李浩,吳勉華,馬艷霞,李文婷,李沐涵

(1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結(jié)合學院,江蘇 南京 210023)

肝纖維化是在肝臟長期損傷的過程中,多種致病因素導致的細胞因子分泌以及內(nèi)環(huán)境紊亂,引起肝臟過度修復而出現(xiàn)纖維瘢痕的一種病理組織學變化。細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)是形成肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ),其主要來源于肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)活化后的肌成纖維化細胞[1]。目前臨床治療肝纖維化尚停留在針對病因?qū)用?仍缺乏有效的抗纖維化藥物。因此,抑制HSCs的活化或誘導其死亡是阻止肝纖維化向肝硬化甚至肝癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵研究方向。

鐵死亡(Ferroptosis)是2018年正式定義的一種新型程序性細胞死亡方式,其特點是鐵依賴性的氧化還原失衡,導致細胞膜磷脂過氧化損傷[2]。研究表明,肝纖維化過程中的HSCs活化、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等與鐵死亡密切相關(guān)。鐵死亡或成為抑制肝纖維化,治療慢性肝病新的靶點[3]。中醫(yī)學認為,肝纖維化屬于“積聚”“脅痛”范疇,病機可歸納為“虛損生積”[4]。此外,亦有運用陰陽理論和“取象比類”法探究鐵死亡與肝纖維化的報道[5-6]。大量研究證明,中藥及其活性成分可以靶向肝纖維化過程中多種信號通路,是當前抗纖維化藥物的重要來源。目前,運用中藥調(diào)控鐵死亡治療疾病的研究大多集中在心腦血管疾病及腫瘤,對于干預(yù)鐵死亡治療肝纖維化的中藥及其活性成分缺乏歸納總結(jié)?，F(xiàn)就鐵死亡途徑調(diào)控肝纖維化的作用機制及中藥干預(yù)的研究現(xiàn)狀進行綜述,為深入研究中藥調(diào)控鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化作用,以及為找到可靠的抗纖維化藥物提供新的思路。

1 鐵死亡的發(fā)生機制

鐵死亡機制主要歸納為鐵代謝、GSH/GPX4抗氧化體系、脂質(zhì)過氧化。見圖1。

圖1 鐵死亡發(fā)生的主要機制Fig.1 The main mechanism of ferroptosis

1.1 鐵代謝

生理狀態(tài)下,Fe3+經(jīng)由轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Trf/TfR1)途徑進入細胞內(nèi),并被前列腺上皮跨膜蛋白3(STEAP3)還原成Fe2+。Fe2+由二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1(DMT1)轉(zhuǎn)運儲存在鐵蛋白(FT)和不穩(wěn)定鐵池(LIP)中[7]。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN)將多余的Fe2+運出細胞,整個過程在鐵反應(yīng)蛋白2(IREB2)及核轉(zhuǎn)錄E2相關(guān)因子2(Nrf2)的調(diào)控下維持平衡[8-9]。當鐵過載時,高濃度的Fe2+發(fā)生芬頓反應(yīng),產(chǎn)生ROS并激活脂氧合酶(LOXs)造成細胞膜氧化損傷[10]。在鐵攝取不足時,機體通過鐵自噬將FT降解,釋放游離鐵增加LIP,誘導鐵死亡的發(fā)生[11]。因此,鐵代謝紊亂在鐵死亡過程中扮演至關(guān)重要的角色。通過調(diào)控鐵代謝過程中的相關(guān)靶基因,或使用鐵螯合劑、鐵抑制劑等減少細胞內(nèi)游離鐵的濃度,可影響細胞對鐵死亡的敏感性進而調(diào)控鐵死亡[12]。

