武桐，吳越，李偉莉，3

1 安徽醫(yī)科大學(xué) 安徽合肥 230031

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230031

3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），是指卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，從而導(dǎo)致女性性激素缺乏、生育能力下降的一種疾病，進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)槁殉苍缢1]。西醫(yī)主要采用激素替代療法、促排卵療法及輔助生殖技術(shù)等方法進(jìn)行治療[2]，但其缺點(diǎn)不容忽視，比如增加?jì)D科腫瘤和心血管疾病等發(fā)病幾率的風(fēng)險、依賴性強(qiáng)、失敗率高、價格高昂等。中醫(yī)藥治療本病歷史悠久，已積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)學(xué)中，并無卵巢儲備功能下降的病名，但可根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬于“月經(jīng)過少”“月經(jīng)后期”“不孕”“經(jīng)斷前后諸證”等范疇。現(xiàn)臨床常用中成藥制劑--坤泰膠囊，由《傷寒論》中“黃連阿膠湯”化裁而來，具有滋陰清熱、安心除煩、補(bǔ)血養(yǎng)血、調(diào)和陰陽等多重功效，主要用于絕經(jīng)期前后諸證、婦女卵巢功能衰退等婦科疾病。坤泰膠囊組方為熟地、黃芩、黃連、茯苓、白芍和阿膠，其中熟地為君藥，生精益髓、滋陰養(yǎng)血；黃連苦寒，入心經(jīng)而清降心火，阿膠甘平，入腎經(jīng)而補(bǔ)血滋陰，兩藥相伍以達(dá)心火降、腎水旺，調(diào)和陰陽之功，此共為臣藥；黃芩助黃連清熱瀉火，白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，柔肝斂陰，助阿膠滋補(bǔ)腎水，茯苓健脾寧心，此共為佐藥。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度，解析藥物和治療對象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律的新興學(xué)科[3]。坤泰膠囊雖已在臨床上取得一定效驗(yàn)，但其發(fā)揮作用的有效活性成分、潛在靶點(diǎn)、生物過程尚不十分明確。故本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過挖掘坤泰膠囊治療 DOR 的有效成分、潛在作用靶點(diǎn)，進(jìn)行Go功能富集及KEGG通路富集分析，系統(tǒng)的對其作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，以期為卵巢儲備功能下降的臨床決策提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

1 坤泰膠囊的活性成分及靶標(biāo)基因收集

通過TCMSP（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對坤泰膠囊中熟地、黃連、白芍、黃芩、茯苓進(jìn)行檢索，利用BATMAN-TCM（bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm）和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）對阿膠進(jìn)行檢索，由此建立坤泰膠囊的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。以藥動學(xué)參數(shù)中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18作為篩選條件，最終獲得的化合物共77個。將獲得的活性成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索出對應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得坤泰膠囊的基因靶點(diǎn)。

2 DOR疾病靶標(biāo)收集

以“diminished ovarian reserve”為關(guān)鍵詞，在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）及Genecards數(shù)據(jù)庫（http：//genecards.org/）中檢索DOR的疾病靶點(diǎn)。

3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將整理好的坤泰膠囊有效成分及靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.8.0軟件，建立“成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，由此得出坤泰膠囊治療 DOR 的主要活性成分。

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic/tools/venny/index.html）獲取坤泰膠囊與疾病的交集靶點(diǎn)，然后將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（http：//www.string-db.org），限定物種選擇“Homo sapiens”，置信度選擇“medium confidence（0.400）”，同時將游離點(diǎn)設(shè)置隱藏，得到相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化展示。

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

Metasacpe平臺（http：//metascape.org/gp/index.html）是一個功能豐富的基因功能注釋分析工具。將坤泰膠囊治療 DOR 的靶點(diǎn)錄入Metasacpe平臺，限定物種選擇“H.sapiens”，分析類型選擇“Custom Analysis”，分別進(jìn)行Go功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信（www.bioinformatics.com.cn）制作條形圖、氣泡圖以求數(shù)據(jù)可視化。

結(jié) 果

1 坤泰膠囊的活性成分收集

由TCMSP數(shù)據(jù)庫得出的活性成分分別為熟地2個，黃連14個，白芍13個，黃芩36個，茯苓15個，阿膠3個，由BATMAN-TCM和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫得到阿膠的3個活性成分，部分活性成分信息見表1。

表1 坤泰膠囊所含部分化合物基本信息

2 坤泰膠囊作用靶點(diǎn)和DOR疾病靶點(diǎn)獲取

在TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索坤泰膠囊的基因靶點(diǎn)，在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫及Genecards數(shù)據(jù)庫檢索DOR 的疾病靶點(diǎn)，分別整合去重，最終得到140個藥物作用靶點(diǎn)，3522個疾病靶點(diǎn)。同時繪制成韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)112個。如圖1。

圖1 藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將坤泰膠囊的有效成分及靶點(diǎn)傳輸至Cytoscape軟件之后，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），包括294個節(jié)點(diǎn)，427條邊，其中黃色菱形代表坤泰膠囊的有效成分，綠色圓形代表作用靶點(diǎn)，連接條數(shù)最多、較為密集的成分和靶點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)（度值≥20），可以得到坤泰膠囊治療DOR 的核心有效活性成分依次為槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇、蛇床子素。

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將在韋恩圖中獲得的交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，獲取TSV格式文件后導(dǎo)入Cytoscape3.8.0繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示degree值的大小，即節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，degree值越大；用邊的粗細(xì)和顏色表示combined score的大小，即邊越粗、顏色越深，combined score值越大。其中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53、CXCL8、MMP9等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

