羅儀山 郭志琴 劉 真 李韶南 陳平安

1.廣州市第一人民醫(yī)院急診科，廣東廣州 510180；2.廣州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州 510180；3.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州 511400

心力衰竭（簡(jiǎn)稱“心衰”）是一種發(fā)病率和病死率很高的臨床綜合征，交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）及腎素- 血管緊張素- 醛固 酮 系 統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS）的過度激活在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。雖然β 受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）和 血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin Ⅱ type1receptor blocker，ARB）等藥物能抑制SNS、RAAS 改善心衰預(yù)后，心衰患者的五年生存率也只有50%。因此，探尋一些新的心衰的治療方法一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

腎交感神經(jīng)消融（renal denervation，RDN）通過消融腎動(dòng)脈外膜的交感神經(jīng)，進(jìn)而降低全身交感神經(jīng)活性，起到改善心功能的作用[1]。本課題組的前期研究也顯示，它是一種安全有效的治療心衰方法[2]。但有研究顯示RDN 后腎交感神經(jīng)會(huì)再生，從而影響RDN 的療效[3]，具體機(jī)制尚不明確。線粒體是心肌細(xì)胞的“動(dòng)力源”，心衰與線粒體功能障礙密切相關(guān)[4]，而交感神經(jīng)活性與線粒體功能有關(guān)[5]，推測(cè)RDN 可以通過改善心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能從而對(duì)心衰有益。本研究通過檢測(cè)心肌細(xì)胞三磷酸腺苷（adenosine triphophate， ATP）濃度以及線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶Tom-20 表達(dá)量來探究RDN 及抑制RDN 后腎交感神經(jīng)再生對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。

1 資料與方法

1.1 心衰大鼠模型的制備

選取7 周齡健康SD 大鼠，雌雄不限（雄性160 ～220 g，雌 性100 ～150 g，廣 東 省 醫(yī) 學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），用腹主動(dòng)脈縮窄法（transverse aortic constriction，TAC）制備大鼠慢性心衰模型[6]。大鼠術(shù)前禁食24 h，飲水不限，10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉成功后將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，腹部備皮，常規(guī)消毒鋪巾后沿腹中線開腹，游離出部分腹主動(dòng)脈后使用4-0 縫線將6#針頭（外徑約0.64 mm）與腹主動(dòng)脈一起在腎動(dòng)脈上方結(jié)扎，迅速拔出針頭。將腸管恢復(fù)原位，腹腔給0.5 ml 頭孢唑肟（遼寧美亞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090513，規(guī)格：10 mg/ml），逐層縫合腹壁肌肉及皮膚。大鼠蘇醒后放回籠中，自由飲食。實(shí)驗(yàn)操作遵守廣州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定（倫理號(hào)：2017-203）。

1.2 RDN方法

對(duì)TAC 術(shù)后18 周大鼠行RDN，術(shù)前禁食24 h，飲水不限，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉成功后將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，腹部備皮，常規(guī)消毒鋪巾后沿腹中線開腹，輕柔撥開腸管，分離出左側(cè)腎動(dòng)脈，并用2-0 縫線于其下穿過，用濕潤(rùn)的棉球保護(hù)周圍組織，防止損傷。將溶于無水乙醇的10%苯酚溶液順著縫線滴落，作用于左腎動(dòng)脈周圍，消融10 min[7]。對(duì)右側(cè)腎動(dòng)脈進(jìn)行同樣的處理。兩側(cè)腎動(dòng)脈交感神經(jīng)消融完成后恢復(fù)腸管，腹腔給予0.5 ml 頭孢唑肟，逐層縫合腹壁肌肉層及皮膚。大鼠蘇醒后放回籠中，自由飲食。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

