王志鑫 王美玉 郭浩鑫 杜麗 王易龍 楊陟華 朱茂祥

1 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京市放射生物學(xué)重點實驗室，北京 100850；2 河北大學(xué)生命科學(xué)院，保定 071002；3 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，衡陽 421001

放射療法是胸部腫瘤的治療方法之一，其通常會引起放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI），發(fā)生率為5%～20%[1]。RILI 是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，涉及多種細胞、途徑和機制[2-3]。有研究結(jié)果顯示，胸部在受到照射后的早期，肺組織會出現(xiàn)明顯的免疫失衡現(xiàn)象[4-5]。我們的前期研究結(jié)果顯示，輻射損傷的肺上皮細胞可能會刺激樹突狀細胞的抗原呈遞功能進而激活T 細胞；在樹突狀細胞不存在的情況下，輻射損傷的肺上皮細胞依舊能活化T 細胞[6]。外泌體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，其可以攜帶信息物質(zhì)參與細胞間通信。Ikhlas 等[7]的研究結(jié)果顯示，受損的非專職性抗原呈遞細胞分泌的外泌體可以參與免疫反應(yīng)。而Liu 等[8]的研究結(jié)果顯示，肺組織中的細胞外囊泡主要來源于Ⅱ型肺上皮細胞。我們通過體外模擬肺部微環(huán)境中的細胞間通信，以期發(fā)現(xiàn)外泌體參與RILI 過程的途徑，為RILI 的臨床研究提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

小鼠肺上皮MLE-12 細胞（簡稱MLE-12 細胞）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）細胞庫。無特定病原體級雄性C57BL/6 WT 小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2021-0006]，6～8 周齡、體重（20±2）g。所有動物實驗均在軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物管理與使用委員會的指導(dǎo)下進行，本研究經(jīng)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：IACUC-DWZX-2021-731）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自中國四季青公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；外泌體流式試劑盒購自日本W(wǎng)ako公司；EasySep 小鼠初始T 細胞分離試劑盒購自加拿大Stemcell 公司；外泌體抑制劑GW4869 購自美國MedChemExpress公司；細胞蛋白裂解液和增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光液購自美國Thermo公司；外泌體專用裂解液購自中國宇玫博公司；BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒和牛血清白蛋白（簡稱BSA）購自中國翌圣公司；鼠抗鼠腫瘤易感基因（tumor susceptibility gene，TSG）101、溶酶體相關(guān)膜蛋白3[別稱分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）63]和四次跨膜蛋白28（別稱CD81）抗體購自美國Santacruz 公司；兔抗鼠Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白（Calnexin）抗體購自中國愛博泰克公司；兔抗鼠Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC Ⅰ）抗體和兔抗鼠Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體 （major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ）抗體購自中國碧云天公司；山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G（H+L）-辣根過氧化物酶（HRP）和山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP 購自中國三箭公司；抗小鼠MHC Ⅰ-AF647、早期活化抗原1（別稱CD69）-BV421 抗體和死細胞染料購自美國Biolegend 公司；抗小鼠MHC Ⅱ-異硫氰酸熒光素（FITC）、免疫調(diào)節(jié)蛋白B7-1（別稱CD80）-PerCPCy5.5、免疫調(diào)節(jié)蛋白B7-2（別稱CD86）-PE-Cy7、CD3-FITC、CD4-PE-Cy7、CD8-PerCP 和T 細胞特定表面糖蛋白CD28-PE 抗體購自美國BD 公司。FlowJo 10.6.2 軟件購自美國Tree Star 公司；37℃恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司；CP100NX 超速離心機購自日本Himac 公司；Zetaview 納米顆粒跟蹤分析儀購自德國PMX 公司；H-7650 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）購自日本HITACHI 公司；BD FACS AriaTMⅡ流式細胞儀購自美國BD 公司；R2089 型60Co γ 射線照射源購自英國維瑞斯公司，劑量率為59.09 cGy/min，位于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院60Co 源照射室。

