射損傷傳輸信號傳遞至未受到輻照的正常細胞，并產(chǎn)生各種生物學效應的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象被命名為RIBE，其影響包括但不限于DNA 損傷反應、細胞凋亡、遺傳損傷、基因組不穩(wěn)定性等[4]。RIBE 最早在上世紀50 年代被發(fā)現(xiàn)[5]，1992 年在Nagasawa 和Little[3]對中國倉鼠卵巢細胞的研究中得以正式命名，該研究結(jié)果顯示，α 粒子輻照僅0.1%～1.0% 的細胞時，其他30%～50%的細胞中也會發(fā)生姐妹染色單體交換。1997 年，Mothersill 和Seymour[6]應用條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移的方法，發(fā)現(xiàn)來自上皮細胞的輻照培養(yǎng)基對未輻照的成纖維細胞產(chǎn)生旁效應，該研究結(jié)果表明分泌到培養(yǎng)基中的可溶性因子可誘導RIBE。之后的研究結(jié)果顯示，間隙連接、外泌體可以介導細胞間通信，在輻照細胞和非靶向鄰近細胞之間傳遞旁效應信號[7-8]。自此，對RIBE 的研究越來越廣泛，研究的內(nèi)容包括不同的能量、輻射質(zhì)量、線性能量轉(zhuǎn)移、輻射場、細胞類型及種類、反應時間（包括輻照后時間和介質(zhì)暴露時間）、目標區(qū)域、細胞轉(zhuǎn)移方法等。研究結(jié)果證實，RIBE 在輻射劑量為0.5～5.0 Gy時表現(xiàn)出非線性劑量反應，在高劑量輻照時大多數(shù)細胞因直接暴露而發(fā)生嚴重損傷，因此，中低劑量輻照對RIBE 的產(chǎn)生有顯著影響[9]。

2 RIBE 的研究現(xiàn)狀

2.1 體外研究

體外研究主要采用共培養(yǎng)（直接接觸共培養(yǎng)、間接接觸共培養(yǎng)）體系和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移實驗的研究方法。

共培養(yǎng)體系是將未輻照細胞與輻照細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，觀察輻照細胞對未輻照細胞的影響。體外研究結(jié)果表明，RIBE 可由鄰近受輻照的同源細胞啟動[10]。有研究者采用Transwell insert 共培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察人成纖維細胞WS1 與被α 粒子輻照的人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT 共培養(yǎng)后介導的RIBE，結(jié)果表明，未輻照的WS1 細胞與輻照后的HaCaT 細胞共培養(yǎng)30 min 后，其活性氧水平顯著升高，共培養(yǎng)3 h 后，DNA 損傷標志物53BP1 的水平發(fā)生明顯變化，這表明與輻照后的HaCaT 細胞共培養(yǎng)后，WS1 細胞發(fā)生了氧化應激和DNA 損傷[11]。Dong 等[12]利用12C 輻照人巨噬細胞U937，并與未輻照的人B 淋巴母細胞HMy 共培養(yǎng)，檢測輻照U937 細胞中絲裂原激活蛋白激酶、NO 和活性氧的變化，結(jié)果表明共培養(yǎng)體系誘導了HMy 細胞中額外的微核形成，且這種旁細胞微核形成量取決于共培養(yǎng)的時間長短。

培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移實驗是指用一定劑量的射線輻照培養(yǎng)細胞，通過收集輻照細胞的條件培養(yǎng)基，并刺激未輻照細胞，即“刺激液模式”檢測其對未輻照細胞誘導的損傷。Leu等[13]通過此方法發(fā)現(xiàn)暴露于低劑量輻照后的細胞會誘導RIBE，從而促進未輻照腫瘤細胞的遷移和侵襲。Feghhi 等[14]也發(fā)現(xiàn)，使用輻照后人乳腺癌細胞MCF-7 的培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞，后2 種細胞均表現(xiàn)出與MCF-7 細胞損傷相似的生物學效應，如活性氧水平升高和細胞活力降低等。Mutschelknaus 等[15]從輻照的頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞的條件培養(yǎng)基中分離出外泌體并注入未輻照的HNSCC 細胞中，通過激活蛋白激酶B（AKT）信號通路和細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶來促進細胞遷移，結(jié)果證實來自輻照HNSCC 細胞的條件培養(yǎng)基中分離出的外泌體誘導了未輻照HNSCC 細胞發(fā)生遷移。

