江彬,高梓珊,余芝,楊淑杰,張怡雯,李心成,白文欣,陳翀,穆艷云,顧春艷

(1.南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院·整合醫(yī)學學院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院·養(yǎng)生康復學院,江蘇 南京 210023)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性、侵蝕性滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。RA患者臨床主要表現(xiàn)為反復發(fā)作的多發(fā)性小關節(jié)炎和侵蝕性骨破壞,疾病晚期會導致患者關節(jié)功能障礙、關節(jié)畸形及骨骼肌萎縮[1]。由于病理過程難以控制、致殘率高,嚴重影響患者生活質量,RA已成為世界性的難治疾病[2]。

在RA患者病理過程中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)-NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎性通路在RA滑膜炎進程中扮演關鍵角色,能夠促進RA慢性滑膜炎進展和骨破壞。研究發(fā)現(xiàn),ROS、活性氧調節(jié)因子1(Reactive oxygen species modulator 1,ROMO1)與NLRP3及其分泌的白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)具有顯著相關性[3-6]。其中ROMO1與ROS水平正相關,是常見的佐證ROS活性的蛋白[7]。臨床研究證實,NLRP3活性和IL-1β水平與RA患者病情嚴重程度呈正相關[8-9]。動物實驗發(fā)現(xiàn),在RA中過表達ROS可導致NLRP3炎性小體的異?；罨?從而促進促炎因子IL-1β和IL-18成熟和分泌,加重RA慢性滑膜炎及骨破壞[10]。NLRP3炎癥小體是RA炎癥和骨破壞的關鍵環(huán)節(jié),圍繞ROS-NLRP3炎性通路進行RA治療具有重要意義。艾灸治療RA簡單易操作,其抗炎鎮(zhèn)痛療效已被一系列臨床、動物實驗證實。AA大鼠模型因其與RA發(fā)病過程類似,并且制備方便、成模率高,被廣泛用作RA研究的動物模型。研究證明,艾灸能夠抑制RA患者和AA關節(jié)炎大鼠模型IL-17、NF-κB相關炎癥因子表達和炎癥通路激活,從而有效緩解RA滑膜炎癥,具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[11-16]。但艾灸能否通過調控ROS-NLRP3炎癥通路來發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用,相關的實驗研究還未證實。因此,本實驗基于此研究問題,采用AA模型大鼠,促進ROS過表達并給予麥粒灸治療,探索在ROS影響下的AA模型大鼠艾灸前后關節(jié)炎癥組織中的ROS-NLRP3炎性通路變化,為艾灸治療RA提供新的理論依據(jù)和科學思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠47只,8周齡,體質量為180～200 g,購于上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部,許可證號:SCXK(滬)2018-0006。飼養(yǎng)條件:大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心,溫度20～24 ℃,空氣流通,相對濕度45%,每日8:00-20:00光照12 h,不限制食水,適應性喂養(yǎng)1周后進行干預。飼養(yǎng)過程符合“3R”原則,實驗中所有干預操作均遵循動物倫理規(guī)定,嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》,并由南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批通過,倫理編號:202103A040。

1.2 實驗儀器、試劑和耗材

1.2.1 主要儀器 足趾容積測量儀(PV-200,成都泰盟);智能熱板儀(YLS-6B,濟南益延科技);紫外分光光度計(DU730,美國Beckman);低溫高速離心機(5425R,德國Eppendorf);Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)以及Mini Trans-Blot轉印系統(tǒng)(1658033,美國Bio-Rad);水平脫色搖床(S-002,華利達);高速冷凍離心機(3-18k,美國Sigma);多重實時熒光定量PCR儀(Quantstudio,美國Life technologies);酶標儀(F50,瑞士Tecan);洗板機(Hydroflex,瑞士Tecan);微量高速離心機Trans-Blot轉印系統(tǒng)(5427R,美國Eppendorf);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080,坤城)。