隨機(jī)選取TAC 后大鼠為心衰組（n=3，暴露雙側(cè)腎動(dòng)脈但不消融腎交感神經(jīng)），RDN 后大鼠又根據(jù)腹腔注射藥物的不同分為RDN 組（n=3，RDN 術(shù)后8 周腹腔注射生理鹽水），Nogo-B 組（n=4，RDN術(shù)后8 周腹腔注射神經(jīng)再生抑制劑Nogo-B[8]），NEP 組（n=3，RDN 術(shù)后8 周腹腔注射Nogo-B 拮抗劑NEP-40）。Nogo-B 組大鼠每天腹腔注射給藥0.02 mg Nogo-B（Alpha Diagnostic Intl Inc.，美國(guó)），持續(xù)2 周，NEP 組大鼠每天腹腔注射給藥0.025 mg NEP-40（ApexBio，美國(guó)，貨號(hào)：B5247），持續(xù)2 周。RDN 組每天給相應(yīng)體積生理鹽水，持續(xù)2 周。

1.4 組織取材

TAC 術(shù)后44 周（即給藥完成后16 周）處死大鼠，收集心臟及腎動(dòng)脈標(biāo)本并用4℃ PBS 液清洗。將心臟標(biāo)本裝于凍存管，于液氮中迅速冷凍，隨后保存于-80℃冰箱。將腎動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定然后石蠟包埋。

1.5 HE染色

將包埋有腎動(dòng)脈的蠟塊切成厚度5 μm 切片，脫蠟水化后行HE 染色，脫水透明后用中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察腎動(dòng)脈神經(jīng)變化，通過比較腎動(dòng)脈外膜神經(jīng)纖維數(shù)目評(píng)估RDN 術(shù)，神經(jīng)再生抑制劑Nogo-B 及其拮抗劑NEP-40 對(duì)腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)的影響。

1.6 ATP的測(cè)定

心肌細(xì)胞ATP 濃度根據(jù)增強(qiáng)型ATP 檢測(cè)試劑盒S0027（碧云天，中國(guó)上海）操作說明書用ELISA法測(cè)得。用ATP 裂解緩沖液裂解大鼠心肌細(xì)胞，4℃下12 000 g 離心5 min，取上清液測(cè)定ATP 濃度，根據(jù)ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.7 Western blot

從超低溫冰箱中取出大鼠心肌組織約100 mg，快速剪碎后加入1 ml 裂解液，充分研磨，然后將組織勻漿以12 000 g 在4℃低溫離心機(jī)中離心10 min，將上清液吸取至新的EP 管中，即為總蛋白溶液。測(cè)定蛋白濃度并配平各組目的蛋白上樣量。用SDS-PAGE 蛋白凝膠分離濃縮，切膠，轉(zhuǎn)膜，封閉后，用1 ∶2000 稀釋的Tom-20 抗體（Proteintech，美國(guó)）室溫孵育1.5 h，二抗孵育后顯色曝光。用BandScan 軟件半定量分析條帶，β-actin 作為內(nèi)參以校正目的蛋白的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

與心衰組比較，RDN 后大鼠腎動(dòng)脈外膜神經(jīng)纖維明顯減少。RDN 后各注藥組腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)纖維數(shù)目由多到少依次為：NEP 組、RDN 組、Nogo-B 組（圖1）。

圖1 HE 染色（100×）

2.2 生化檢查結(jié)果

與心衰組（0.877±0.412 nmol/g）比較，RDN 組[（4.325±1.855）nmol/g，t=3.143，P=0.035]、Nogo-B 組[（5.115±1.925）nmol/g，t=3.692，P=0，014]及NEP 組[（3.793±0.432）nmol/g，t=8.457，P=0.001]ATP 濃度均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。RDN、Nogo-B 及NEP 三組間ATP 濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.3 Western blot結(jié)果

與心衰組（0.148±0.053）比較，RDN 組（0.421±0.119，t=3.641，P=0.022）、Nogo-B 組（0.352±0.088，t=3.511，P=0.017）、NEP 組（0.401±0.123，t=3.262，P=0.031）心肌細(xì)胞Tom-20 表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。RDN、Nogo-B 及NEP 三組間Tom-20 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞Tom-20 表達(dá)量的Western blot檢測(cè)結(jié)果（以β-actin 作為內(nèi)參）