1.2 GSH/GPX4抗氧化體系

GSH/GPX4是針對脂質(zhì)過氧化物蓄積的抗氧化系統(tǒng),抑制GSH/GPX4系統(tǒng)會導致細胞膜過氧化損傷和鐵死亡。GPX4是唯一已知可以將脂質(zhì)過氧化物還原成醇的GPXs同工酶,并減少ROS的積累,抑制鐵死亡的發(fā)生。GSH是GPX4發(fā)揮抗氧化性必要的輔助因子,GSH缺乏將導致GPX4失活,其合成受到半胱氨酸的限速控制。敲除GPX4相關(guān)基因或使用GPX4抑制劑如RSL3將會誘導細胞鐵死亡,其與細胞內(nèi)GPX4失活導致的脂質(zhì)過氧化直接相關(guān)[13-14]。System Xc-是一種特異性氨基酸轉(zhuǎn)運體,由溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)和溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)構(gòu)成,通過對細胞內(nèi)外谷氨酸/胱氨酸的轉(zhuǎn)運影響GSH的合成,被認為是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵中樞。p53、Nrf2、erastin可直接或間接地抑制System Xc-的活性,誘導鐵死亡[12,15-16]。因此,System Xc-/GSH/GPX4是調(diào)控細胞鐵死亡的關(guān)鍵靶點,通過調(diào)控相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運及GPX4的活性可以實現(xiàn)對鐵死亡的誘導和抑制。

1.3 脂質(zhì)過氧化

鐵代謝紊亂及GPX4失活導致的脂質(zhì)過氧化是造成細胞膜損傷的核心事件,主要是由含有多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂膜過氧化引起的。PUFA極易在LOXs催化下生成脂質(zhì)過氧化物,是鐵死亡發(fā)生的核心脂質(zhì)。在?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)的催化下,PUFA進入細胞膜并在Fe2+的介導下被LOXs酶解生成脂質(zhì)過氧化物,此過程需要溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3(LPCAT3)的幫助。ACSL4和LPCAT3會加速PUFA過氧化,抑制GPX4的活性,導致脂質(zhì)過氧化物大量生成,導致鐵死亡[17]。

此外,輔酶Q10在鐵死亡抑制蛋白-1(FSP1)及NADPH的催化下抑制脂質(zhì)及ROS的產(chǎn)生,阻止了脂質(zhì)過氧化,在此過程中不需要GSH[18]。因此,通過對PUFA的調(diào)控及對脂質(zhì)過氧化物的醇轉(zhuǎn)化,可以調(diào)控鐵死亡在細胞中的發(fā)生。

2 鐵死亡在肝纖維化中的作用及干預(yù)策略

肝纖維化會伴有與鐵死亡相關(guān)的鐵代謝紊亂、細胞抗氧化系統(tǒng)失衡及脂質(zhì)過氧化等特征。因此,通過探究鐵死亡在肝纖維化過程中所扮演的角色,可明確調(diào)控細胞鐵死亡對肝纖維化促進和抑制的作用靶點,為肝纖維化以及其他慢性肝病的研究提供思路和治療策略。

2.1 HSCs活化與鐵死亡

HSCs活化是肝纖維化的核心事件,活化的HSCs分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維,是造成肝臟內(nèi)ECM堆積的主要驅(qū)動力?；罨腍SCs會出現(xiàn)鐵代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化物堆積,提示鐵死亡參與HSCs的活化。肝臟是機體儲存鐵和調(diào)節(jié)鐵代謝的重要器官,過量的鐵會引起肝細胞持續(xù)損傷,誘導肝細胞鐵死亡,進而分泌大量細胞因子如IL-13、TGF-β等誘導HSCs活化,促進肝纖維化[19]。

在高鐵飲食小鼠肝纖維化模型中,敲除肝臟Trf基因加重了肝細胞鐵超載,而進一步敲除SLC7A14可改善小鼠肝纖維化,這表明Trf通過抑制肝細胞鐵死亡發(fā)揮對肝臟的保護作用[20]。使用鐵死亡抑制劑可以減輕肝損傷、減少炎性因子的分泌進而抑制HSCs活化[21]。索拉菲尼可通過調(diào)控ZFP36/TTP和ELAVL1/HuR影響下游mRNA,進而使HSCs發(fā)生鐵自噬,誘導HSCs發(fā)生鐵死亡[22]。因此,通過減少肝細胞的鐵死亡或誘導活化HSCs鐵死亡是治療肝纖維化的有效治療策略。