1.2.2 主要試劑和耗材 FCA(F5881,美國Sigma);魚藤酮(HY-B1756,美國MCE);葵花油(S875787,中國麥克林);TRIzol?Plus RNA Purification Kit(12183-555,美國Thermo);RNase-Free DNase Set(79254,美國QIAGEN);逆轉錄試劑盒(11752-050,美國Thermo);Power SYBR?Green PCR Master Mix(4913914001,美國Roche);兔源NLRP3抗體(1/1 000,ab263899,英國Abcam);Anti-ROMO1抗體(1/600,ab236409,英國Abcam);β-actin(1/1 500,ab8226,英國Abcam);Goat anti-rabbit IgG H+L二抗(1/5 000,31460,美國Thermo);Goat anti-rabbit IgG H+L二抗(1/5 000,31431,美國Thermo);IL-1β ELISA Kit(ANG-E11024R,南京奧青生物技術有限公司);IL-18 ELISA Kit(ANG-E11063R,南京奧青生物技術有限公司)。

純艾絨(南陽海生堂);線香(39.5 cm,臺灣富山香堂);凡士林(山東利爾康);一次性醫(yī)用鋪巾(50 cm×60 cm,河南鴻冉);不銹鋼彎鑷(10 cm,潮州粵康);復方紫草油(隨州健民)。

1.3 分組與造模方法

通過SPSS17.0隨機程序生成的隨機數(shù)字表將47只雄性大鼠分為空白組、模型組、模型艾灸組、ROS過表達組、ROS過表達艾灸組,空白組7只,其余各組每組10只,并給予普通飼料、足量飲水飼養(yǎng)。動物適應性喂養(yǎng)1周后參考佐劑性關節(jié)炎經(jīng)典造模[17]方法,對除空白組之外的所有大鼠進行造模,從右后足墊部二三掌指關節(jié)處皮下注射0.15 mL FCA,建立AA大鼠模型?？瞻捉M同法予等量生理鹽水。

ROS過表達造模:在大鼠AA造模第2天(Day2),將大鼠固定,每隔1 d從右足足跖皮下注射魚藤酮油溶液1.5 mg·kg-1,構建ROS過表達大鼠模型[18-20],其他組以同法注射等量生理鹽水。

具體實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental process

1.4 艾灸治療方法

模型艾灸組和ROS過表達艾灸組大鼠在造模結束后第7天進行艾灸治療。讓大鼠趴位姿勢固定,參照《實驗針灸學》[21]中的動物穴位圖譜定位,取大鼠足三里穴和腎俞穴,穴位周圍剃毛備皮,暴露背部及后肢干預治療。標記艾灸點,并在艾灸點涂上凡士林,取提前備好的麥粒灸(每壯5 mg,長約1 cm,形狀緊實似麥粒),粘立于凡士林上,每日下午14:00—16:00進行治療,每壯麥粒絨燃至皮膚收縮時取下熄滅,然后立即進行下1壯治療,各穴5壯,兩側交替。6 d為1個療程,共治療3個療程,療程之間休息1 d。空白組、模型組及ROS過表達組大鼠以同法固定,但不予艾灸治療。

1.5 指標檢測及方法

動物取材前夜,全部動物禁食不禁水12 h,次日使用電子天平稱體質量。將大鼠置于誘導盒并予3 mL·min-1異氟烷吸入快速麻醉大鼠,使用一次性真空采血管進行腹主動脈取血,取血完成后室溫靜置0.5～1 h,4 ℃、3 000 r·min-1離心20 min提取血清,取大鼠足踝部炎性組織、下丘腦于液氮中速凍后,置于-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.5.1 一般情況觀察 實驗人員于造模及每日艾灸治療后,觀察各組大鼠活動、精神狀況、反應速度、行動度、毛發(fā)色澤、進食飲水情況、二便等一般情況,并及時記錄。稱量、記錄全部大鼠體質量變化情況。

