蘇妙貞，丁清龍，曾曉琮，蘇章庭

（廣東省食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510435）

椰毒假單胞菌酵米面亞種是中國(guó)科學(xué)家在東北酵米面中分離出的一種致病菌，與唐菖蒲伯克霍爾德菌親緣關(guān)系最近，故歸入唐菖蒲伯克霍爾德氏菌[1]。在適宜的溫度下，椰毒假單胞菌酵米面亞種污染食品后產(chǎn)生大量米酵菌酸，米酵菌酸是該菌引起食物中毒的主要原因。2018 年，廣東省東莞市出現(xiàn)第一例因食用河粉米酵菌酸中毒，最終致死的事件。2020 年，廣東省揭陽(yáng)市惠來(lái)縣再次發(fā)生河粉米酵菌酸中毒事件；黑龍江省發(fā)生了食用酸湯子米酵菌酸中毒的慘劇[2]。近年來(lái)，濕米粉被椰毒假單胞菌酵米面亞種污染多次引起米酵菌酸中毒事件，研究濕米粉中該菌的滅活條件變得迫切。

在濕米粉生產(chǎn)過(guò)程中，企業(yè)常用的殺菌手段有加熱殺菌、紫外輻照殺菌，其中加熱殺菌用于濕粉蒸煮工藝，紫外輻照殺菌用于車間環(huán)境日常清潔消毒。蛋白質(zhì)是微生物的重要組成成分，蛋白質(zhì)變性或凝固可使微生物失去活性而死亡，加熱能使蛋白質(zhì)變性。在60 ℃下，蛋白質(zhì)開始變性，細(xì)菌一般在65 ～80 ℃就能被殺死，但一些芽孢菌在環(huán)境惡劣時(shí)能產(chǎn)生芽孢，100 ℃以上的高溫才能使芽孢失活[3]。椰毒假單胞菌酵米面亞種不產(chǎn)生芽孢，從結(jié)構(gòu)上看，該菌不耐高溫。因食品基質(zhì)不宜使用化學(xué)滅菌方法，紫外線輻照殺菌是食品企業(yè)常用的消毒手段，特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外線照射可破壞微生物細(xì)胞中的核酸，導(dǎo)致微生物的死亡，以達(dá)到消毒殺菌的目的[4]。紫外劑量是影響殺菌效果的直接因素，與照射所用的紫外線燈強(qiáng)度成正比，與物體被照射的時(shí)間成正比[5]。本文從加熱滅菌和紫外滅菌兩方面，研究殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種的物理?xiàng)l件。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，椰毒假單胞菌酵米面亞種能在液面產(chǎn)生菌膜，菌膜容易覆蓋在設(shè)備表面上生長(zhǎng)，比菌體更具抗性，因此加熱滅菌實(shí)驗(yàn)分別針對(duì)菌體與菌膜進(jìn)行[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株分離自碎米，經(jīng)VITEK 2 鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌，經(jīng)產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)提取到米酵菌酸的產(chǎn)毒株。GVC 增菌液、馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Water，PD 水）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA），均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋；SX-700 高壓滅菌鍋；LRH-250 生化培養(yǎng)箱；AC2-4S1 生物安全柜；紫外燈管（229.1 μW·cm-2、154.1 μW·cm-2、80.0 μW·cm-2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 加熱滅活實(shí)驗(yàn)

（1）椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體加熱滅活實(shí)驗(yàn)。取培養(yǎng)3 d 后的椰毒假單胞菌酵米面亞種PDA 平板上菌苔，用生理鹽水配制濃度為108CFU·mL-1的菌懸液，按比例稀釋為105CFU·mL-1和102CFU·mL-1的菌懸液，3 種菌懸液各配制60 mL，用低、中、高濃度菌液分別代表102CFU·mL-1、105CFU·mL-1、108CFU·mL-1的菌液。準(zhǔn)備已滅菌的1.5 mL 離心管，放入1 mL 菌液，封好后置于調(diào)好溫度的水浴鍋中處理一定時(shí)間。處理完后取出冷卻，將菌液倒入平板中，倒入PDA 瓊脂混勻，于36 ℃培養(yǎng)48 h。相同步驟設(shè)立空白對(duì)照，空白對(duì)照無(wú)需于水浴鍋中加熱處理，實(shí)驗(yàn)組做2 份平行樣。處理溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，處理時(shí)間為10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、180 s 和300 s，記錄平板生長(zhǎng)情況。

（2）菌膜加熱滅活實(shí)驗(yàn)。椰毒假單胞菌酵米面亞種在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生菌膜，菌膜易在輸送米漿的管道內(nèi)附著滋生。當(dāng)管道內(nèi)滋生菌膜后，米漿流過(guò)可能會(huì)攜帶椰毒假單胞菌酵米面亞種的菌膜，本實(shí)驗(yàn)研究加熱能否將菌膜中的椰毒假單胞菌酵米面亞種殺死。挑取一環(huán)椰毒假單胞菌酵米面亞種接種至10 mL 無(wú)菌馬鈴薯葡萄糖水（PD 水）試管中，30 ℃培養(yǎng)6 d 后形成菌膜。用接種針小心挑取菌膜放置于無(wú)菌濾膜中央，以經(jīng)燒灼滅菌后的不銹鋼片為承托，放入鍋中。用沸騰狀態(tài)的常壓水蒸氣分別蒸煮處理0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min 和3.0 min 后，將濾膜貼于平板計(jì)數(shù)瓊脂表面于36 ℃培養(yǎng)，取未經(jīng)加熱處理的菌膜濾膜貼于平板計(jì)數(shù)瓊脂表面培養(yǎng)作為未處理空白參照。

