于瀾，楊少鋒

1 湖南中醫(yī)藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410208

頸椎病[1]（Cervical spondylosis）是由于頸椎退行性改變或是周圍組織病理改變，影響周圍的神經、血管等，導致一系列癥狀和體征。近些年來，頸椎病的發(fā)病率逐年呈遞增的趨勢。近年來，現代醫(yī)學對癥治療頸椎病的局限性和不穩(wěn)定性以及臨床治療模式的轉型[2]，在頸椎病的前期治療及延緩疾病發(fā)展過程中，中醫(yī)藥治療[3]具有整體辨證、使用方便、療效突出、價格低廉等優(yōu)勢受到廣泛認可；但是中醫(yī)藥治療頸椎病的科學性備受質疑，故因此利用網絡藥理學技術探究中藥復方治療頸椎病的分子機制具有重要的臨床意義。頸椎病在中醫(yī)中屬于“項痹”范疇[4]，氣血受到風寒濕阻滯，周圍筋肉無以濡養(yǎng)，而出現頸部酸脹痛，伴隨眩暈、手部疼痛和麻木，活動欠佳的癥狀。

附子湯[5]出自《傷寒雜病論》，原文論述為“少陰病，身體痛，手足寒，骨節(jié)痛，脈沉者，附子湯主之”，具有溫經助陽，祛寒除濕的功效。本課題組[6-9]運用六經辨證在臨床上運用經方治療頸椎病取得了較好的療效，現代研究也證實[10]附子湯具有抗炎、止痛、調節(jié)關節(jié)軟骨代謝等作用，但是附子湯治療頸椎病的作用機制還未明確，因此本課題組通過網絡藥理學進一步預測附子湯的活性化合物及治療頸椎病的靶點，然后通過分子對接驗證，為附子湯治療頸椎病提供科學理論基礎。

資料與方法

1 附子湯中藥化學活性成分及作用靶點的挖掘篩選

在TCMSP[11]（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫中以藥物口服生物利用度 （oral bioavailability，OB）≥ 30%，藥物相似性 （drug likennss，DL）≥ 0.18，作為篩選參數分別檢索附子湯的成分“附子、茯苓、人參、白術、芍藥”的活性成分。將上述在TCMSP數據庫中獲得的活性成分按Related Targets獲得相應的疾病作用藥靶，在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫，篩選物種為“homo sapiens”的靶點，獲得公認的gene symbol。

2 頸椎病疾病靶點收集與篩選

通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：/www.omim.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、Drugebank（https：//go.drugbank.com/）、CTD[12]數據庫。搜索 “cervical myelopathy”或”cervical spondylosis”，獲得頸椎病疾病靶點，通過去除重復靶點及將重復靶點在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫，篩選物種為“homo sapiens”的靶點，獲得官方頸椎病疾病靶點。并將附子湯藥物的作用靶點與頸椎病疾病靶點上傳至Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得交集為附子湯治療頸椎病的潛在作用靶點（核心基因）。

3 KEGG通路和GO富集分析

將上述獲的核心基因運用Metascape數據庫（http：//metascape.org/gp/index.html）做GO富集分析與KEGG富集分析，FDR ＜ 0.05代表富集結果顯著。最后利用R語言繪制 GO 富集分析氣泡圖及KEGG富集分析氣泡圖。

4 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

將上述獲得的核心基因上傳至STRING數據庫Version11.0（http：//STR-ING-db.org）對蛋白質相互作用關系（protein-proteininteraction，PPI）預測，選擇“homo sapiens”的參數，設置互動分數為0.4，隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點，獲得蛋白質相互作用的數據，在Cytoscape 3.7.1軟件中打開蛋白質相互作用數據，節(jié)點的大小顏色代表結合分數高低，節(jié)點的連線代表結合分數高低，獲得PPI圖。

5 附子湯作用于頸椎病“藥物-活性成分-疾病作用靶點”網絡構建

在Excel中建立復方與單味中藥、單味中藥與活性成分、活性成分與作用靶點、疾病與疾病致病靶點關系數據，利用Cytoscape3.7.1軟件打開數據構建“藥物-活性成分-疾病作用靶點”網絡圖，利用Network Analyzsis計算單個節(jié)點Degree值。

