劉玉玉,隋淼,蔣小飛,湯楠楠,王智明

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230000;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院,江蘇 徐州 221000)

代謝相關(guān)脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)是指在肝脂肪變性的基礎(chǔ)上,合并超重/肥胖、2型糖尿病、代謝功能障礙三項(xiàng)之一的代謝功能障礙相關(guān)的肝臟疾病[1],目前全球患病率高達(dá)25%,已成為最常見的慢性病之一。MAFLD可以隨著代謝失衡迅速進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化,甚至誘發(fā)肝細(xì)胞性肝癌。因此,研究MAFLD的發(fā)病機(jī)制并尋求有效治療藥物,已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

研究表明,脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗是MAFLD發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[2],肝臟脂肪沉積與胰島素抵抗之間存在較強(qiáng)的雙向關(guān)系。而PI3K/AKT信號(hào)通路被認(rèn)為是糖脂代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子,與肝臟胰島素抵抗密切相關(guān)[3]。丹梔調(diào)脂湯是南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院的院內(nèi)協(xié)定方,臨床已應(yīng)用多年。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6]丹梔調(diào)脂湯能有效降低肥胖型2型糖尿病患者的血糖,改善胰島素抵抗,減輕頸動(dòng)脈斑塊沉積,改善機(jī)體炎癥狀態(tài),但其具體機(jī)制并不明確。本研究擬通過(guò)觀察丹梔調(diào)脂湯對(duì)高脂誘導(dǎo)的MAFLD大鼠糖脂因子表達(dá)的影響,及對(duì)PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路的作用,為丹梔調(diào)脂湯治療MAFLD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

7周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010,動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室,單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度維持21～25 ℃,濕度維持50%～60%,采取12 h/12 h模式進(jìn)行晝夜明暗交替。高脂飼料購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,配方為83.5%基礎(chǔ)飼料、15%豬油及1.5%膽固醇。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào):202103A009。

1.2 藥物

丹梔調(diào)脂湯購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院,方由柴胡12 g,丹皮10 g,梔子10 g,黃芩10 g,黃連10 g,枸杞子10 g,荔枝核30 g,丹參30 g,蒺藜30 g,荷葉10 g,大黃10 g組成,采用傳統(tǒng)水煎法提取后濃縮,制成生藥含量為5 g·mL-1的丹梔調(diào)脂湯高劑量溶液,冷卻后儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆谩＝o藥前,分別稀釋為中劑量2.5 g·mL-1、低劑量1.25 g·mL-1。

1.3 試劑

TG(貨號(hào):A110-1-1)、HDL-C(貨號(hào):A112-1-1)、TC/TCH(貨號(hào):A111-1-1)、LDL-C(貨號(hào):A113-1-1)試劑盒購(gòu)自南京建成,大鼠Insulin(貨號(hào):SEKR-0033)、GPT/ALT(貨號(hào):BC1555)、GOT/AST(貨號(hào):BC1565)、FFA(貨號(hào):BC0595)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶,PI3K抗體(貨號(hào):ab191606)購(gòu)自Abcam,p-PI3K抗體(貨號(hào):17366)、FOXO1抗體(貨號(hào):2880)、Phospho-1抗體(貨號(hào):9461)、p-AKT抗體(貨號(hào):4060)、AKT抗體(貨號(hào):9272)、GAPDH抗體(貨號(hào):5174)、二抗Anti-rabbit IgG(H+L)(貨號(hào):14708)購(gòu)自CST。

1.4 儀器

I20-1型體重秤(武漢自動(dòng)化儀表廠);Accu-Chek Performa型血糖儀(德國(guó)Roche公司);Centrifuge 5427R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司);TY-80B/80S脫色搖床(江蘇普陽(yáng));RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);酶標(biāo)儀Mono422(美國(guó)Biotek公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);蛋白印跡-多功能成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及藥物干預(yù)

將30只SD雄性大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,稱體質(zhì)量,隨機(jī)分為2組:正常組6只,予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);MAFLD模型組24只,予高脂飼料喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)8周誘發(fā)MAFLD大鼠模型,血脂、血糖、胰島素等代謝指標(biāo)異常即判定為造模成功。