1.3.2 紫外殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種實(shí)驗(yàn)

紫外線消毒殺菌法是食品企業(yè)常用的消毒方式，本實(shí)驗(yàn)探究紫外線強(qiáng)度、照射時(shí)間對(duì)椰毒假單胞菌酵米面亞種殺滅效果的影響。以108CFU·mL-1的菌液配制107CFU·mL-1、105CFU·mL-1、103CFU·mL-1椰酵假單胞菌酵米面亞種菌液，涂布于PDA 平板后，將PDA 平板分別置于229.1 μW·cm-2（模擬高強(qiáng)度紫外線燈）、154.1 μW·cm-2（模擬中強(qiáng)度紫外線燈）、80.0 μW·cm-2（模擬普通30 W 紫外線燈）紫外線燈管下作用2 min、5 min、10 min、15 min 和30 min，作用結(jié)束后放置于36 ℃培養(yǎng)48 h，觀看菌落生長(zhǎng)結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做兩個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體加熱滅活結(jié)果分析

平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)即為殺滅率達(dá)到100%，統(tǒng)計(jì)3 種濃度菌液經(jīng)加熱處理后達(dá)到100%殺滅率的溫度與處理時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1。菌液濃度越高，殺滅全部細(xì)菌所需的時(shí)間越長(zhǎng)。隨著處理溫度的升高，殺滅全部細(xì)菌所需的時(shí)間大幅縮短?！稘衩追凵a(chǎn)和經(jīng)營(yíng)衛(wèi)生規(guī)范》（DBS44/ 017—2021）要求蒸煮定型時(shí)長(zhǎng)需保持1 min 以上，企業(yè)的蒸煮隧道濕粉從頭到尾蒸煮約1.5 min，使用100 ℃處理1.5 min 的加熱方法能有效殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體。

圖1 殺滅率為100%時(shí)，不同濃度菌液所需處理溫度與時(shí)間

2.1.2 菌膜加熱滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2 可知，未經(jīng)熱處理的菌膜表面濕潤(rùn)，擴(kuò)散生長(zhǎng)；經(jīng)熱處理過(guò)的菌膜表面干燥，無(wú)繼續(xù)生長(zhǎng)跡象，表明菌膜已失去活性，這說(shuō)明菌膜的耐熱性不強(qiáng)，經(jīng)常壓下水蒸氣處理0.5 min 即可殺滅。

圖2 菌膜加熱滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 紫外殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由 圖3 可 知，在229.1 μW·cm-2紫 外 線 作 用下，15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，30 min 可殺滅105CFU·mL-1、107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種。

圖3 高強(qiáng)度紫外線下殺菌效果

由圖4 可知，在154.3 μW·cm-2紫外線作用下，15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，30 min 可部分殺滅105CFU·mL-1及107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種。

圖4 中強(qiáng)度紫外線下殺菌效果

由 圖5 可 知，在80.3 μW·cm-2紫 外 線 作 用下，作用30 min 未能殺滅107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，作用30 min 可殺滅部分105CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，作用15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，但作用30 min 發(fā)現(xiàn)103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種存在部分生長(zhǎng)，可能因擺放不當(dāng)導(dǎo)致殺滅效果有偏差。

圖5 低強(qiáng)度紫外線下殺菌效果

3 結(jié)論與討論

濕米粉的生產(chǎn)過(guò)程為大米浸泡、自來(lái)水清洗、磨漿、調(diào)節(jié)波美度、加熱熟化、定型、鼓風(fēng)冷卻、切刀切割和稱重包裝[7]，加熱熟化為生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。研究表明，椰毒假單胞菌酵米面亞種主要來(lái)源于生產(chǎn)原料中的米，在加工過(guò)程中能污染到米漿和輸送管路[8]。熟化步驟為產(chǎn)品從生到熟的加工步驟，該過(guò)程通過(guò)加熱殺死椰毒假單胞菌酵米面亞種。本次實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)廣東省衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 濕米粉生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)衛(wèi)生規(guī)范》（DBS 44/017—2021）中8.2“應(yīng)制定蒸煮定型間（區(qū)）崗位操作規(guī)程，對(duì)蒸煮定型設(shè)備的壓力或溫度等關(guān)鍵條件進(jìn)行監(jiān)控，確保加熱溫度≥100 ℃、加熱時(shí)間保持1 min 以上，或采用其他等效殺菌效果的熱加工工藝，并做好記錄”的要求[9]，生產(chǎn)企業(yè)可以用加熱方式殺死米漿中存在的菌或菌膜。濕米粉生產(chǎn)企業(yè)一般使用紫外燈進(jìn)行表面消毒，實(shí)驗(yàn)表明紫外線能殺死一定濃度的菌，但受照射距離、照射物品厚度的影響，消毒效率有一定損失。因此，企業(yè)應(yīng)以加熱殺菌為主，紫外照射為輔的手段殺滅濕米粉中的椰毒假單胞菌酵米面亞種。