1.2 細胞培養(yǎng)、照射及外泌體的分離鑒定

照射前12 h，將2×106個MLE-12 細胞接種于含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，并將其分為對照組和γ 射線照射組（2、4、6、8 Gy）。照射后用PBS 洗滌細胞2 次，將培養(yǎng)基改為含有去外泌體（簡稱D-exo）的10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基。在4℃條件下，將FBS 經(jīng)100 000×g（P70AT 轉(zhuǎn)子）超速離心18 h，以去除FBS 來源的外泌體，制為D-exo FBS。

D-exo FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)MLE-12 細胞12、24、48 h 后收集其上清液以提取外泌體。上清液經(jīng)300×g離心10 min 去除細胞，經(jīng)2 000×g離心10 min去除死細胞，經(jīng)10 000×g離心30 min 去除細胞碎片。用0.22 μm 的過濾器過濾以上經(jīng)過多步離心的培養(yǎng)基。過濾后的培養(yǎng)基經(jīng)100 000×g（P70AT 轉(zhuǎn)子）超速離心1.5 h 提取外泌體。棄上清，加入13 ml PBS 洗滌外泌體，100 000×g（P40ST 轉(zhuǎn)子）條件下再次超速離心1.5 h 沉淀外泌體。上述離心操作均在4℃條件下完成。將外泌體重懸于100 μl PBS（或適量蛋白裂解液）中，用于進一步分析或細胞共培養(yǎng)。

采用TEM 和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）對外泌體進行鑒定。采用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（簡稱NTA）測量外泌體的粒徑和數(shù)量。外泌體流式試劑盒用于間接分析外泌體表面標(biāo)志物MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80 和CD86。

1.3 初始T 細胞的分選及與外泌體共培養(yǎng)

使用EasySep 小鼠初始T 細胞分離試劑盒從雄性C57BL/6 WT 小鼠脾臟的單細胞懸浮液中分離CD3+初始T 細胞。分離細胞結(jié)束后，在含有10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中將T 細胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/ml。

為了探索外泌體是否激活T 細胞，將初始T 細胞分別與6 Gy γ 射線（依據(jù)前期實驗室構(gòu)建的細胞共培養(yǎng)模型，我們選擇γ 射線照射的劑量為6 Gy[6]）照射組的MLE-12 細胞（簡稱IR MLE-12）產(chǎn)生的外泌體（簡稱exo/IR-MLE）和對照組MLE-12 細胞（簡稱NC MLE-12）分泌的外泌體（簡稱exo/NC-MLE）共培養(yǎng)12、24 h，采用流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測T 細胞活化標(biāo)志物CD28 和CD69。

納米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測外泌體濃度后，將其稀釋至5×109/ml。將初始T 細胞以1×106個/孔接種在6 孔板中，并與外泌體以1∶500 的比例分別共培養(yǎng)12、24 h。

1.4 初始T 細胞與MLE-12 細胞共培養(yǎng)

為了探索抑制外泌體后的MLE-12 細胞是否不再激活T 細胞，將初始T 細胞分別與IR MLE-12、NC MLE-12 和外泌體抑制劑GW4869 處理的MLE-12細胞共培養(yǎng)。6 Gy γ 射線照射前12 h，將MLE-12細胞以4×105個/孔接種在6 孔板中。照射后，將初始T 細胞和MLE-12 細胞以5∶2 的比例共培養(yǎng)，于12、24 h 后收集重懸的細胞。外泌體抑制劑GW4869 處理組在接種MLE-12 細胞時和共培養(yǎng)期間均給予GW4869，其濃度為10 μmol/L。

1.5 WB 實驗

使用0.25%的胰蛋白酶消化并收集MLE-12細胞，經(jīng)PBS 洗滌2 次后，在4℃條件下，300×g離心5 min。將適量的細胞蛋白裂解液加入細胞沉淀中并于冰上孵育15 min。孵育結(jié)束后120 000×g離心10 min 以沉淀細胞碎片，并將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。使用外泌體專用裂解液從外泌體中提取蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測提取的蛋白質(zhì)濃度。