3 討論

RDN 主要通過降低交感神經(jīng)活性起到降低血壓、改善心功能的作用，有研究顯示其還可降低RAS活性[1]、影響一些小分子生物活性物質(zhì)的活性[9]，這些物質(zhì)與心功能有著密切關(guān)系，但心衰時(shí)RDN 對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響尚不明確。

線粒體是人體心肌細(xì)胞的主要產(chǎn)能部位，其功能異常與心衰密切相關(guān)[10]，ATP 是心肌細(xì)胞的主要供能物質(zhì)。心肌細(xì)胞ATP 的產(chǎn)生主要依賴于脂肪酸氧化驅(qū)動(dòng)的線粒體氧化磷酸化，少量依賴于葡萄糖氧化或糖酵解。在衰竭心臟中脂肪酸和葡萄糖氧化被抑制，而糖酵解不能為病變心臟提供足夠的能量[11]，因此衰竭心臟心肌細(xì)胞中ATP 含量下降。本研究結(jié)果顯示與未接受RDN 的心衰大鼠相比，RDN 組的大鼠心肌細(xì)胞ATP 含量明顯上升，這可能與RDN 降低心衰大鼠全身交感神經(jīng)興奮性，心臟ATP 消耗減少有關(guān)。目前臨床上常用的治療心衰藥物，如β 受體阻滯劑、ACEI、ARB 也可通過抑制交感神經(jīng)活性減少心臟能量消耗，從而改善預(yù)后。

Tom-20 是線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Tom-40 復(fù)合物的轉(zhuǎn)入受體，是線粒體蛋白運(yùn)輸系統(tǒng)的關(guān)鍵亞基，對(duì)線粒體蛋白導(dǎo)入的特異性起重要作用[4]。研究顯示缺血會(huì)降低線粒體Tom-20 表達(dá)量，而缺血預(yù)處理可以維持Tom-20 的含量并通過改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能來保護(hù)心臟[12]。此外，體外實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)Tom-20 可減少ROS 生成，恢復(fù)線粒體功能，防止細(xì)胞死亡[13]。而衰竭心臟的心肌細(xì)胞中Tom-20 表達(dá)量降低[14]，本研究顯示RDN 逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)，RDN組心肌細(xì)胞中Tom-20 表達(dá)量上調(diào)，顯示RDN 可通過線粒體蛋白運(yùn)輸機(jī)制參與心肌保護(hù)。本研究推測(cè)心肌細(xì)胞Tom 表達(dá)水平的上升會(huì)增加線粒體某些蛋白的運(yùn)輸，從而改善心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。

研究顯示RDN 后存在腎交感神經(jīng)再生現(xiàn)象[15]，Nogo-B 是外周神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制劑[8]，本研究采用對(duì)RDN 后的大鼠使用Nogo-B 的方法觀察Nogo-B是否能抑制腎動(dòng)脈交感神經(jīng)再生。腎動(dòng)脈的HE 染色結(jié)果顯示RDN 后各注藥組神經(jīng)纖維數(shù)目為NEP組＞RDN 組＞Nogo-B 組，表 明RDN 后Nogo-B 抑制腎動(dòng)脈神經(jīng)纖維再生，NEP 促進(jìn)腎動(dòng)脈神經(jīng)纖維再生。但生化檢查及Western blot 結(jié)果顯示各注藥組大鼠心肌細(xì)胞ATP 含量及Tom-20 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制RDN 后交感神經(jīng)再生對(duì)線粒體功能無明顯影響。這一結(jié)果出現(xiàn)的可能原因與樣本量偏少或觀察時(shí)間不夠長(zhǎng)有關(guān)，也有可能與RDN 后腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)纖維的再生只是解剖學(xué)再生，并非功能性再生有關(guān)[6]。

本研究顯示，RDN 可以改善心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能，抑制RDN 后腎交感神經(jīng)再生對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能無明顯影響。由于本研究樣本量偏少、觀察時(shí)間不夠長(zhǎng)，有關(guān)RDN對(duì)心衰后心肌細(xì)胞線粒體功能的具體影響及其機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。