將24只成模的MAFLD模型大鼠隨機(jī)分為模型組及丹梔調(diào)脂湯高劑量、中劑量、低劑量組,每組6只。根據(jù)前期研究[4-6]以及丹梔調(diào)脂湯臨床等效劑量換算[7],丹梔調(diào)脂湯低、中、高劑量組分別予丹梔調(diào)脂湯5.1、10.2、20.4 g·kg-1·d-1,每日1次,正常組與模型組予等體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃8周后取材。末次給藥后禁食不禁水,12 h后,將大鼠麻醉,打開大鼠腹腔,腹主動(dòng)脈取全血標(biāo)本置于促凝管中,離心后將血清儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱保存,留取肝臟組織凍存于液氮中。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況 每日觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛、活動(dòng)、飲食及存活等情況,每周稱取大鼠體質(zhì)量。

2.2.2 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 肝臟用10%福爾馬林固定,組織冰凍切片,油紅O染色。封片后將切片放置顯微鏡下拍照。

2.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)大鼠血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血糖(GLU)、游離脂肪酸(FFA)、胰島素(INS)水平。采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島β細(xì)胞功能,HOMA-IR=空腹血清胰島素×空腹血糖/22.5。

2.2.4 Western blot檢測(cè)大鼠肝臟組織PI3K/AKT/FOXO1通路蛋白的表達(dá) 取約100 mg肝臟組織按全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書操作要求提取總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量后,加入上樣緩沖液,100 ℃水浴變性。將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后開始轉(zhuǎn)模,封閉,加入1∶1 000比例稀釋的一抗,4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗膜,按照1∶3 000稀釋二抗,室溫孵育1 h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各蛋白條帶。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 高脂飲食誘導(dǎo)8周后大鼠狀態(tài)、體質(zhì)量及代謝指標(biāo)的變化

正常組大鼠一般狀況良好,體質(zhì)量緩慢且均衡增加;模型組大鼠精神狀態(tài)較差,毛發(fā)光澤變?nèi)?體質(zhì)量增加明顯且快速。如圖1所示,高脂飼養(yǎng)后,大鼠的體質(zhì)量、GLU、INS及TG水平與正常組相比明顯升高(P<0.01),HDL-C水平明顯降低(P<0.01)。

注:Control.正常組(n=6);HFD.模型組(n=24)。與Control組比較,圖1 高脂飲食誘導(dǎo)對(duì)大鼠體質(zhì)量及代謝指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of HFD induction on body mass and metabolic indicators in rats

3.2 丹梔調(diào)脂湯對(duì)MAFLD大鼠體質(zhì)量、GLU、INS水平及HOMA-IR的影響

給藥8周后,與正常組相比,模型組大鼠體質(zhì)量增加明顯,GLU、INS水平及HOMA-IR指數(shù)明顯升高(P<0.01,P<0.001);與模型組相比,丹梔調(diào)脂湯各劑量組體大鼠精神狀態(tài)較好,毛發(fā)有光澤,體質(zhì)量、GLU及INS水平均有不同程度的降低,并呈劑量依賴性(P<0.05,P<0.01,P<0.001);丹梔調(diào)脂湯中、高劑量組HOMA-IR指數(shù)明顯低于模型組(P<0.01),見圖2。

注:Control.正常組;HFD.模型組;L-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯低劑量組;M-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯中劑量組;H-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯高劑量組。與Control組比較,##P<0.01,###P<0.001;與HFD組比較,圖2 丹梔調(diào)脂湯對(duì)高脂大鼠體質(zhì)量、GLU、INS水平及HOMA-IR的影響Fig.2 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on body mass, blood sugar, insulin levels, and HOMA-IR in HFD rats

3.3 丹梔調(diào)脂湯對(duì)MAFLD大鼠肝功能、血脂及FFA水平的影響

如圖3所示,與正常組相比,模型組ALT、AST、TG、TC、LDL-C及FFA水平明顯升高(P<0.01);與模型組相比,丹梔調(diào)脂湯各劑量組TG、TC、LDL-C、ALT、AST及FFA水平明顯降低(P<0.05,P<0.01);與正常組相比,模型組HDL-C水平明顯降低(P<0.01),高劑量丹梔調(diào)脂湯能夠升高HDL-C水平(P<0.05)。

注:Control.正常組;HFD.模型組;L-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯低劑量組;M-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯中劑量組;H-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯高劑量組。與Control組比較,##P<0.01;與HFD組比較,