1.5.2 行為學檢測 大鼠右足趾容積檢測:造模前測量1次,造模后每周測量2次,16:00艾灸治療完成后開始測量。足趾測量儀校零后,抓住大鼠在其右踝前后高點處畫一條水平線,包裹住整個踝關節(jié)。將大鼠右側足緩慢放入盛有水的足容積測量儀量杯中,待畫線水平面下邊緣與量杯水面同齊,啟動測量開關并讀取測量數(shù)據(jù),3次誤差不超過0.1 mL。測量3次,取平均值。足腫脹度=(本次足容積-造模前足容積)/造模前足容積×100%。

屈腿嘶鳴評分[22]:造模前測量1次,造模后每周測量1次,16:00艾灸治療完成后開始測量。將動物裝進不透光的帆布手套內(nèi),使后腿和尾伸出手套外,穩(wěn)定5 min后進行評測。向腳掌側和腳背側緩慢屈曲大鼠的右側踝關節(jié),每隔5 s進行1次屈曲,共進行5次。屈曲關節(jié)時大鼠若出現(xiàn)嘶叫或短促明顯的縮腿反應則評分為1分;無反應評分為0分。每種指標的總評分為0～5分,2種指標的總評分為0～10分。用縮腿和嘶叫的總評分來反映大鼠關節(jié)疼痛的程度。

熱板法測痛實驗[23]:造模前測量1次,造模后每周測量1次,16:00艾灸治療完成后開始測量。將熱板溫度設定在55 ℃。測量時先使大鼠情緒安穩(wěn),放入測試箱,大鼠右足接觸熱板后出現(xiàn)快速收縮、踮腳或舔足反應,為計入時間點(最短刺激),每只大鼠間隔50 min后再次測量,共測量3次,3次測量數(shù)據(jù)取平均值。痛閾提高百分率=(當日治療后痛閾值-初次治療前痛閾值)/初次治療前痛閾值×100%。

1.5.4 qPCR檢測ROMO1 mRNA表達 用Trizol提取各組下丘腦細胞的總RNA,紫外分光光度計檢測RNA含量、純度及質量。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA,按Power SYBR?Green PCR Master Mix說明書對ROMO1 mRNA進行檢測,反應條件:95 ℃,1 min;40個循環(huán)(95 ℃,15 s,63 ℃,25 s,收集熒光)55→95 ℃熔點曲線。以β-actin為內(nèi)參,按照2-△△Ct進行統(tǒng)計分析ROMO1 mRNA相對表達水平。引物序列:ROMO1 F:5′-TGGGCGGCATTGGGAAAACCAT-3′,ROMO1 R: 5′-AGGAAGTTTGGGTGTAGCAGGGCA-3′;β-actin F: 5′-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGA-3′,β-actin R: 5′-GCATGAGGGAGCGCGTAA-3′。

1.5.5 ELISA檢測IL-1β、IL-18含量 取出血清樣品置于冰上融化,離心取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書配制梯度濃度的IL-1β、IL-18標準品。加樣封板后烘箱培育,加酶之后洗滌,加入工作液,每孔加入工作液100 μL。然后二次洗滌之后加入底物溶液中,封板后置于烘箱中顯色。加入終止液終止其反應,根據(jù)其在15 min內(nèi)的450 nm波長處所測量的各孔吸光度OD值來計算本樣本濃度。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 動物一般狀況

造模前(Day1),全部大鼠毛色光澤、行動敏捷、精神良好、活動度大、體質量均一、形體較為一致、食水正常、二便正常。造模1周后(Day9),模型組與模型艾灸組大鼠右足與自身正常左足相比,足色更紅,捫及有明顯發(fā)熱及腫脹,觸及有明顯縮腳的痛感行為,活動度變差,行動偏向正常足一側,且反應較空白組更為激烈。ROS過表達組與ROS過表達艾灸組出現(xiàn)行動緩慢、精神不佳、形體弓背、毛色雜臟的現(xiàn)象。

