李芳芳，王勃，崔仁杰，陳志廣，呂海龍

1.隴南市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，甘肅隴南 746000；2.成都市第三人民醫(yī)院肝膽外科，四川成都 610504

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）是一種含硫有機(jī)化合物，經(jīng)常被作為許多藥物的溶劑而被廣泛應(yīng)用，目前在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中研究得出其終濃度＜0.1%時(shí)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響，細(xì)粒棘球蚴是一種原始的多細(xì)胞生物，其由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜因此藥物使用量通常要高于單細(xì)胞生物。因此在實(shí)驗(yàn)過程中當(dāng)藥物用量較大、藥物溶解度較低時(shí)，0.1%的DMSO 所溶解的藥物往往達(dá)不到實(shí)驗(yàn)需求。但是對(duì)于DMSO 在細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)所能耐受的最高濃度方面尚無明確研究。

因此本研究自2020 年1 月—2022 年6 月隴南市第一人民醫(yī)院聯(lián)合石河子大學(xué)課題組收集并體外培養(yǎng)的自然感染的原頭節(jié)，選取不同濃度的DMSO 體外作用，觀察其對(duì)原頭節(jié)生長(zhǎng)作用的影響，初步探討原頭節(jié)生長(zhǎng)所能耐受的最高濃度，為以后的研究提供新的支撐依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)：自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊肝臟，由新疆石河子市西部牧業(yè)公司提供。培養(yǎng)基為含10% 小牛血清的RPMI 1640，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 更換培養(yǎng)基一次。二DMSO 購自Sigma 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購自上海哈靈生物科技有限公司，Caspase-3 試劑盒購自北京普利萊（APPLYGEN）基因技術(shù)有限公司，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（Nuaire 公司），奧林帕斯IX71 熒光倒置顯微鏡Olympus optical 公司。

1.2 方法

伊紅染色法測(cè)定細(xì)胞存活率取原頭節(jié)接種后，本研究將DMSO 在培養(yǎng)基中濃度調(diào)整為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。對(duì)照組不加DMSO。在37℃、10%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 分別從各組均勻抽取約100～150 個(gè)原頭節(jié)（移液槍混勻后需150～200 μL 混合液），置于EP 管中靜置取含原頭節(jié)的培養(yǎng)基與0.1%伊紅與頭節(jié)按1∶1 等體積混合涂于載玻片，靜置15 mim 后待伊紅與頭節(jié)充分接觸后壓片并于倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)的形態(tài)及活力變化。在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)顏色的變化觀察原頭節(jié)的活力，活的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活動(dòng)性較好，則拒染不會(huì)被著紅色；死亡的或活力差的原頭節(jié)將會(huì)被染成紅色，并伴有某些結(jié)構(gòu)的破壞，觀察活力并計(jì)數(shù)。

取上述濃度作用48 h 后原頭節(jié)，PBS 沖洗，棄上清液后按每1 mg 原頭節(jié)：裂解液50 μL 的比例混勻，在超聲粉碎儀下超3 次，15 s/次。用Bradford 法測(cè)定各組蛋白濃度，并配平蛋白濃度。將各樣品依據(jù)說明書加入96 孔酶標(biāo)板，避光37℃恒溫孵育箱動(dòng)態(tài)觀察，當(dāng)?shù)鞍滓侯伾黠@出現(xiàn)黃色時(shí)，BIO-RAD酶標(biāo)儀檢測(cè)其各組在A405處的吸光度值。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并借助相關(guān)軟件求得ρNA 的濃度。

分別取0.5%、1.0%DMSO 作用48 h 后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，同時(shí)RPMI 1640 為空白對(duì)照組，取樣品用PBS 洗滌（方法同上），將洗干凈的頭節(jié)用4%戊二醛中固定，過夜使充分作用。重復(fù)ddH2O 洗滌3次，用濃度逐漸增加的丙酮逐級(jí)梯度脫水，50%（5 min）、70%（10 min）、80%（10 min）、90%（10 min）、100%（10 min）。離心棄上清2%的瓊脂糖包埋，室溫下冷卻至凝固后放入4%戊二醛內(nèi)固定過夜。環(huán)氧樹脂（Epon812）包埋、固定。在賴克特和榮格（LKB2088V）型超薄切片機(jī)切片（厚度為1～2 μm 厚的薄切片），醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，置于日本會(huì)株投射電子顯微鏡（型號(hào)JEOL 1230）上在80 kV條件下觀察原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 觀察指標(biāo)