2.2 肝臟炎癥反應(yīng)與鐵死亡

炎癥反應(yīng)是肝臟損傷后機體對肝組織進行修復、保護的病理反應(yīng),但長期持續(xù)的炎性浸潤和促炎因子的釋放會導致肝臟組織的壞死,HSCs活化與肝纖維化。IL-6、IL-13、TNF-α、TGF-β等炎性因子能夠誘導肝纖維化的發(fā)生,而IL-10、IL-22可以發(fā)揮抗炎的作用,抑制HSCs的活化,從而降低肝纖維化程度[19]。

在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中,高表達的Nrf2和HO-1通過介導鐵死亡減輕肝臟炎癥反應(yīng),抑制了肝臟α-SMA和mRNA的含量,發(fā)揮抗纖維化作用[23]。在NASH小鼠模型中,使用鐵死亡抑制劑可以減輕肝臟炎癥反應(yīng),進而抑制NASH和肝纖維化[24]。臨床實驗中,黃芩苷膠囊聯(lián)合異甘草酸鎂可以通過抑制肝細胞鐵死亡,減輕炎癥反應(yīng)、抑制肝纖維化[25]。上述研究表明,鐵死亡可以影響肝纖維化過程中的炎癥反應(yīng),抑制鐵死亡可以發(fā)揮抗炎作用從而影響肝纖維化。因此,抑制肝臟炎癥反應(yīng)是調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化的重要研究方向。

2.3 氧化應(yīng)激與鐵死亡

氧化應(yīng)激是由于機體抗氧化系統(tǒng)失衡造成過氧化物積累至毒性的過程,是引起肝損傷的重要病理過程。ROS是肝纖維化過程中造成肝臟損傷最主要的毒性物質(zhì),一方面通過自身的氧化毒性對肝細胞造成持續(xù)損傷,另一方面可以通過激活Nrf2、TGF-β等靶點參與HSCs活化,從而促進肝纖維化的進展[26]。在肝纖維化早期,ROS刺激肝臟微環(huán)境,促進HSCs活化及肝纖維化的形成;隨著肝纖維化的進展,活化的HSCs會表達NOX,引起肝臟持續(xù)的氧化應(yīng)激,進一步刺激HSCs活化。

維生素E、GSH/GPX4等抗氧化劑可以清除肝纖維化和鐵死亡過程中產(chǎn)生的ROS,ferrostatin-1可以抑制高鐵飲食下小鼠的鐵死亡,減少ROS,減輕肝臟氧化應(yīng)激及肝纖維化程度[27]。Keap1/Nrf2通路不僅可以調(diào)控鐵死亡的過氧化,還可以調(diào)控肝臟氧化應(yīng)激減輕肝纖維化程度,多與其調(diào)控鐵死亡及氧化應(yīng)激眾多靶基因有關(guān),如GSH/GPX4、HO-1、FSP1/NADPH、SLC7A11[28]。因此,調(diào)控鐵死亡減輕肝臟氧化應(yīng)激,是臨床研究抗肝纖維化藥物的一個方向。

3 中藥調(diào)控鐵死亡防治肝纖維化

在中醫(yī)理論的指導下,中藥調(diào)控鐵死亡在治療腫瘤、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變等領(lǐng)域取得顯著的進展[29-33]。近年來大多研究表明中藥及其活性成分通過誘導活化的HSCs鐵死亡以達到緩解和治療肝纖維化的目的,也有中藥復方通過調(diào)控鐵死亡減緩肝纖維化前期的肝臟損傷與肝細胞死亡,從而防治肝纖維化。總結(jié)近五年內(nèi)調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化的中藥單體及其活性成分相關(guān)研究如下(表1)。

