孫林慧，禚惠榮，師文君，王康琪，張東立，侯少陽

（1.菏澤學院藥學院，山東菏澤 274015；2.山東大樹達孚特膳食品有限公司，山東菏澤 274015）

2002 年，歐洲食品和飼料菌種協(xié)會指出，益生菌能對宿主機體產(chǎn)生功能性健康益處[1]。作為人類腸道微生物群落的一個組成部分，益生菌有助于維持健康的腸道菌群環(huán)境，調(diào)節(jié)微生物的代謝活動[2]。副干酪乳桿菌是益生菌的一種，具有較高的環(huán)境耐受能力，能在宿主腸道內(nèi)分泌胞外多糖，發(fā)揮降血糖作用；能促進腸道菌群降膽固醇；能將糖苷型黃酮轉化為易被機體吸收的苷元型黃酮，發(fā)揮輔助降血糖的作用；能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，抑制病原菌生長[3-8]。副干酪乳桿菌是一種潛在的功能性益生菌，極具應用前景。目前，副干酪乳桿菌已在食品、藥品、調(diào)味品和飼料等產(chǎn)品中發(fā)揮作用，用16S rRNA 檢測副干酪乳桿菌存在耗時長、操作復雜、簡便性差[9-11]等特點。為改進傳統(tǒng)方法的劣勢，人們需要開發(fā)一種新型的檢測技術。

1990 年，SHARPLES 等[12]在 對Escherichia coli基因組中tsl 基因的3’末端區(qū)進行分析時，首次發(fā)現(xiàn)了腸桿菌基因間重復一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）片段并命名為“基因間重復單位”（Intergenic Repetitive Unit，IRU）序列。隨后Hulton 等[13]也鑒定出相同的重復序列并命名為ERIC，即腸桿菌基因間保守重復序列[14]。副干酪乳桿菌是國內(nèi)外研究熱度較高的一種益生菌，屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌群，具有ERIC序列。腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈反應技術（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）是利用ERIC序列中的高度保守區(qū)設計的一對反向引物進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增，對微生物菌株的鑒定、分析等研究有較高的參考價值[15]。該技術用于微生物學研究，分析速度快，可供參考的信息量大，克服了純培養(yǎng)的局限，在環(huán)境監(jiān)測治理、腸道菌群生態(tài)結構研究等方面具有廣泛的應用價值[16]。運用ERIC-PCR 技術能大大縮短副干酪乳桿菌的鑒別時間，為副干酪乳桿菌的研究提供一種新的檢測思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2K plus Ⅱ DNA Marker、6×DNA Loading Buあer、T 載體（T5 Zero Cloning Kit），北京全式金生物技術有限公司；引物，蘇州金唯智生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素，北京索萊寶科技有限公司；Tris、SDS，德 國Sigma 公 司；溴 化 乙 錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙瓊脂糖；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-75G 全自動數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-ZFD 雙人單面垂直凈化工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；Eppendorf Research plus 手動移液槍，德國艾本股份公司；TS100 恒溫混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠；ZF-20D 型暗箱三用紫外分析儀，驥輝分析儀器上海有限公司；H1650-W 型高速臺式離心機，長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA 的提取、純化

將從酸菜中分離到的副干酪乳桿菌HP-B1145接種至MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2 d，采用SDS-堿裂解法[17]提取副干酪乳桿菌HPB1145 的基因組，37 ℃烘25 min 后加入50 μL 1×TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設計

以副干酪乳桿菌HP-B1145 為研究對象，進行多次實驗，找到最佳ERIC-PCR 反應條件。以副干酪乳桿菌HP-B1145 基因組DNA 為模板，進行ERIC-PCR，回收、純化，得到基因組目的片段，連接T5 載體，送至蘇州金唯智公司測序。根據(jù)測序結果，采用Primer Premier 5 和Oligo 7 軟件進行引物探針設計。將副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC 序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫。

1.3.3 探究引物的特異性

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌作為引物探針特異性檢驗的對照，分別對上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145 采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR，并對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.4 探究引物的普適性