伊紅染色并觀察不同濃度DMSO 作用組原頭節(jié)后48 h 活力并計(jì)數(shù)，不同濃度的DMSO 對(duì)原頭節(jié)體內(nèi)Caspase-3 酶活性影響的測(cè)定，投射電子顯微鏡觀察原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DMSO 對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的存活率對(duì)比

0.5%的DMSO 作用原頭節(jié)48 h 后，原頭節(jié)存活率仍為（89.3±1.24)%與空白對(duì)照組原頭節(jié)存活率（91.2±2.17）%對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但濃度為1.0%、2.0%DMSO 作用原頭節(jié)48 h 后，其存活率分別為（55.3±1.13）%、（41.7±1.24）%，其存活率明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.726、9.217，P＜0.05）。見表1。

表1 DMSO 作用48 h 后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的存活率對(duì)比[(±s)，%]

表1 DMSO 作用48 h 后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的存活率對(duì)比[(±s)，%]

注：▼P＜0.05，與空白對(duì)照組相比

組別空白對(duì)照組0.1%DMSO 0.2%DMSO 0.5%DMSO 1.0%DMSO 2.0%DMSO作用48 h 后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)存活率91.2±2.17 90.4±1.19 88.4±2.06 89.3±1.24（55.3±1.13）▼（41.7±1.24）▼

2.2 不同濃度DMSO 對(duì)原頭節(jié)內(nèi)Caspase-3 酶活性表達(dá)的對(duì)比

結(jié)果顯示1.0%、2.0%濃度的DMSO 作用組原頭節(jié)內(nèi)Caspase-3 的活性表達(dá)明顯較空白對(duì)照組及0.1%、0.2%、0.5% 增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；作用48 h 時(shí)2.0%DMSO 組Caspase-3 的活性表達(dá)最強(qiáng)（53.331±0.572）μmol/L，同樣1.0%DMSO 作用組的原頭節(jié)體內(nèi)Caspase-3 的活性也呈增強(qiáng)趨勢(shì)。見表2。

表2 不同濃度DMSO 作用48 h 后各組Caspase-3 酶活性對(duì)比[(±s)，μmol/L]

表2 不同濃度DMSO 作用48 h 后各組Caspase-3 酶活性對(duì)比[(±s)，μmol/L]

注：▼P＜0.05，與空白對(duì)照組相比

組別空白對(duì)照組0.1%DMSO 0.2%DMSO 0.5%DMSO 1.0%DMSO 2.0%DMSO作用48 h 后Caspase-3 8.275±0.617 11.004±0.217 13.203±0.612 19.903±0.562（45.658±0.627）▼（53.331±0.572）▼

2.3 不同濃度的DMSO 對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的影響

空白對(duì)照組原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)顯示清楚，囊泡排列較規(guī)則，合胞體帶致密，微毛排列整齊（圖1A）。0.5%DMSO 作用原頭節(jié)48 h 后，與空白對(duì)照組比較，原頭節(jié)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，未見明顯損害（圖1B）。而1.0%DMSO 作用細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h 后，原頭節(jié)表現(xiàn)出不同程度的損害，合胞體帶結(jié)構(gòu)較空白對(duì)照組松散，并出現(xiàn)微毛排列紊亂（圖1C）。2.0%DMSO 組作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h后，頭節(jié)表面微毛紊亂，部分?jǐn)嗔巡⒚撀?，合胞體帶更疏松（圖1D）。

圖1 DMSO 作用后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化

3 討論

在實(shí)驗(yàn)研究中，許多藥物都需要有相關(guān)溶劑載體溶解后才能用于實(shí)驗(yàn)中，最常見的溶劑是水，但是脂溶性藥物或者水溶性較差的藥物就需要相關(guān)溶劑作為溶媒，DMSO 就是一種應(yīng)用廣泛且最常見的有機(jī)溶劑[1-2]。DMSO 無色黏稠，是一種既溶于水又溶于有機(jī)物的極為重要的非質(zhì)子極性溶劑，有“萬能溶媒之稱”，其作為各種細(xì)胞的低溫凍存保護(hù)劑、藥物溶劑而廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究[3-4]。