表1 調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化的相關(guān)中藥及其有效成分Table 1 Related traditional Chinese medicine and its effective components for regulating ferroptosis in the treatment of liver fibrosis

3.1 青蒿

青蒿素衍生物可以抑制肝細胞鐵死亡或誘導活化的HSCs鐵死亡,以此抑制肝纖維化。在體外培養(yǎng)HSCs實驗中,雙氫青蒿素通過降低TfR1與TGF-β1的表達,使HSCs活化及CollagenⅠ的分泌被抑制,從而抑制鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化的作用[34]。在CCl4誘導大鼠肝纖維化模型及體外HSCs培養(yǎng)實驗中,青蒿琥酯可以降低CollagenⅠ、α-SMA和Fibronectin表達,增加p53 mRNA表達,促進HSCs鐵死亡,改善肝纖維化的病理損傷[35]。在CCl4誘導大鼠肝纖維化模型實驗中,蒿甲醚可以上調(diào)HSCs中SLC2A11和鐵離子水平,通過BRD7-P53-SLC7A11通路介導HSCs鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化的作用[36]。

雙氫青蒿素、青蒿琥酯與蒿甲醚對調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化有著不同的作用靶點與途徑:雙氫青蒿素靶向TfR1、TGF-β1,通過鐵代謝、LD代謝影響肝細胞和活化的HSCs鐵死亡;青蒿琥酯靶向p53和FT相關(guān)基因,通過p53與鐵蛋白自噬途徑,增加HSCs鐵超載,引起HSCs鐵死亡;蒿甲醚靶向SLC2A11、p53及IRP2,通過BRD7-P53-SLC7A11通路和IRP2-Iron-ROS軸,誘導HSCs鐵死亡[34-41]。

3.2 黃芩

黃芩素和黃芩苷作為新型HSCs鐵死亡調(diào)節(jié)劑,在治療肝纖維化方面具有巨大潛力。在CCl4誘導小鼠肝纖維化模型中,黃芩素干預(yù)下的小鼠有SLC7A11、p53水平上調(diào),GPX4和GSH消耗,電鏡下觀察到HSCs線粒體脊斷裂,這提示黃芩素通過SOCS11/P53/SLC7A11途徑誘導活化的HSCs鐵死亡,從而緩解肝纖維化[42]。在血小板衍生因子誘導HSCs培養(yǎng)中,黃芩苷增加了miR-3595的表達,降低了ACSL4的水平,這提示黃芩苷通過miR-3595/ACSL4軸抑制肝細胞鐵死亡從而抗肝纖維化[43]。

上述研究表明,黃芩及其活性成分可以靶向SLC7A11、ACSL4,從鐵代謝、脂質(zhì)過氧化方面調(diào)控鐵死亡,發(fā)揮抗纖維化作用。其中,黃芩素從鐵代謝途徑靶向SLC7A11引起HSCs鐵死亡,而黃芩苷從脂質(zhì)過氧化方面,靶向ACSL4減少脂質(zhì)過氧化,抑制肝細胞鐵死亡,從而減少HSCs的活化。

3.3 黃連

黃連活性成分小檗堿可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和ROS積累介導活化的HSCs鐵死亡來緩解肝纖維化。在硫代乙酰胺和CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中,小檗堿損害了自噬-溶酶體途徑(ALP)并增加了HSCs中ROS產(chǎn)生,加速了鐵蛋白的分解并加速了鐵釋放,從而導致HSCs鐵死亡,這提示小檗堿通過誘導鐵蛋白自噬,加速ROS介導的HSCs鐵死亡,從而治療肝纖維化[44]。在研究小檗堿治療小鼠肝纖維化實驗中,實驗組小鼠的脂質(zhì)合成相關(guān)基因DGAT1表達下調(diào),脂質(zhì)降解基因HSL表達上調(diào),病理切片觀察肝纖維化程度降低,這提示小檗堿能通過降低肝臟脂質(zhì)合成以及增加脂質(zhì)降解抑制肝細胞鐵死亡,進而緩解肝纖維化的進展[45]。