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用含0.5%牛血清白蛋白的TBST（Tris Buffered Saline with Tween 20）緩沖液室溫（25℃）孵育膜1 h 以封閉膜上的未結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，4℃孵育一抗12 h。用于檢測目標(biāo)蛋白的一抗為TSG101（1∶500 稀釋）、CD63（1∶500稀釋）、CD81（1∶500 稀釋）、Calnexin（1∶1 000稀釋）、MHC Ⅰ（1∶500 稀釋）和MHC Ⅱ（1∶1 000稀釋）。一抗孵育結(jié)束后，用TBST 洗滌膜3 次，每次10 min。室溫下孵育二抗（1∶4 000 稀釋）1 h，二抗孵育結(jié)束后，用TBST 緩沖液洗滌膜3 次，每次10 min。使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）曝光條帶，曝光時間在5 min 內(nèi)。

1.6 FCM

用抗小鼠MHC Ⅰ-AF647 抗體、抗小鼠MHC Ⅱ-FITC 抗體、CD80-PerCP-Cy5.5 抗體和CD86-PE-Cy7抗體標(biāo)記外泌體-免疫磁珠復(fù)合物懸液，以檢測外泌體表面抗原呈遞相關(guān)分子MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80 和CD86；用CD3-FITC 抗體、CD4-PE-Cy7抗體、CD8-PerCP 抗體、CD28-PE 抗體、CD69-BV421 抗體和死細胞染料標(biāo)記T 細胞懸液，以檢測T 細胞表面標(biāo)志物CD3、CD4、CD8、CD28 和CD69。使用流式細胞儀分析細胞，F(xiàn)lowJo 10.6.2軟件分析數(shù)據(jù)，基于死細胞染料排除死細胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組間比較采用兩獨立樣本t檢驗（方差齊），多組間比較采用方差分析法分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 調(diào)整法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLE-12 細胞分泌的外泌體

TEM 和納米顆粒跟蹤分析技術(shù)結(jié)果顯示，正常MLE-12 細胞分泌的外泌體具有典型的一面凹陷的茶托樣結(jié)構(gòu)，粒徑為30～150 nm（圖1A、1B）。WB 結(jié)果顯示，與MLE-12 細胞相比，其外泌體中特異性標(biāo)志物CD63、CD81 和TSG101 高表達，而陰性標(biāo)志物Calnexin低表達（圖1C）。以上研究結(jié)果與國際細胞外囊泡協(xié)會發(fā)布的細胞外囊泡最小鑒定標(biāo)準(zhǔn)[9]一致。另外，與對照組相比，在6 Gy γ 射線照射后不同時間（12、24 和48 h）以及不同劑量γ 射線（2、4、6 和8 Gy）照射后24 h，單個MLE-12 細胞分泌的外泌體數(shù)量于24、48 h 時均明顯增加（t=5.36、6.66，均P<0.05，圖1D），且具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在照射劑量為6、8 Gy時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.14、5.67，均P<0.05，圖1E）。

圖1 γ 射線照射前后小鼠肺上皮MLE-12 細胞分泌的外泌體情況 A 為透射電子顯微鏡下NC MLE-12 分泌的外泌體的形態(tài)；B 為納米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測exo/NC-MLE 的粒徑；C 為蛋白質(zhì)印跡法鑒定的外泌體特異性標(biāo)志物（CD63、CD81 和TSG101）和陰性標(biāo)志物（Calnexin）的表達情況；D 為MLE-12 細胞經(jīng)0 和6 Gy γ 射線照射后不同時間（12、24、48 h）單個細胞分泌的外泌體數(shù)量；E 為不同照射劑量（0、2、4、6、8 Gy）照射MLE-12 細胞后24 h 單個細胞分泌的外泌體數(shù)量。a 表示與0 Gy 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.36、6.66，均P<0.05）；b 表示與0 Gy 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.14、5.67，均P<0.05）。MLE-12 為一種小鼠肺上皮細胞；NC MLE-12 為對照組MLE-12 細胞；exo/NC-MLE 為NC MLE-12 分泌的外泌體；CD63 為溶酶體相關(guān)膜蛋白3；CD81 為四次跨膜蛋白28；TSG101 為腫瘤易感基因101 蛋白；Calnexin 為Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Figure 1 Exosomes secreted by mouse lung epithelial MLE-12 cells before and after irradiated with γ ray