2.2 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠體質量變化的影響

造模前(Day1),各組大鼠的體質量差異不明顯(P>0.05)。造模后(Day9),ROS過表達組及ROS過表達艾灸組出現(xiàn)明顯的體質量減輕(P<0.01),模型組和模型艾灸組體質量無明顯差異(P>0.05),說明ROS過表達造模對大鼠體質量有影響,而FCA造模對其無明顯影響。同時,從自身體質量變化角度比較,僅ROS過表達組體質量在艾灸治療后期(Day28)無明顯變化(P>0.05),其他組體質量隨時間增長,同樣說明ROS過表達造模對大鼠體質量有影響。艾灸治療3周(Day28)后,與模型組相比,模型艾灸組體質量無明顯差異(P>0.05);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組體質量有明顯增加(P<0.05),說明艾灸治療可以恢復ROS對其體質量的影響。以上結果說明,ROS過表達能抑制大鼠的體質量增加,而艾灸治療能一定程度上恢復其體質量的上升,詳見表1。

表1 各組大鼠體質量在造模與艾灸治療干預前后變化Table 1 Effects of moxibustion on body weight changes in AA model rats under different ROS levels

2.3 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠足腫脹度、疼痛行為學指標的影響

2.3.1 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠足腫脹度變化的影響 造模前(Day1),將所有大鼠右后足腫脹度計為0。艾灸治療前(Day7),與空白組比,模型組、ROS過表達組、模型艾灸組、ROS過表達艾灸組的右后足腫脹度均顯著增加(P<0.01),表明AA造模成功。艾灸治療后期(Day28),與模型組相比,模型艾灸組右后足腫脹度顯著下降(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組右后足腫脹度顯著下降(P<0.01)。以上結果說明,艾灸能夠降低大鼠AA模型足腫脹度,并降低ROS過表達模型大鼠的右后足腫脹度,減輕炎癥腫脹程度(P<0.01),見圖2。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,##P<0.01。圖2 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠足腫脹度的影響Fig.2 Effect of moxibustion on the degree of foot swelling in AA model rats with different ROS levels

2.3.2 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠右足屈腿嘶鳴評分的影響 造模前(Day1),各組大鼠右足屈腿嘶鳴評分較為一致,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。艾灸治療前(Day8),與空白組比,模型組、ROS過表達組、模型艾灸組、ROS過表達艾灸組的右足屈腿嘶鳴評分較空白組顯著增加(P<0.01)。艾灸治療后期(Day27),與模型組相比,ROS過表達組右足屈腿嘶鳴評分顯著上升(P<0.01),模型艾灸組右足屈腿嘶鳴評分顯著下降(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組右足屈腿嘶鳴評分顯著下降(P<0.01)。以上結果說明艾灸能夠降低AA模型大鼠右足屈腿嘶鳴評分,減輕AA模型大鼠關節(jié)炎癥疼痛程度,并且可以緩解由ROS過表達導致的大鼠關節(jié)炎癥疼痛程度提高的現(xiàn)象(圖3)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,##P<0.01。圖3 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠右足屈腿嘶鳴評分的影響Fig.3 Effect of moxibustion on the score of right foot flexion and neigh in AA model rats with different ROS levels

2.3.3 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠熱痛閾提高百分率的影響

造模前(Day1),各組大鼠熱痛閾較為一致,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。艾灸治療前(Day5),與空白組比,模型組、ROS過表達組、模型艾灸組、ROS過表達艾灸組的痛閾提高百分率顯著降低(P<0.01)。艾灸治療后期(Day25),與模型組相比,ROS過表達組熱痛閾提高百分率顯著下降(P<0.01),模型艾灸組熱痛閾提高百分率顯著上升(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組熱痛閾提高百分率顯著上升(P<0.01)。以上結果說明,艾灸能調節(jié)AA模型大鼠的熱痛閾,并且可以緩解由ROS過表達導致的熱痛閾提高百分率的進一步下降(圖4)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,##P<0.01。圖4 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠熱痛閾提高百分率的影響Fig.4 Effect of moxibustion on the percentage increase of heat pain threshold in AA model rats with different ROS levels