因此,小檗堿既靶向鐵蛋白自噬基因通過鐵蛋白自噬引起的鐵超載,誘導HSCs鐵死亡,也靶向DGAT1、HSL,抑制脂質(zhì)的過度積累,減少肝細胞鐵死亡。

3.4 雷公藤

雷公藤紅素可以通過抗氧化途徑誘導活化的HSCs發(fā)生鐵死亡,在多種肝臟疾病中顯示出有效的抗纖維化和抗炎活性。有實驗指出,雷公藤紅素通過活性半胱氨酸位點直接與過氧化物還原蛋白(PRDXs)結(jié)合,包括PRDX1、PRDX2、PRDX4和PRDX6,并抑制其抗氧化活性;靶向HO-1并上調(diào)其在活化的HSCs中的表達[46]。

3.5 前胡

紫花前胡素具有緩解TGF-β誘導的HSCs活化的抗肝纖維化作用,可以防止CCl4誘導的肝毒性,發(fā)揮抗氧化作用。研究表明,紫花前胡素可以明顯降低α-SMA和CollagenⅠ表達,并引起HSCs中Fe2+、脂質(zhì)過氧化物的升高及GPX4/GSH水平降低,而鐵死亡抑制劑破壞了紫花前胡素對HSCs鐵死亡及抗纖維化作用,這說明紫花前胡素可以通過增加Fe2+、脂質(zhì)過氧化物水平誘導HSCs鐵死亡,發(fā)揮抗肝纖維化的作用[47]。

3.6 甘草

甘草的活性成分如異甘草素和異甘草酸鎂在治療肝纖維化上效果顯著,通過干預(yù)肝細胞和HSCs的鐵死亡的發(fā)生,以達到抗纖維化的作用。在異甘草酸鎂對肝纖維化大鼠的作用研究中,異甘草酸鎂顯著降低了CollagenⅠ的表達,并且出現(xiàn)了Fe2+升高,HO-1水平升高,提示HSCs鐵死亡的發(fā)生,這說明異甘草酸鎂通過HO-1介導HSCs鐵死亡是其發(fā)揮抗肝纖維化作用所必需的[48]。在斑馬魚及小鼠的體內(nèi)外實驗中,ROS、TfR、DMT1的水平升高,GPX4水平降低,其機制在于異甘草酸通過抑制GPX4表達和增加TfR和DMT1的表達誘導HSCs鐵死亡來緩解肝纖維化,Cav-1在這個過程中起到促進作用。這提示我們Cav-1介導的HSCs鐵死亡是異甘草酸在體外和體內(nèi)發(fā)揮抗肝纖維化作用所必需的[49]。

3.7 其他

除上述傳統(tǒng)中藥及其衍生物,尚有從水果蔬菜中提取出的天然化合物。鞣花酸(EA)通過干擾SNARE復合物的形成來誘導HSCs的FPN依賴性鐵死亡,從而發(fā)揮其抗纖維化作用[50]。根皮苷通過鐵死亡、碳代謝等途徑抑制C57/BL6N小鼠模型中的肝纖維化[51]。野苦瓜提取物可以誘導結(jié)締組織生長因子(CTGF)、α-SMA、整合素-β1、磷酸化-JNK(p-JNK)、GPX4和SLC7A11下調(diào),提示野苦瓜提取物可能通過調(diào)控鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化的作用[52]。

3.8 中藥復方

中藥復方調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化的研究尚處于探索階段,多從肝損傷的角度研究中藥復方調(diào)控鐵死亡防治肝纖維化。中藥復方調(diào)控鐵死亡改善肝損傷是在中醫(yī)“治未病”理論指導下有效防治肝纖維化的初步探索。