2.2 體內(nèi)研究

近年來，越來越多的文獻報道了關于體內(nèi)RIBE 的特征性研究，并已證實在生物體內(nèi)相鄰組織間可發(fā)生RIBE[16]。體內(nèi)研究結(jié)果表明，影響RIBE 的因素包括炎癥、免疫應答及組織微環(huán)境中產(chǎn)生的體內(nèi)信號等[17]。一項近期的研究結(jié)果顯示，在輻射誘導的直腸損傷小鼠模型中，直腸組織高缺氧區(qū)附近出現(xiàn)了細胞凋亡的增加，在缺氧的細胞外囊泡（extracellular vehicles，EV）中提取的miR-122-5p 通過DNA損傷標志物人磷酸化組蛋白（γH2AX）的形成來促進腸上皮細胞的凋亡[18]。Chai 等[19]通過采用5 Gy X 射線輻照轉(zhuǎn)基因小鼠下腹部，發(fā)現(xiàn)非靶區(qū)肺組織和肝臟組織中轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）及其受體的表達增加，另外還發(fā)現(xiàn)了支氣管上皮細胞的DNA 損傷。有研究者報道，大鼠經(jīng)顱內(nèi)輻照后，循環(huán)血液中的C 反應蛋白水平升高，脾細胞表現(xiàn)出氧化應激水平升高和細胞凋亡增加，將從全身輻照后小鼠循環(huán)血中分離的EV 注射到未輻照小鼠體內(nèi)，導致了小鼠旁組織脾臟中的脂質(zhì)過氧化和活性氧水平升高[20]。另一項實驗結(jié)果與該研究結(jié)果一致，顯示了外泌體中差異表達的miR-7 可靶向介導小鼠顱腦輻照后旁組織肺發(fā)生自噬反應[21]。

3 RIBE 發(fā)生機制的研究現(xiàn)狀

RIBE 發(fā)生的潛在分子機制涉及很多方面（圖1）。輻照細胞會導致復雜的DNA 損傷反應。由直接輻照細胞產(chǎn)生的活性氧和活性氮可以通過GJIC 傳遞到旁細胞中，也可以通過氧化應激反應以NO 依賴的方式釋放到旁細胞，過多的NO 與氧自由基反應生成活性氮，最終導致旁細胞DNA 損傷。輻照細胞釋放的炎癥細胞因子可以通過其相應的膜受體與旁細胞結(jié)合，啟動相關信號通路（核因子κB、絲裂原激活蛋白激酶等），隨后誘導細胞因子、環(huán)氧合酶2 和一氧化氮合成酶的表達。因DNA 損傷而發(fā)生凋亡的輻照細胞可能向旁細胞發(fā)出“危險信號”，這些信號在RIBE 的傳遞中也發(fā)揮了重要作用。此外，直接輻照細胞通過外泌體分泌的微小RNA（miRNA）可誘導旁細胞發(fā)生RIBE。

圖1 輻射旁效應發(fā)生的分子機制 NOS 為一氧化氮合成酶；ROS 為活性氧；ATM 為毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變基因；NF-κB 為核因子κB；TGF-β 為轉(zhuǎn)化生長因子β；IL-1、6、8 分別為白細胞介素1、6、8；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；iNOS 為誘導型一氧化氮合成酶；GJIC 為間隙連接細胞間通訊；RNS 為活性氮；IL-1R、6R、8R 分別為白細胞介素1、6、8 受體；TNFR1 為腫瘤壞死因子受體1；TGFR 為轉(zhuǎn)化生長因子受體；COX2 為環(huán)氧合酶2；MAPK 為絲裂原激活蛋白激酶；miRNA 為微小RNA；DAMP 為損傷相關分子模式Figure 1 Molecular mechanism of radiation bystander effect