2.2 exo/IR-MLE 激活初始T 細胞

FCM 結(jié)果顯示，初始T 細胞的純度和活力均>95%（圖2A、2B），符合實驗需求。與exo/NC-MLE相比，exo/IR-MLE 導(dǎo)致CD3+、CD4+和CD8+T 細胞數(shù)量增加（t=3.08～5.88，均P<0.05，圖3A）。此外，在這些exo/IR-MLE 誘導(dǎo)的T 細胞及其亞群細胞中，CD28 和CD69 的表達水平均升高（t=3.02～8.65，均P<0.05，圖3B、3C）。結(jié)果表明，照射后的MLE-12 細胞分泌的外泌體可誘導(dǎo)初始T 細胞增殖活化。

圖2 免疫磁珠分選初始T 細胞的純度和活力 A 為流式細胞術(shù)檢測活細胞的百分比；B 為流式細胞術(shù)檢測整個細胞群的純度。SSC-A為側(cè)向角散射；APC-Cy7 為別藻藍蛋白Cy7復(fù)合物；FITC 為異硫氰酸熒光素；CD3+為T 細胞表面特異性標(biāo)志物Figure 2 Purity and vitality of naive T cells sorted by immunomagnetic beads

圖3 γ 射線照射的小鼠肺上皮MLE-12 細胞分泌的外泌體誘導(dǎo)T 細胞活化 A 為與exo/IR-MLE 和exo/NC-MLE 共培養(yǎng)后不同時間的CD3+T 細胞及其亞群CD4+和CD8+T 細胞數(shù)量的相對比；B 為與exo/IR-MLE 和exo/NC-MLE 共培養(yǎng)后不同時間的CD3+T 細胞及其亞群CD4+和CD8+T 細胞中CD28的平均熒光強度的相對比；C 為與exo/IR-MLE 和exo/NC-MLE共培養(yǎng)后不同時間的CD3+T 細胞及其亞群CD4+和CD8+T 細胞中CD69 的平均熒光強度的相對比。a 表示與exo/NC-MLE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.02～8.65，均P<0.05）；exo/NC-MLE 組的數(shù)值設(shè)定為1.0。MLE-12 為一種小鼠肺上皮細胞；exo/NC-MLE 為對照組MLE-12 細胞分泌的外泌體；exo/IR-MLE 為6 Gy γ 射線照射組MLE-12 細胞分泌的外泌體；CD28 為T 細胞特定表面糖蛋白；CD69 為早期活化抗原1；CD3+為T 細胞表面特異性標(biāo)志物；CD4+為T 細胞中的一個亞群；CD8+為T 細胞中的一個亞群；MFI 為平均熒光強度Figure 3 Activation of T cells by exosomes secreted by mouse lung epithelial MLE-12 cells irradiated with γ ray

2.3 抗原呈遞相關(guān)分子在exo/IR-MLE 中的表達

FCM 結(jié)果顯示，與exo/NC-MLE 相比，MHCⅠ、MHC Ⅱ、CD80 和CD86 在exo/IR-MLE 中的表達水平均升高（t=4.04～6.47，均P<0.05，圖4A）；WB 結(jié)果顯示，與exo/NC-MLE 相比，MHC Ⅰ和MHC Ⅱ在exo/IR-MLE 中的表達水平均升高（圖4B）。因此，受照射細胞的外泌體具有通過抗原呈遞直接激活T 細胞的能力。

圖4 抗原呈遞相關(guān)分子在γ 射線照射前后小鼠肺上皮MLE-12細胞分泌的外泌體中的表達 A 為exo/IR-MLE 和exo/NC-MLE中抗原呈遞相關(guān)分子MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80 和CD86 的平均熒光強度的相對比，a 表示與exo/NC-MLE 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.04～6.47，均P<0.05），exo/NC-MLE組的數(shù)值設(shè)定為1.0；B 為蛋白免疫印跡法檢測exo/NC-MLE和exo/IR-MLE 中特征性分子CD63、CD81、TSG101 和抗原呈遞相關(guān)分子MHC Ⅰ、MHC Ⅱ的表達。MFI 為平均熒光強度；MLE-12 為一種小鼠肺上皮細胞；exo/IR-MLE 為6 Gy γ 射線照射組的MLE-12 細胞分泌的外泌體；exo/NC-MLE 為對照組MLE-12細胞分泌的外泌體；MHC Ⅰ為Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體；MHC Ⅱ為Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體；CD80 為免疫調(diào)節(jié)蛋白B7-1；CD86 為免疫調(diào)節(jié)蛋白B7-2；TSG101 為腫瘤易感基因101 蛋白；CD81為四次跨膜蛋白28；CD63 為溶酶體相關(guān)膜蛋白3Figure 4 Expression of antigen presentation related molecules in exosomes secreted by mouse lung epithelial MLE-12 cells before and after irradiated with γ ray