將篩選到的坤泰膠囊治療 DOR 的靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫中，分別進(jìn)行Go功能富集分析及KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.01，其中Go富集分析又包括生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）及細(xì)胞組分（cellar component）。搜集到生物過程112個條目，分子功能42個條目，細(xì)胞組分21個條目，信號通路107個。分別選取前20的條目進(jìn)行可視化，將結(jié)果導(dǎo)入微生信進(jìn)行Go富集分析三合一柱狀圖和KEGG富集分析氣泡圖繪制。其中KEGG富集分析氣泡圖中，P值用氣泡顏色表示，代表富集程度，即越接近紅色代表P值越小；count值用氣泡大小表示，代表富集基因數(shù)，即氣泡越大就代表富集的基因數(shù)目越多；橫坐標(biāo)為基因比例，縱坐標(biāo)為信號通路名稱（見圖4、圖5）。

圖4 Go功能富集分析（三合一）

圖5 KEGG富集分析

討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，探索坤泰膠囊的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制。在化合物和作用靶點(diǎn)方面，共篩選出坤泰膠囊的主要活性成分有77個，作用靶點(diǎn)有112個。其中起關(guān)鍵作用的活性成分分別為槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇、蛇床子素。槲皮素、山奈酚、漢黃芩素屬于黃酮類化合物，都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗癌的作用。有研究證明槲皮素可以調(diào)節(jié)女性生殖系統(tǒng)功能，減少卵巢細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，直接調(diào)節(jié)類固醇和肽類激素的釋放，即通過調(diào)節(jié)HGPA軸，下調(diào)FSH及LH水平，還可降低雌激素受體α（ERα）、β（ERβ）和孕激素受體（PR）在下丘腦、垂體和子宮內(nèi)膜的表達(dá)[4]。β谷甾醇和豆甾醇屬于植物甾醇類，為天然多酚羥酸類化合物。β谷甾醇有著抗炎、抗氧化、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)的作用，曾莉萍認(rèn)為β谷甾醇具有雌激素活性，誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素[5]，更有研究表明β谷甾醇可通過增加P-AKT 和 P-PIK3CA蛋白表達(dá)水平促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，且降低Caspase-3蛋白表達(dá)水平，從而抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[6]。豆甾醇可調(diào)節(jié)促性腺激素，具有抗氧化活性[7]。蛇床子素具有緩解氧化應(yīng)激損傷的作用，可保護(hù)卵巢組織的功能，增強(qiáng)卵巢組織的抗氧化能力[8]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53是坤泰膠囊治療 DOR 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1是P13K/AKT通路中的重要蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞存活、發(fā)育和增殖[9]，李錦英[10]等學(xué)者認(rèn)為AKT1可維持原始卵泡正常的生長發(fā)育，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和顆粒細(xì)胞的增殖分化，并可抑制細(xì)胞凋亡。卵巢血管生成對卵泡發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，馮遜遜[11]等人通過超聲動態(tài)觀察免疫性原發(fā)性卵巢功能不全的小鼠與正常小鼠，證明了卵巢血管順應(yīng)性和血管彈性與卵巢儲備功能呈正相關(guān)。而VEGFA是主要的促血管內(nèi)皮生長因子之一，一般來源于基質(zhì)細(xì)胞，在血管生成和血管通透性方面發(fā)揮生理功能，Wei Jingzan[12]經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)表明，VEGFA與miR-185相互影響，達(dá)到減輕卵巢結(jié)構(gòu)損傷，保護(hù)顆粒細(xì)胞層厚度、膜細(xì)胞層厚度的作用。諸多研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2主要定位于顆粒細(xì)胞，卵丘細(xì)胞和黃體細(xì)胞，參與多種生殖活動，例如排卵、著床及妊娠等，且其高表達(dá)與血管生成密切相關(guān)，從而影響卵巢血供[13-14]。CASP3是Caspase家族重要的下游調(diào)控因子，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，可使卵巢功能下降[15]。TP53在細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老和自噬等各種環(huán)節(jié)中扮演者重要角色。相關(guān)研究證明，衰老細(xì)胞在TP53缺失后，對凋亡信號失去反應(yīng)，可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，使衰老細(xì)胞快速增殖[16]，這可能是TP53成為坤泰膠囊治療 DOR 關(guān)鍵靶點(diǎn)之一的原因。

通過Go生物過程功能富集分析，可以得到坤泰膠囊可能主要參與炎癥反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)過程、對無機(jī)物的應(yīng)答、離子反應(yīng)的正向調(diào)控等生物過程。通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)富集通路主要是信號傳導(dǎo)通路（JAK-STAT、Wnt、VEGF、HIF-1、NF-KB、雌激素、趨化因子、長壽信號通路）、疾病通路（利什曼原蟲感染、胰島素抵抗、丙肝、癌癥）等。其中顯著性較高的通路為癌癥、糖尿病并發(fā)癥中的糖化終末產(chǎn)物及其受體信號通路、丙型肝炎等，JAK-STAT信號通路受雌激素調(diào)控，并與衰老相關(guān)通路有通向變化[17]，HIF-1通路與細(xì)胞增殖、血管生成的蛋白質(zhì)表達(dá)有關(guān)[18]，Wnt通路的作用于胚胎發(fā)育，同時參與成年女性的生殖功能、維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等。由此可見，坤泰膠囊是通過多靶點(diǎn)、多通路對 DOR 進(jìn)行調(diào)控以達(dá)到治療作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步闡釋了坤泰膠囊治療 DOR 的相關(guān)作用機(jī)制，體現(xiàn)了多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的治療特點(diǎn)。然而由于現(xiàn)階段中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫資料不足、各數(shù)據(jù)庫之間差異較大等，本研究結(jié)果可能有偏差，且本次研究僅限于分子層面，仍需更多研究加以佐證。