3.1 GJIC 作用

GJIC 是由連接蛋白形成的簇狀細胞管道結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量為1 000～1 500 的分子可經(jīng)GJIC 在輻照細胞與未輻照旁細胞之間進行信號傳輸和物質(zhì)交換，通過該通道的重要分子包括蛋白質(zhì)、二級信使和核苷酸[22]。Kobayashi等[23]利用質(zhì)子束輻照肺癌A549 細胞，并將其與正常人胚肺成纖維細胞WI-38 共培養(yǎng)，加入GJIC 抑制劑18α-甘草次酸，于輻照后24 h 在輻照細胞和旁細胞中檢測磷酸化組蛋白水平，結(jié)果顯示肺癌A549 細胞與正常人胚肺成纖維細胞WI-38 之間的GJIC 參與了DNA 損傷信號的傳遞。Autsavapromporn 等[24]也通過GJIC 抑制劑顯著抑制了旁細胞微核的誘導，并且發(fā)現(xiàn)抑制GJIC 會抑制人肺癌A549 細胞的損傷信號，從而導致正常人胚肺成纖維細胞WI-38 的DNA 損傷減少。Arora 等[25]的研究結(jié)果顯示，順鉑通過GJIC 誘導旁細胞產(chǎn)生毒性反應時，其對旁細胞的損傷作用由輻照癌細胞密度決定，僅在高密度間隙連接結(jié)構(gòu)形成，靶向抑制連接蛋白43 時，旁細胞不產(chǎn)生毒性損傷反應，表現(xiàn)為輻照癌細胞對順鉑耐藥，表明GJIC 有增強順鉑對旁細胞毒性損傷的作用，且其作用大小與連接蛋白的表達呈正相關。因此，GJIC 是RIBE 發(fā)生的機制之一，GJIC 通過連接蛋白介導RIBE。

3.2 外泌體作用

外泌體是由多種細胞分泌的多形性EV，內(nèi)含mRNA、微小RNA（miRNA）、RNA，相關研究結(jié)果顯示，輻照細胞或旁細胞分泌的外泌體參與了惡性腫瘤對輻射的系統(tǒng)反應，且受輻射類型、時間、劑量和暴露的細胞類型的影響[26]。Mo 等[27]的研究結(jié)果表明，外泌體中的微小RNA（miRNA）在RIBE 的啟動中起著重要作用，正常人支氣管上皮細胞受到輻照后，外泌體分泌的miR-1246 水平升高，并轉(zhuǎn)移到未輻照細胞中，通過直接抑制DNA 連接酶4 引起DNA 損傷。miR-34c 也可由輻照細胞的EV 轉(zhuǎn)移到未輻照細胞中，抑制未輻照細胞集落形成[28]。有研究者分別于全身和局部輻照后不同時間點（24 h、15 d）提取小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中的外泌體，并將其轉(zhuǎn)移到未輻照小鼠胚胎成纖維細胞中，結(jié)果顯示，全身和局部輻照增加了輻照小鼠胚胎成纖維細胞中外泌體的數(shù)量，且接受全身和局部外泌體處理后15 d的細胞活力及DNA 損傷程度較處理后24 h 顯著下降[29]。此外，腫瘤來源的外泌體可以通過減少T 淋巴細胞和自然殺傷細胞的增殖和分化，參與免疫抑制反應，從而促進腫瘤的發(fā)生。Freudenmann[30]等發(fā)現(xiàn)，外泌體分泌的L-絲束蛋白可誘導腫瘤細胞遠端增殖及克隆形成增加，但輻射會使L-絲束蛋白分泌減少，從而減少腫瘤細胞遠端增殖和克隆形成，因此，減少外泌體L-絲束蛋白的產(chǎn)生也是RIBE的誘因。由輻照細胞或旁細胞釋放的外泌體可導致受體細胞產(chǎn)生2 種相反的功能：首先是細胞保護功能，即DNA 損傷修復和細胞存活能力提升；其次是細胞毒性功能，即炎癥、染色體損傷和細胞凋亡的發(fā)生。