將副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508 和副干酪乳桿菌KPP3777 作為引物探針普適性檢驗的對照，以1145-S-F/1145-S-R 為引物，分別對上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145 進行PCR，并對PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.5 探究引物能夠檢測的含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145 混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145 含量分別為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、70%（絕對含量630 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合DNA 溶液，以此混合DNA 溶液為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR，并對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.6 探究引物能否檢驗市售產(chǎn)品中的副干酪乳桿菌

選取3 種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA，以此為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR，對PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，探究引物探針是否具有實用性。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 的測序及引物設計

依據(jù)多次實驗探索到的最佳反應條件，對副干酪乳桿菌HP-B1145 的基因組DNA 進行ERIC-PCR，得到多態(tài)性的ERIC 片段，膠回收、純化，得一條900 bp左右的DNA 條帶。通過測序得到DNA 序列，設計引物探針，該基因片段的序列已上傳GenBank 數(shù)據(jù)庫，接收序列號為OP681785。設計結果如下：1145-S-F：（5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’）；1145-S-R：（5’- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’）。引物由蘇州金唯智公司合成，用所設計的引物繼續(xù)實驗。由SnapGene 分析可知，所設計的引物可擴增副干酪乳桿菌HP-B1145 的片段長度為489 bp。

2.2 引物探針具有準確性

以HP-B1145 基因組DNA 為模板進行PCR（ 反 應 體 系：92 ～98 ℃預 變 性8 ～12 min，92 ～98 ℃變 性1 min，44 ～46℃退 火35 ～45 s，65 ～78 ℃延伸210 s，執(zhí)行30 ～34 個循環(huán)，16 ℃后延伸）并進行瓊脂糖凝膠驗證，由圖1 可知，引物探針能擴增基因組目的片段，表明引物探針具有準確性與簡便性。

圖1 引物探針PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 特異性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌的基因組DNA，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR。如電泳圖2 所示，在眾多菌株中，只有副干酪乳桿菌（1、2 號泳道）擴增出對應的基因組目的片段，能被準確檢出，其他菌株沒有擴增出相應的基因組目的片段，證明了引物探針的特異性。

圖2 引物探針特異性PCR 凝膠電泳圖

2.4 普適性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777 的基因組DNA，以1145-S-F/1145-S-R 為引物，進行PCR，對PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。實驗結果如圖3所示，引物探針能將副干酪乳桿菌的近緣菌株擴增出相應的基因組目的片段，能將副干酪乳桿菌HPB1145 及其近緣菌株檢測出來，證明了探針的普適性。

圖3 引物探針普適性PCR 凝膠電泳圖

2.5 含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145 混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145 含量分別為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、70%（絕對含量630 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、3%（絕對含量27 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合DNA 溶液，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR，對PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果如圖4 所示，副干酪乳桿菌絕對含量為27 ng·mL-1時，運用該引物探針可檢測出，證明該引物探針能在微量DNA 存在時檢出副干酪乳桿菌，具有特異性強、靈敏性高的特點。

圖4 引物探針濃度限度凝膠驗證圖

2.6 市售產(chǎn)品驗證引物的實用性

選取3 種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA 為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進行PCR 反應，PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。如圖5 所示，以選取的3 種產(chǎn)品為模板進行PCR 均能擴增出相應的目的片段。

圖5 引物探針檢驗市售產(chǎn)品瓊脂糖凝膠電泳圖

3 結論

基于ERIC-PCR 技術獲得副干酪乳桿菌HP-B1145特異性序列，序列信息已上傳GenBank 數(shù) 據(jù) 庫，接收序列號為OP681785。設計了一對引物探針， 即1145-S-F：（5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’）和1145-S-R：（5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’），比對數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該序列在副干酪乳桿菌中具有較高保守性，能通過簡單PCR 快速、準確、特異性地從復雜樣品中檢出副干酪乳桿菌，解決了現(xiàn)有檢測方法操作復雜、誤差大、耗時長的問題，該引物的設計為食品、制藥、生物技術等領域提供了一種新的檢測方法。16S rRNA 序列測定結合生理生化實驗鑒別副干酪乳桿菌需3 d 才能獲知檢測結果，但是運用該研究設計的引物探針對復雜樣品進行普通PCR 擴增，僅在4 h 內(nèi)即可完成對未知菌株中副干酪乳桿菌的鑒定，操作過程簡單，重復性好，可最大程度減小操作過程的誤差，具有較高的應用價值。