2.4 外泌體抑制劑GW4869 抑制照射后MLE-12細胞誘導(dǎo)的T 細胞活化

外泌體抑制劑GW4869 抑制MLE-12 細胞分泌外泌體的能力后，結(jié)果顯示，IR MLE-12 引起的CD3+、CD4+和CD8+T 細胞的數(shù)量增加以及CD28和CD69 的表達增加（t=1.51～15.66，均P<0.05，圖5）的現(xiàn)象均被明顯抑制（t=3.64～23.03，均P<0.05），幾乎與NC MLE-12 細胞處理后的T 細胞水平相同。上述研究結(jié)果顯示，照射后的MLE-12 細胞通過外泌體的抗原呈遞激活T 細胞。

圖5 外泌體抑制劑GW4869 抑制γ 射線照射后的小鼠肺上皮MLE-12 細胞誘導(dǎo)的T 細胞活化 A 為NC MLE-12 組、IR MLE-12 組和IR MLE-12+GW4869 組中的CD3+ T 細胞及其亞群CD4+和CD8+ T 細胞數(shù)量的相對比；B 為NC MLE-12組、IR MLE-12 組和IR MLE-12+GW4869 組中CD3+ T 細胞及其亞群CD4+和CD8+ T 細胞中CD28 的平均熒光強度的相對比；C 為NC MLE-12 組、IR MLE-12 組和IR MLE-12+GW4869 組中CD3+ T 細胞及其亞群CD4+和CD8+ T 細胞中CD69 的平均熒光強度的相對比。a 表示與NC MLE-12 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.51～15.66，均P<0.05）；b 表示與IR MLE-12 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.64～23.03，均P<0.05）；NC MLE-12 組的數(shù)值設(shè)定為1.0。MLE-12 為一種小鼠肺上皮細胞；IR MLE-12 為6 Gy γ 射線照射組的MLE-12 細胞；NC MLE-12 為對照組MLE-12 細胞；MFI 為平均熒光強度；CD28 為T 細胞特定表面糖蛋白；CD3+為T 細胞表面特異性標(biāo)志物；CD4+為T 細胞中的一個亞群；CD8+為T 細胞中的一個亞群；CD69 為早期活化抗原1Figure 5 T cell activation by mouse lung epithelial cells(MLE-12) irradiated with γ ray is suppressed by exosome inhibitor GW4869

3 討論

本研究結(jié)果顯示，照射后的MLE-12 細胞分泌的外泌體可以誘導(dǎo)T 細胞增殖活化，且T 細胞表面CD28 和CD69 的表達水平均升高。由于CD28在T 細胞活化期間接收第2 信號參與抗原呈遞[10]，因此我們推測該活化T 細胞的過程可能與抗原呈遞有關(guān)。早期激活指標(biāo)CD69 的表達水平在12 h時升高，但在24 h 時降低。Reddy 等[11]的研究結(jié)果顯示，T 細胞活化后，CD69 的表達水平首先隨著時間的延長而升高，然后出現(xiàn)了顯著降低的現(xiàn)象，原因是CD69 的信號隨著細胞增殖而被稀釋[12]，與本研究結(jié)果一致，即T 細胞在12 h 時被激活。上述研究結(jié)果表明，照射后的肺上皮細胞可以直接影響T 細胞的活化，這與Berg 等[13]報道的研究結(jié)果一致，其證實了RILI 患者肺組織中存在T 細胞活化的現(xiàn)象，即機體受到輻射后產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)會引起免疫反應(yīng)[14]。因此T 細胞活化參與RILI 的進程，這可能是減緩RILI 進展的關(guān)鍵潛在治療靶標(biāo)。