3.3 細胞因子作用

細胞因子是先天免疫反應中信號轉(zhuǎn)導的常見信號因子，通過自分泌或旁分泌機制發(fā)揮作用，與RIBE 的發(fā)生有關，能對輻射產(chǎn)生積極響應，并影響生物體的放射損傷及修復過程[31]。輻射產(chǎn)生的可溶性生物信號分子，如脂質(zhì)過氧化物、次黃嘌呤及細胞活素，其可相互結(jié)合，將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)，后傳遞到周圍旁細胞中，與旁細胞膜受體的結(jié)合激活了核轉(zhuǎn)錄因子，從而引發(fā)了RIBE[32]。相關研究結(jié)果顯示，TGF-β1、TNF-α、趨化因子家族成員、核因子κB、絲裂原激活蛋白激酶等細胞因子及相關信號通路在RIBE 的發(fā)生中發(fā)揮了關鍵作用[33]。TGF-β1 是一種具有多種功能的細胞因子，主要參與細胞增殖、分化、黏附、遷移、凋亡及免疫調(diào)節(jié)。一項研究結(jié)果顯示，采用 TGF-β1抑制劑預處理未輻照細胞，輻照后發(fā)現(xiàn)旁細胞氧化應激和DNA 損傷反應減輕，這說明旁細胞中的TGF-β1 信號通路可能被條件培養(yǎng)基中的旁信號因子激活，從而介導RIBE[34]。Temme 和Bauer[35]發(fā)現(xiàn)γ 射線輻照人胃癌MKN-45 細胞產(chǎn)生的超氧陰離子可通過輻照培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到未輻照人胃癌MKN-45 細胞中，TGF-β1 在MKN-45 旁細胞產(chǎn)生超氧陰離子過程中起著主導作用，TGF-β1 足以介導低劑量輻射引發(fā)的RIBE。TNF-α 是一種重要的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，影響多種正常細胞的生長，在輻照腫瘤細胞所誘導的長期RIBE 中起著主導作用，可誘導NO 和一氧化氮合成酶的合成，加重了腫瘤周圍正常組織的炎癥反應[36]。Nogueira-Pedro[37]等通過低劑量輻射輻照小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，然后采用TNF-α 刺激，并在旁細胞（小鼠脾細胞）中培養(yǎng)，結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細胞中NO 的水平因受到TNF-α 的刺激而升高，此外，低劑量輻射聯(lián)合TNF-α 刺激的骨髓間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基降低了旁細胞的增殖及代謝活性。趨化因子家族相關成員白細胞介素1（interleukin，IL-1）、IL-6、IL-8 等具有介導細胞在炎癥部位聚集、活化、修復損傷組織的功能[38]。有研究結(jié)果顯示，活性氧可以誘導RIBE 中IL-6 的長期釋放，IL-6 參與了放療后肝膽腫瘤細胞中乙型肝炎病毒的重激活，且來自輻照腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基導致了旁細胞克隆存活率的升高，其克隆存活率的變化與IL-6和IL-8 的水平相關[39]。為闡明輻照引起的RIBE 的信號傳輸機制，有研究者通過直接輻照人皮膚成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)旁細胞中核因子κB 依賴的基因IL-6 和IL-8 表達升高，證實了核因子κB 在RIBE 的激活中發(fā)揮重要作用[40]。核因子κB及絲裂原激活蛋白激酶作為許多基因的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞對刺激的反應過程，二者協(xié)同參與了RIBE 的激活[41]。