2.4 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠踝關節(jié)炎性組織中ROMO1、NLRP3表達水平的影響

艾灸治療結束后(Day28),與空白組相比,模型組踝關節(jié)炎性組織ROMO1、NLRP3表達水平顯著上升(P<0.01),表明AA造模會使大鼠踝關節(jié)炎性組織氧化應激水平提高。與模型組相比,ROS過表達組ROMO1、NLRP3蛋白表達水平顯著上升(P<0.01),模型艾灸組顯著下降(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組ROMO1、NLRP3表達水平顯著下降(P<0.01)。以上結果說明,艾灸能夠促使AA模型大鼠踝關節(jié)炎性組織中ROMO1、NLRP3表達降低,同時可在一定程度上恢復由ROS過表達引起的氧化應激異常(圖5)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,圖5 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠踝關節(jié)炎性組織中ROS相關蛋白ROMO1、NLRP3表達水平的影響Fig.5 Effect of moxibustion on the expression levels of ROMO1 and NLRP3 proteins in ankle inflammatory tissue ofAA model rats under different ROS levels

2.5 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠下丘腦ROMO1 mRNA表達水平的影響

艾灸治療結束后(Day28),與空白組相比,模型組下丘腦ROMO1 mRNA表達水平顯著上升(P<0.01),表明FCA造模會使大鼠下丘腦氧化應激水平提高。與模型組相比,ROS過表達組ROMO1 mRNA表達水平顯著上升(P<0.01),模型艾灸組顯著下降(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組的ROMO1 mRNA表達水平顯著下降(P<0.01)。以上結果表明,艾灸能降低AA模型大鼠出現(xiàn)的中樞ROS氧化應激水平升高的現(xiàn)象,同時可在一定程度上恢復由ROS過表達引起的中樞氧化應激異常(圖6)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,圖6 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠下丘腦ROMO1 mRNA表達水平的影響Fig.6 Effect of moxibustion on the expression level of ROMO1 mRNA in hypothalamus of AA model rats with different ROS levels

2.6 艾灸對不同ROS水平下AA模型大鼠血清中IL-1β、IL-18水平的影響

在艾灸治療結束后(Day28),與空白組相比,模型組血清IL-1β、IL-18水平顯著上升(P<0.01)。與模型組相比,ROS過表達組血清IL-1β水平稍有提高(P>0.05),模型艾灸組IL-1β、IL-18水平均顯著下降(P<0.01);與ROS過表達組相比,ROS過表達艾灸組的IL-1β、IL-18水平顯著下降(P<0.01)。以上結果說明,艾灸能夠降低AA模型大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-18水平,同時可在一定程度上遏制由ROS過表達引起的IL-1β、IL-18水平升高(圖7)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,ΔΔP<0.01;與ROS過表達組比較,▲▲P<0.01;與模型艾灸組比較,圖7 各組大鼠治療結束后(Day28)IL-1β、IL-18表達水平比較Fig.7 Effect of moxibustion on serum levels of IL-1β and IL-18 in AA model rats with different ROS levels

3 討論

RA早期癥狀表現(xiàn)為四肢小關節(jié)炎癥,其關節(jié)炎和骨破壞逐漸向腕、踝、膝、肘、肩等部位發(fā)展。滑膜炎是RA病理機制的核心環(huán)節(jié)。最新研究表明,ROS-NLRP3-IL-1β是RA慢性滑膜炎癥和骨破壞的重要通路[24]。