本研究結(jié)果中伊紅染色后倒置顯微鏡下觀察，0.1%～0.5%的DMSO 作用細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)后，細(xì)胞存活率變化不明顯，0.5%～1.0%的DMSO 作用后，隨濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降。有研究證實(shí)，對(duì)于細(xì)胞所能耐受的最大濃度為0.1%[5]，即在細(xì)胞培養(yǎng)過程中其在培養(yǎng)基中的終濃度小于0.1%時(shí)，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝，而濃度高于2.0%時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，有明顯的殺死細(xì)胞的作用。例如，有研究用不同濃度的DMSO 作用Min6 胰島細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其濃度＜0.125%時(shí)對(duì)Min6 細(xì)胞生長(zhǎng)周期及遺傳物質(zhì)的合成無明顯影響[6]，＞0.25%時(shí)對(duì)細(xì)胞的存活有抑制作用[7]。

但是不同的細(xì)胞所能耐受的濃度可能會(huì)存在差異，可能與細(xì)胞的類別相關(guān)。賀兵等[8]用不同濃度的DMSO 作用兔軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在0.1%～1.0%濃度范圍內(nèi)作用很小，產(chǎn)生的影響可以忽略。同樣有報(bào)道對(duì)于Hela 細(xì)胞，只有DMSO 的濃度與培養(yǎng)基體積比達(dá)到1∶1 時(shí)，才能到抑制細(xì)胞增殖的作用[9]。因此不同的細(xì)胞所能耐受的DMSO 的濃度不盡相同，因此在實(shí)驗(yàn)過程中DMSO 作為溶劑時(shí)所產(chǎn)生的影響是不能忽略的。

細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)是細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵寄生在人和羊等中間宿主體內(nèi)，感染機(jī)體器官后所產(chǎn)生的囊內(nèi)容物。其治療目前還是以手術(shù)為主[10-13]，但是對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者以及各種原因?qū)е碌臒o法手術(shù)療的病患，藥物治療即最終的選擇[14]。

肝包蟲的藥物治療是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[15]，因此有多種藥物及制劑被廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)及臨床研究中，所以隨之而來的問題就是溶媒的選擇，DMSO 在細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究中亦被廣泛應(yīng)用[16-18]，但是對(duì)于原頭節(jié)的最高耐受濃度沒有明確的研究，統(tǒng)一選擇細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)終濃度＜0.5%為安全范圍。

然而，細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)是一種多細(xì)胞原始微生物，所需的藥物劑量要高于單細(xì)胞生物。當(dāng)藥物溶解度較低、藥物劑量較大時(shí)可能達(dá)不到實(shí)驗(yàn)所需。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)不同濃度梯度的DMSO 作用原頭節(jié)。通過檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)而判斷不同濃度所產(chǎn)生的影響，確定一個(gè)相對(duì)安全的劑量范圍為肝包蟲藥物研究提供新支撐依據(jù)。

Caspase-3 為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子[19]，有研究發(fā)現(xiàn)DMSO 通過激活Caspase-3 而引起人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞凋亡[20]，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變判定細(xì)胞的凋亡仍然是最可靠的方式[21]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知DMSO 作用細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h 后，1.0%、2.0%DMSO 組的Capase-3 酶活性分別為（45.658±0.627）μmol/L 和（53.331±0.572）μmol/L，明顯高于對(duì)照組（8.275±0.617）μmol/L。有學(xué)者報(bào)道0.5%DMSO 作用細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h 后Capase-3 活力表達(dá)為（18.483±0.852）μmol/L 與本研究對(duì)照組中0.5%DMSO 組處理48 h 后Capase-3 活力表達(dá)值（19.903±0.562）μmol/L 結(jié)果對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）[22]。透射電鏡顯示高濃度組出現(xiàn)了微毛排列紊亂、減少、斷裂、脫落，合胞體帶疏松等細(xì)胞凋亡特征性改變[23-24]。

綜上所述，用不同濃度的DMSO 作用原頭節(jié)后的相關(guān)結(jié)果可知，在0.1%～0.5%的范圍內(nèi)與對(duì)照組原頭節(jié)無明顯變化，此范圍內(nèi)可忽略其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響。