3.4 氧化應激調(diào)控作用

氧化應激是由于活性氧和活性氮產(chǎn)生過多，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 損傷，而活性氧作為氧化應激反應中誘導RIBE 的首要因素，可直接由輻照細胞的分解產(chǎn)物產(chǎn)生，或間接由炎癥反應產(chǎn)生，再通過主動運輸、被動擴散或間隙連接轉(zhuǎn)導至鄰近細胞[42]。有研究者發(fā)現(xiàn)，人類造血干細胞對活性氧高度敏感，RIBE 可誘導人類造血干細胞旁細胞中的DNA 損傷，輻照產(chǎn)生的過量活性氧可導致線粒體功能障礙，進而使ATP 的產(chǎn)生減少，誘導細胞凋亡，該研究還證明了多種抗氧化劑可以減輕RIBE 對旁細胞的損傷[43]。Tian 等[11]還發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞中的抗氧化劑超氧化物歧化酶2 參與了RIBE，其過表達消除了旁細胞人成纖維細胞WS1 的氧化應激和DNA 損傷。一項研究評估了大鼠盆腔輻照后不同時間點旁組織肺的氧化損傷情況，結(jié)果顯示，盆腔輻照引起了遠處肺組織的氧化損傷，導致超氧化物歧化酶活性急劇下降，證實了活性氧在誘發(fā)RIBE 中的作用與輻照后時間密切相關[44]。此外，NO 在介導RIBE 中的作用已被廣泛研究，輻照旁細胞中的氧化代謝失調(diào)會導致細胞內(nèi)環(huán)氧合酶2 和一氧化氮合成酶的表達升高, 從而促進NO 等超氧化物的產(chǎn)生，細胞內(nèi)高水平的NO 可導致線粒體膜滲漏并致其功能缺陷，使超氧陰離子釋放到細胞質(zhì)中，又能使旁細胞的氧化應激反應增加[2]。由此可見，線粒體作為關鍵細胞器在RIBE 中發(fā)揮了重要作用，一方面因線粒體被認為是內(nèi)源性活性氧的主要來源，這些活性氧在ATP 產(chǎn)生過程中釋放；另一方面，由于線粒體膜電位的變化，細胞內(nèi)高水平的活性氧、NO 又會導致線粒體的功能缺陷[32]。有研究結(jié)果表明，輻射通過使線粒體活性氧持續(xù)釋放導致細胞抗氧化劑谷胱甘肽水平降低，引起輻照細胞的慢性氧化應激，導致線粒體DNA 損傷，證實了線粒體DNA 損傷可作為評估輻射影響的標志物[45]。

4 小結(jié)與展望

綜上，RIBE 的發(fā)生機制是由細胞中GJIC 或可溶性細胞因子與鄰近細胞發(fā)生信號傳遞，激活多個通路，調(diào)節(jié)旁細胞產(chǎn)生損傷反應，與此同時外泌體也可介導細胞間通信，發(fā)揮RIBE 的傳遞作用。輻照產(chǎn)生的活性氧在被輻照直接靶向的細胞中的累積效應可以觸發(fā)旁信號通路的激活，由這種信號通路誘導的細胞因子可以改變非靶向的旁細胞的氧化應激狀態(tài)。除了上述機制外，與氧化應激反應機制相關的應激顆粒首次被確定為輻照細胞條件培養(yǎng)基中潛在的RIBE 生物標志物[46]。經(jīng)文獻總結(jié)發(fā)現(xiàn)，RIBE 的激活途徑因細胞類型的不同而發(fā)生變化，且依賴于輻照劑量與時間，每種細胞因子表達的不同取決于激活的DNA 傳感器的不同組合[47]。

RIBE 的客觀存在，對輻射防護安全標準的制定及輻射生物學傳統(tǒng)理論的創(chuàng)新提出了新的挑戰(zhàn)，希望在不久的將來，通過對其新的分子機制包括通路的激活時間以及不同輻照劑量誘導的細胞因子表達變化的深入研究，能夠?qū)椛淇赡軐е碌膿p傷的風險進行準確評估，建立最優(yōu)化模型，研發(fā)輻射防護新藥，對輻射損傷的防護及腫瘤的治療提供新方法和新思路。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明馬天星負責文獻的查閱、綜述的撰寫；李金田、張毅、梁建慶負責綜述的審閱與最終版本的修訂