6 核心分子對接驗證

將上述Degree數據進行排序，挑選Degree值位于位于前10的core gene，在PDB（https：//www.rcsb.org/）數據庫，選擇“homo sapiens”的參數，下載核心蛋白的基因3D結構（.PDB格式）；挑選Degree值位于前10的中藥活性成分，在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，下載活性成分小分子化合物結構（.mol2格式），利用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉為pdbqt格式，最后進行利用Vina進行對接，評估對接binding energy，選取結合能≤ -5.0 kJ/mol 的活性成分作為附子湯治療頸椎病靶點的篩選依據，并用PyMOL軟件建立對接模式圖。

結 果

1 復方活性成分篩選結果

通過TCMSP數據庫獲得活性化合物，剔除無對應靶點的活性成分，共獲得38個活性成分，其中白芍8個，白術4個，茯苓6個，附子6個，人參17個。其中白芍和人參活性成分重合β-谷固醇（betasitosterol）、谷甾醇（kaempferol），白芍和附子活性成分重合谷甾醇（sitosterol）?；钚猿煞值幕拘畔⒁姳?，下表僅列出Degree值前12活性成分。

表1 degree值排名前12的活性成分的基本信息

表2 6個核心靶點蛋白拓撲學性質

2 附子湯藥效靶點及預測疾病治療靶點結果

在TCMSP數據庫和BATMAN數據庫預測到109個附子湯藥物靶標，檢索GeneCards、OMIM、Drugebank、DisGeNET、CTD數據庫分別檢索疾病靶標，剔除重復檢索的靶標，上傳至Uniport數據庫，得到“homo sapiens”。致病靶標976個。

3 附子湯-頸椎病交集靶點Venny圖

運用Venny平臺，得到附子湯與頸椎病的交集基因16個，見圖1。下載交集數據，后續(xù)進行GO、KEGG分析。

圖1 附子湯-頸椎病Venny

4 KEGG通路和GO富集分析結果

利用Metascape數據庫對上述交集潛在作用靶點進行生物信息學分析。該富集分析中，GO條目283個，包括生物過程（biological process，BP）主要是對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、細胞對藥物的反應等；細胞組成（cellular component，CC）涉及膜筏、膜微區(qū)等；分子功能（molecular function，MF）涉及蛋白激酶活性、細胞因子受體結合等。根據P＜0.01，分別取排名前20的條目進行可視化分析，見圖2。KEGG條目55條，信號通路主要涉及TNF信號通路、IL-17信號通路、c-type lectin receptor信號通路等。

圖2 GO富集分析氣泡

圖3 附子湯交集靶點蛋白PPI網絡

圖4 藥物-活性成分-疾病作用靶點網絡

5 PPI網絡構建模塊

將在Venny平臺下載得到的16個交集基因上傳到STRING數據庫，設置互動分數為0.4，隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點，得到蛋白互作PPI網絡，網絡中有節(jié)點16個，線條數53條，平均節(jié)點度：6.62，取BetweennessCentrality值＞0.0126012，ClosenessCentrality值＞0.55801105，Degree值＞1倍中位數值7，得到IL6、IL1B、PTGS2、CASP3、CASP1、VCAM1這些靶點可認為是附子湯治療頸椎病中發(fā)揮重要作用。

6 附子湯作用于頸椎病“藥物-活性成分-疾病”作用靶點網絡構建

利用Cytoscape 3.7.0軟件對藥物-活性成分-疾病進行網絡構建，其中深藍色倒三角為附子湯，深藍色三角形為頸椎病，淺藍色矩形為各藥味名稱，深紅色矩形為藥物共用活性成分和疾病致病靶點，其余淡紅色矩形代表藥物共有活性成分。節(jié)點之間連線表明藥物-活性成分-疾病之間的靶向關系，連線越多越密集，節(jié)點在網絡中越占據核心地位。

7 分子對接結果

將附子湯篩選得到的10個核心靶點及核心活性成分進行分子對接，其中核心靶點的基本信息見下表3，橫坐標為核心蛋白，縱坐標為核心活性成分作結合能熱值圖，如圖5。分子對接結果中，絕大部分分子結合能＜-5.0 kJ/mol，其中Fumarine、Inermin、Frutinone A、Deltoin、Girinimbin與4個蛋白結合能均＜-5.0 kJ/mol，beta-sitosterol、Stigmasterol除與CASP3外，其余結合能均＜-5.0 kJ/mol，表明這些活性成分與靶點有更佳的結合能力，可能為附子湯作用于頸椎病的關鍵活性成分。繪制每個活性物質對接最低結合能對接模式圖，見圖6。