3.4 丹梔調(diào)脂湯對(duì)MAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響

正常組大鼠肝臟組織中細(xì)胞核呈藍(lán)色,未見明顯橘紅色脂滴,肝細(xì)胞間隙清晰,肝竇結(jié)構(gòu)正常;相較于正常組,模型組可觀察到彌漫性的紅染脂滴,肝細(xì)胞腫大且排列紊亂,空泡,相鄰細(xì)胞脂滴融合,脂質(zhì)沉積明顯增加,細(xì)胞核被擠向周邊;而各給藥組肝細(xì)胞脂滴、排列結(jié)構(gòu)較模型組均有不同程度的改善。見圖4。

注:Control.正常組;HFD.模型組;L-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯低劑量組;M-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯中劑量組;H-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯高劑量組圖4 丹梔調(diào)脂湯對(duì)高脂大鼠肝臟組織的病理學(xué)影響(油紅O,×100)Fig.4 Pathological effects of Danzhi Tiaozhi Decoction on liver tissue of HFD rats (Oil Red O, × 100)

3.5 丹梔調(diào)脂湯對(duì)MAFLD大鼠肝臟中TG、TC的影響

與正常組相比,模型組大鼠肝臟中TG、TC水平明顯升高(P<0.01);相較于模型組,丹梔調(diào)脂湯各劑量組大鼠肝臟中TG明顯降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05),但TC水平未見明顯下降,見圖5。

注:Control.正常組;HFD.模型組;L-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯低劑量組;M-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯中劑量組;H-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯高劑量組。與Control組比較,##P<0.01;與HFD組比較,圖5 丹梔調(diào)脂湯對(duì)高脂大鼠肝臟中TG、TC的影響Fig.5 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on TG and TC in the liver of HFD rats

3.6 丹梔調(diào)脂湯對(duì)MAFLD大鼠PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

與正常組比較,模型組肝臟組織PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,丹梔調(diào)脂湯各劑量組PI3K、FOXO1蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.01);丹梔調(diào)脂湯中、高劑量組AKT蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。見圖6。

注:Control.正常組;HFD.模型組;L-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯低劑量組;M-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯中劑量組;H-DZTZ.丹梔調(diào)脂湯高劑量組。與Control組比較,##P<0.01;與HFD組比較,圖6 丹梔調(diào)脂湯對(duì)高脂大鼠PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on the expression of PI3K/AKT/FOXO1 signaling pathway related proteins in HFD rats

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,久坐不動(dòng)、膳食營(yíng)養(yǎng)不均衡及機(jī)體糖脂代謝障礙等與MAFLD發(fā)生密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)并沒有與MAFLD相對(duì)應(yīng)的明確記載,既往學(xué)者根據(jù)其臨床表現(xiàn)多將其歸屬于“痰濁”“積聚”“肥氣”等范疇[8]。脾主運(yùn)化,恣食肥甘厚味則致運(yùn)化不及,釀生痰濁膏脂,土壅則木郁,影響肝之疏泄,膏脂積聚于肝,積久化熱生火,以致內(nèi)熱,表現(xiàn)為肝胃郁熱[8]。丹梔調(diào)脂湯以丹梔逍遙散為底方[4-6],以君藥丹皮清肝經(jīng)血分之熱,柴胡為臣疏肝理氣,舒展少陽(yáng)三焦氣機(jī),梔子清肝經(jīng)氣分之熱,與柴胡共用,呈清熱疏肝之功,輔以大黃、黃連、黃芩三黃滌三焦?jié)駸?佐以白蒺藜、枸杞子、荔枝核以疏肝解郁,使木氣調(diào)達(dá),荷葉為使。諸藥合用,恰中MAFLD肝胃郁熱之病機(jī),共奏疏肝理氣,清熱祛濕之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)也表明,梔子[9]中的梔子苷能明顯改善NASH大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá),降低血漿LPS水平。柴胡[10]中柴胡皂苷和柴胡多糖能夠保護(hù)肝細(xì)胞,降低NASH大鼠血脂、GLU和游離脂肪酸水平,改善糖脂代謝紊亂狀態(tài)。TanⅡA是丹參的提取物,它能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟低密度脂蛋白受體、肝臟SREBP-2以及相關(guān)膽固醇基因的表達(dá)來(lái)減輕高脂血癥大鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積[11]。荷葉生物堿能通過(guò)活化AMPK信號(hào)通路,減輕胰島素抵抗等[12]。