在NLRP3的激活機制中,NLRP3需要通過上游ROS活化而激活[25]。ROMO1是細胞內(nèi)ROS的關鍵調節(jié)因子,其與ROS呈正相關,在許多與高氧化應激和炎癥相關的疾病中均會異常升高,并誘導線粒體ROS的產(chǎn)生[7]。NLRP3被ROS激活后,通過加工分泌成熟的炎性因子IL-1b,增強下游IL-1β和IL-18等炎癥因子含量,加重RA慢性滑膜炎癥[26]。其中IL-1β是RA疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的促炎因子,能夠加重滑膜炎[27];IL-18抑制成骨細胞分化從而促進骨破壞[28]。RA作為一種自身免疫疾病,應用免疫治療藥物雖具一定治療效果,但存在藥物不良反應嚴重、停藥復發(fā)風險高、價格高昂等問題。應用艾灸治療RA具有廣闊應用前景。臨床隨機對照實驗證實,艾灸治療RA具有確切療效,并且價格經(jīng)濟、療效顯著,具有安全性[29-31]。麥粒灸屬于直接灸,是常見的一類艾灸療法,作用溫和,療效持久,通過艾灸溫熱以及腧穴的雙重作用緩解RA引起的小關節(jié)疼痛及炎癥[32],被廣泛應用于RA治療中。

本實驗發(fā)現(xiàn),麥粒灸對AA模型大鼠關節(jié)炎癥具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。將足腫脹度、屈腿嘶鳴評分、熱痛閾實驗等多種行為學測試指標結合,發(fā)現(xiàn)艾灸治療能顯著改善AA模型大鼠的上述行為學測試指標(P<0.01),減少炎癥關節(jié)腫脹程度、緩解炎癥疼痛。與以往單純采用足腫脹度行為學測試的艾灸治療RA實驗相比,本實驗的行為學結果能夠從多維度反映艾灸對RA的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,實驗所使用的一系列行為學方法可以在以后的艾灸抗炎、鎮(zhèn)痛研究中繼續(xù)沿用。

隨后我們驗證了RA發(fā)生過程中,麥粒灸對大鼠關節(jié)炎的治療作用是由ROS-NLRP3-IL-1β炎癥通路介導。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠ROMO1、NLRP3蛋白,ROMO1 mRNA和IL-1β、IL-18等炎癥相關因子水平相比于空白組顯著升高(P<0.01),這表明ROS-NLRP3炎性通路與AA模型大鼠炎癥密切相關;艾灸治療后,模型艾灸組上述炎癥相關因子水平顯著下降(P<0.01),表明艾灸能抑制ROS-NLRP3炎性通路,減少炎性因子IL-1β、IL-18分泌,從而降低大鼠炎癥反應和疼痛程度。同時本實驗采用魚藤酮注射大鼠誘導ROS過表達,發(fā)現(xiàn)相比于模型組,ROS過表達組的ROMO1、NLRP3蛋白以及ROMO1 mRNA水平進一步增加,IL-1β、IL-18水平略有上升。同時,相較于ROS過表達組,ROS過表達艾灸組大鼠ROMO1、NLRP3蛋白,ROMO1 mRNA和IL-1β、IL-18水平均顯著降低(P<0.01),表明艾灸治療在不同ROS激活水平下均能顯著降低AA大鼠的炎癥相關因子,改善AA大鼠的氧化應激損傷。然而ROS過表達艾灸組相比于模型艾灸組,ROMO1、NLRP3蛋白與ROMO1 mRNA水平明顯更高,但IL-1β、IL-18水平無明顯改變。這表明ROS過表達可能能夠抵消艾灸對大鼠ROS、NLRP3的調節(jié)作用,但是艾灸對ROS過表達模型大鼠炎性因子IL-1β、IL-18水平的調節(jié),不受ROS過表達誘導的影響,說明艾灸或許是通過多靶點和多通路發(fā)揮抗炎效應。

綜上所述,麥粒灸能夠緩解AA大鼠關節(jié)炎炎性腫脹和疼痛,其機制可能是麥粒灸通過抑制AA模型大鼠ROS-NLRP3-IL-1β炎性通路從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用。希望后續(xù)通過多組學技術、細胞因子芯片等方法進一步探索麥粒灸治療RA的復雜分子機制,可為臨床治療RA提供新的治療方式和理念。