在共培養(yǎng)實驗中，exo/IR-MLE 激活T 細胞并使其增殖。給予外泌體抑制劑GW4869 后，T 細胞活化現(xiàn)象受到抑制。同時，我們檢測了一些抗原呈遞相關(guān)分子在外泌體中的變化。與exo/NC-MLE相比，exo/IR-MLE 中抗原呈遞相關(guān)分子MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80 和CD86 表達水平均升高。結(jié)果顯示，照射后的MLE-12 細胞可以通過其分泌的外泌體激活T 細胞，該激活過程可由抗原呈遞介導(dǎo)。這一結(jié)果與Kulshreshtha 等[15]的研究結(jié)果相似，他們證明了氣道上皮細胞分泌的外泌體可以驅(qū)動單核細胞增殖，并增強其趨化性。Admyre等[16]的研究結(jié)果顯示，人類肺泡灌洗液中的外泌體上存在共刺激分子，表明其具有直接調(diào)節(jié)T 細胞活化的能力。上述研究結(jié)果為研究T 細胞參與RILI 的機制提供了新的視角。

此外，我們發(fā)現(xiàn)部分外泌體標(biāo)志物如TSG101和CD81 在exo/IR-MLE 中的表達水平升高，而CD63 的表達水平?jīng)]有明顯的變化，這表明外泌體中蛋白質(zhì)的差異性變化包含更多信息。有研究結(jié)果顯示，微小RNA 可以參與T 細胞功能的調(diào)節(jié)[17-18]。作為含有豐富核酸和蛋白質(zhì)的小囊泡，外泌體具有相同的潛力。因此，未來我們會進一步研究受照射后肺上皮細胞分泌的外泌體中蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)的差異變化，這可能為該領(lǐng)域的研究提供新的見解。

綜上，我們提出了RILI 中存在新抗原的可能性的設(shè)想。我們假設(shè)照射后的肺上皮細胞分泌的外泌體可以激活T 細胞，進而破壞正常肺上皮細胞并加重輻射誘導(dǎo)的不良影響。外泌體可作為一種抗原呈遞亞細胞，攜帶來源細胞經(jīng)照射后暴露的內(nèi)部抗原，即機體以前從未識別過的新抗原，并通過其本身攜帶的、與參與抗原呈遞相關(guān)的共刺激分子，如MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80、CD86 等，依賴自身遠程遞送信息的特性，將抗原傳遞給初始T 細胞。而T 細胞通過自身表面的T 細胞抗原受體和CD28 識別抗原信號后發(fā)生活化并出現(xiàn)抗原依賴的增殖現(xiàn)象。

本研究的優(yōu)勢在于證明了外泌體作為抗原呈遞亞細胞的作用，揭示了T 細胞抗原依賴性活化參與RILI 的可能，為今后關(guān)于RILI 的臨床研究和治療提供了新的思路和實驗證據(jù)，但仍存在局限性。簡單的細胞共培養(yǎng)實驗不足以完全模擬機體內(nèi)部環(huán)境；關(guān)于抗原呈遞的所有結(jié)論都來自間接而非直接的證據(jù)。我們今后的研究方向?qū)⒅赜赗ILI 過程中特異性活化T 細胞的篩選以及新抗原的鑒定等，同時開展外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析和測序研究，以期為RILI 的研究提供新的實驗證據(jù)，為今后治療RILI 提供新的實驗依據(jù)。

綜上所述，照射后的MLE-12 細胞通過外泌體激活T 細胞，這種激活可被外泌體抑制劑所抑制。同時，MLE-12 細胞經(jīng)照射后分泌的外泌體中抗原呈遞相關(guān)分子高表達，這表明激活機制可能是抗原呈遞。本研究為RILI 的產(chǎn)生和發(fā)展提供了新證據(jù)，并為未來的臨床研究提供了新的視角。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明王志鑫負責(zé)實驗實施、論文的撰寫；王美玉、郭浩鑫負責(zé)取材、文獻的調(diào)研與整理；杜麗負責(zé)研究方案可行性的調(diào)查分析；王易龍負責(zé)實驗的設(shè)計、論文的修訂與審核；楊陟華負責(zé)研究思路與方案的設(shè)計；朱茂祥負責(zé)研究命題的提出、論文的修訂與終審