MAFLD是一種復(fù)雜的多因素疾病,涉及遺傳、代謝和環(huán)境等因素[13],與全身能量代謝功能紊亂密切相關(guān)。能量攝入和消耗之間的失衡導(dǎo)致脂肪在組織中堆積,當(dāng)累積超過(guò)了脂肪組織重塑的能力時(shí),一方面,導(dǎo)致FFA和促炎細(xì)胞因子的釋放增加,骨骼肌和脂肪組織中胰島素抵抗的加重,脂毒性增加,出現(xiàn)異位脂肪沉積,特別是肝臟中的脂肪積累;另一方面,多余的FFAs和葡萄糖可以轉(zhuǎn)化為肝臟脂肪從頭合成(DNL)的底物,進(jìn)一步增加FFAs的攝取,減少VLDL-TG的分泌,促進(jìn)肝臟脂肪堆積[14]。隨著脂肪在肝臟中的積累,肝細(xì)胞代謝紊亂,又可以導(dǎo)致脂肪輸出率增加,進(jìn)一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激。因此,改善肝臟組織中的胰島素抵抗及減少脂質(zhì)沉積是延緩MAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),丹梔調(diào)脂湯能夠有效地降低2型糖尿病患者血清INS、CRP、TNF-α、IL-6水平[4-5],改善脂肪肝患者的肝功能和血脂[6]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)高脂飼養(yǎng)的大鼠肝臟胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴,肝細(xì)胞存在腫脹,有散在的點(diǎn)狀壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn),提示存在肝臟脂肪變性,其體質(zhì)量、生化指標(biāo)也證實(shí)存在胰島素抵抗及高脂血癥。丹梔調(diào)脂湯可以明顯改善高脂誘導(dǎo)大鼠HOMA-IR,降低TG、TC、LDL-C及FFA水平,呈劑量依賴性。同時(shí),高劑量的丹梔調(diào)脂湯能夠有效地升高HDL-C。肝臟病理結(jié)果顯示,和模型組相比,丹梔調(diào)脂湯各劑量組肝細(xì)胞腫脹明顯減輕,胞漿內(nèi)脂滴明顯減少,說(shuō)明丹梔調(diào)脂湯能夠有效改善糖脂代謝,減輕肝臟脂肪沉積,延緩MAFLD的進(jìn)展。

PI3K/AKT通路在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用,被認(rèn)為是與糖異生和糖原合成相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3],在調(diào)控胰島β細(xì)胞的凋亡、增殖,調(diào)節(jié)胰島素敏感性,緩解胰島素抵抗等方面具有重要作用[15]。作為PI3K重要的調(diào)節(jié)亞基,PI3K p85可與RTK相互作用而激活PI3K,因此,本研究PI3K p85亞基為檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。激活后的PI3K通過(guò)影響磷酸化AKT來(lái)介導(dǎo)胰島素和多種生長(zhǎng)因子對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié),而AKT通過(guò)磷酸化下游底物參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝。一方面,PI3K/AKT通路激活可以抑制脂肪生成,延緩過(guò)多的脂質(zhì)沉積,從而緩解肝臟脂肪變性[16]。另一方面,激活的PI3K/AKT通路通過(guò)促進(jìn)FOXO1磷酸化,促成FOXO1核排斥,從而抑制肝葡萄糖異生[17]。FOXO1是位于PI3K/AKT通路下游的關(guān)鍵因子,在脂代謝、葡萄糖代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中起重要作用[18],其能夠通過(guò)增加自噬因子和糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂肪和葡萄糖代謝[19]。研究表明[17,20-21],p-FOXO1蛋白表達(dá)的增加可以增強(qiáng)組織中的胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。本實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠肝臟PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平明顯低于正常組,丹梔調(diào)脂湯可以明顯上調(diào)高脂抑制下的PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平,并呈劑量依賴性。

綜上所述,丹梔調(diào)脂湯可以通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路,進(jìn)一步調(diào)控FOXO1磷酸化,調(diào)節(jié)糖脂代謝,增加肝臟組織中胰島素敏感性,從而改善胰島素抵抗,減輕肝臟脂質(zhì)沉積,延緩MAFLD的發(fā)生發(fā)展。