圖5 附子湯中活性成分與核心靶點分子對接結合能熱

圖6 每個結合能最低的活性成分-靶點

討 論

基于網絡藥理學和分子對接，探討附子湯治療頸椎病的作用機制，從單味中藥與靶點匹配結果中發(fā)現，丁香酮 A、普羅托品、β-谷甾醇、豆甾醇等能夠匹配較多靶點，可能為附子湯治療頸椎病的關鍵活性成分，丁香酮A有多種生物活性，包括抗氧化以減弱氧化應激反應，抑制炎癥的發(fā)生，軟骨細胞的凋亡來治療關節(jié)炎；普羅托品[13]通過抑制核因子-κB信號通路，從而減弱促炎酶、細胞因子和趨化因子的表達，導致促炎介質的下調，進而用于關節(jié)炎的防治；此外，普羅托品具有抑制脂多糖誘導的細胞凋亡[14]。在免疫系統(tǒng)中起主要作用TOLL樣受體4（TLR4）是脂多糖的識別受體，炎癥刺激脂多糖TOLL受體后，核因子κB信號通路被激活[15]，并促進炎性細胞因子和化學誘導劑的產生[16]，另外，其減少炎癥介質如前列腺素釋放，致體內環(huán)氧合酶-2含量下調，增加抗炎因子基因表達水平[17]；β-谷甾醇具有抗炎、抑制腫瘤、免疫調節(jié)、抗氧化、鎮(zhèn)痛、促進傷口愈合等廣泛的生物作用[18]，此外，其通過提升機體氧自由基（OFR）的清除能力，促使血清NO含量升高，抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）的聚集與釋放[19]，例如黃建春[20]等發(fā)現豆甾醇能夠清除O2和·OH等自由基，并且高濃度的豆甾醇具有明顯的抑制效應，具有抗氧化作用；0.3～3mg/kg豆甾醇對明顯鎮(zhèn)痛作用[21]。

炎癥發(fā)生細胞因子刺激活性氧的生成[22]，這種活性氧體內水平上調可以促使細胞凋亡，可以激活包括NF-κB的通路、TNF信號通路等多種信號通路[23]。實驗證明，NF-κB的通路調節(jié)促炎細胞因子轉錄，導致頸椎退行性病變[24]，當抑制NF-κB活性后，IL-6等炎性因子的表達水平明顯降低[25]，干預NF-κB信號通路的下調PAR2可有效延緩炎癥的發(fā)展[26]。研究表明[27]，在頸椎病患者中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子指標顯著升高，其通過誘導神經根鞘損傷影響神經傳導功能。其次，TNF-α機體水平越高，神經根性疼痛越明顯[27]。

分子對接分析提示，PTGS1、PTGS2、CASP3等頸椎病致病的關鍵靶點，PTGS酶又名環(huán)氧合酶，分為兩個種類，即結構型的PTGS1和誘導型的PTGS2，能夠合成前列腺素[28]，頸椎病的發(fā)生發(fā)展是由于椎間盤周圍組織退行性變，或內外壓力失衡，出現椎體周圍組織不穩(wěn)后，導致的創(chuàng)傷性炎癥[29]，人體是一個有機整體，長期炎性刺激促使機體代償性構建椎旁穩(wěn)定[30]，故椎間盤的退行性變，椎間結構不穩(wěn)不是引起頸椎病的主要原因，其次與釋放的炎性因子有關[31]，PTGS1也被認為在炎癥、關節(jié)炎和癌癥的病理生理過程中起關鍵作用[32]。研究表明，在炎癥介質下，PTGS2的表達上調[33]。CASP3蛋白為天冬氨酸特異酶、半胱氨酸蛋白酶 （Caspases）的家族蛋白，在細胞凋亡中起關鍵作用[34]，此外，炎癥反應和MAPK通路的激活均有CASP3的參與[35]。

綜上，附子湯可能是通過影響NF-κB的通路、TNF信號通路來緩解頸椎間盤中的炎癥反應，進而對頸椎病有較好的臨床效果，然而，本研究是基于有限的生物數據庫中收錄內容，可能會造成結果的偏倚，此外，分子對接技術是通過計算機模擬技術而實現，因此最終附子湯治療頸椎病的藥物活性成分、靶點、機制等還需要后期可通過體內、體外實驗進一步驗證，為附子湯治療頸椎病提供更充分的科學依據。