中藥復方多通過抑制肝細胞鐵死亡減輕肝損傷過程中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,從而改善肝臟損傷。近五年的研究表明,參苓白術(shù)散能夠通過上調(diào)Nrf2信號通路改善氧化應(yīng)激的途徑抑制肝細胞內(nèi)鐵死亡,進而減少酒精性肝損傷,發(fā)揮抗氧化與抗炎作用[53];化脂復肝顆?？梢酝ㄟ^TLR4/NF-κB通路調(diào)控鐵死亡發(fā)揮顯著的降脂、抗炎、抗氧化損傷及保肝作用[54];澤瀉湯可以上調(diào)Nrf2信號通路抑制肝細胞鐵死亡,從而改善非酒精性脂肪性肝病[55];蒙藥德都紅花-7味散通過抑制肝細胞鐵死亡,從而減輕CCl4所致慢性肝損傷[56];扶正養(yǎng)肝合劑通過抑制鐵死亡,減輕藥物性肝損傷[57]。因此,運用中藥復方調(diào)控鐵死亡改善肝損傷是中醫(yī)藥防治肝纖維化的重要一環(huán)。

4 小結(jié)與展望

肝纖維化作為慢性肝病發(fā)展過程中的持續(xù)存在的病理改變,已成為臨床治療慢性肝病、預(yù)防肝硬化及肝癌的一個突破點。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展伴隨著HSCs的活化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理變化。鐵死亡作為新型的細胞死亡方式,已被證實參與肝纖維化的進程,對肝纖維化的發(fā)展具有雙面影響:一方面,鐵死亡過程中鐵代謝紊亂、脂質(zhì)代謝及過氧化都會改變肝臟內(nèi)環(huán)境,損傷肝細胞,誘導HSCs活化,最終促進肝纖維化;另一方面,鐵死亡可以作為一種減少HSCs活化及其數(shù)量的治療措施,抑制肝纖維化。通過促進HSCs鐵死亡、抑制肝細胞鐵死亡,是目前治療肝纖維化的可行措施。最新研究表明,通過鐵代謝、脂質(zhì)代謝及過氧化、GSH/GPX4等調(diào)控途徑可以防治肝纖維化。中藥及其活性成分抗肝纖維化作用具有多靶點、多途徑、個體化優(yōu)勢明顯等特點,鐵死亡是預(yù)防和治療肝纖維化的潛在靶向,因此通過中藥及其活性成分干預(yù)鐵死亡治療肝纖維化是未來研究的重點方向。

然而,目前中藥及其活性成分調(diào)控鐵死亡防治肝纖維化的研究仍處于探索階段,僅限于已知的具有抗纖維化作用的中藥及其活性成分。如何發(fā)現(xiàn)和驗證更多臨床尚未使用過的中藥及其活性成分通過鐵死亡治療肝纖維化,值得我們思考。同時,現(xiàn)階段關(guān)于鐵死亡與中藥復方的研究多局限于心腦血管病變,尚缺乏中藥復方包括經(jīng)方、驗方和時方在肝纖維化方面的研究。因此,這提示我們未來在調(diào)控鐵死亡抗纖維化的中藥研究中,有三個方向:利用FerrDb數(shù)據(jù)庫,發(fā)掘中藥中作為天然鐵螯合劑或抗氧化劑以此抑制正常肝細胞的鐵死亡;調(diào)節(jié)正常細胞對鐵死亡的敏感性,提高中藥活性成分對HSCs的靶向性,以期更好地闡釋中藥防治肝纖維化的作用機制,指導臨床用藥;從已知有效的中藥及活性成分入手,探索相關(guān)經(jīng)方或驗方是否可以調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化,以期未來可以有更多抗纖維化相關(guān)的中藥復方或中成藥。