周建松*吳若禹 簡(jiǎn)潔 蔣家俊李莎 李婉宜 周琳琳△

（1.貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，四川 成都 610000）

新型冠狀病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“新冠病毒”）屬于冠狀病毒科β屬冠狀病毒屬，是迄今為止被發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒中第7種可以使人類(lèi)致病的冠狀病毒，其全基因組包含近30000個(gè)核苷酸堿基，由14個(gè)蛋白編碼區(qū)域構(gòu)成[1]。自從2020年初2019冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行開(kāi)始以來(lái)，全世界已出現(xiàn)了一系列新冠病毒的變異株。2021年11月24日，南非首次向WHO報(bào)告了奧密克戎變異株感染病例，該變異株較其它變異株突變位點(diǎn)更多，且有更強(qiáng)的傳染性和免疫逃逸能力，在短時(shí)間內(nèi)迅速傳播至全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[2,3]。之后，奧密克戎變異株BA.1亞型迅速取代其他變異株成為優(yōu)勢(shì)流行毒株，并在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)傳播，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了明顯威脅。2021年底，在丹麥、南非和印度等國(guó)的感染患者中發(fā)現(xiàn)了奧密克戎的另一譜系BA.2[4]。

2022年2 月開(kāi)始，我國(guó)多地出現(xiàn)新冠病毒奧密克戎變異株引起的COVID-19疫情[5,6]。與其他新型冠狀病毒變異株相比，奧密克戎變異株引起重癥疾病的概率較低，癥狀以發(fā)燒、頭痛、流鼻涕、喉嚨痛等為主，但是奧密克戎變異株的傳播性更強(qiáng)[3]。SARS-CoV-2在流行傳播過(guò)程中，不斷出現(xiàn)傳播能力增強(qiáng)、抗體有效性降低及免疫逃避的新毒株，未來(lái)也將可能出現(xiàn)新的變異株，將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到新冠病毒感染的疫情防控當(dāng)中，從基因組水平上了解病毒的分子學(xué)特征，對(duì)疫情防控及準(zhǔn)確的研判具有重要意義[7]。

本研究對(duì)貴陽(yáng)市2022年9月一起由奧密克戎變異株引起的疫情中的6例無(wú)癥狀感染者鼻咽拭子樣本進(jìn)行新型冠狀病毒全基因組測(cè)序分析，為了解奧密克戎變異株的流行特征和進(jìn)化變異特點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

2022年8月31 日，貴陽(yáng)市在風(fēng)險(xiǎn)職業(yè)人群定期監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)1例新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果異常，截止9月29日24時(shí)，該輪疫情累計(jì)報(bào)告確診病例230例，無(wú)癥狀感染者1543例。本研究收集到該輪疫情中6例本土新型冠狀病毒無(wú)癥狀感染者，采集鼻咽拭子樣本，并收集相關(guān)流行病學(xué)資料。

1.2 核酸提取與新型冠狀病毒核酸檢測(cè)

采用核酸提取及純化試劑盒（上海伯杰，磁珠法），取樣本200μl于對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，使用全自動(dòng)磁珠核酸提取儀（上海伯杰）進(jìn)行核酸提取。利用新冠病毒核酸檢測(cè)試劑（上海伯杰）對(duì)所獲得的核酸進(jìn)行新型冠狀病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測(cè)。

1.3 全基因組文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)定

以提取的病毒 RNA 作為模板，使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來(lái)）、Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國(guó)）、Nextera XT Index Kit（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。（1）使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來(lái)）對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及全基因組擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮、純化；（2）使用Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國(guó)）和Nextera XT Index Kit（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行雙鏈DNA片段化和文庫(kù)構(gòu)建、純化及均一化；（3）采用Illumina Miseq 二代測(cè)序系統(tǒng)、Micro Miseq芯片及配套試劑（Illumina，美國(guó)）對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.4 全基因組序列拼接與比對(duì)

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的新型冠狀病毒 Wuhan-Hu-1（NCBI Reference Sequence：NC_045512.2）基因組作為參考序列，使用MicronCoV Analyzer分析軟件（北京微未來(lái)科技有限公司）進(jìn)行新型冠狀病毒全基因組序列拼接及核苷酸變異位點(diǎn)檢測(cè)。應(yīng)用Pangolin（https://pangolin.cog-uk.io/）和Nextclade（https://clades.neststrain.org/）在線(xiàn)分析平臺(tái)，判定病毒譜系及型別，分析病毒的變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 樣本信息及核酸檢測(cè)結(jié)果

由于該輪疫情傳播鏈條較為復(fù)雜，不能確認(rèn)感染源，存在多條傳播鏈，初步流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示6例新型冠狀病毒無(wú)癥狀感染者之間不存在直接流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。

6例感染者中，男2例，女4例；年齡最小10歲，最大68歲；在此次感染時(shí)，4例接種過(guò)新冠疫苗接種（均接種2劑及以上），2例未接種過(guò)新冠疫苗。經(jīng)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)，6份樣本Ct值均小于30，詳情見(jiàn)表1。

表1 新冠病毒奧密克戎變異株無(wú)癥狀感染者樣本信息

表2 基因組測(cè)序基本情況

2.2 基因組測(cè)序基本情況

本研究共獲得6條覆蓋度大于99%的新型冠狀病毒全基因組序列，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控合格，滿(mǎn)足分析要求，Nextclade分型結(jié)果顯示，6條均屬于21L型（Omicron）。Pangolin分型結(jié)果顯示（pangolin version：v 4.2），6條21L型（Omicron均屬于BA.2.76。

2.3 核苷酸及氨基酸變異分析

與新型冠狀病毒武漢株（NC_045512.2）相比，感染者1和4的新型冠狀病毒全基因組序列存在相同的76個(gè)核苷酸變異，分別為ORF1ab區(qū)25個(gè)（T670G，C1108T，C2790T，C3037T，G4184A，C4321T，C7528T，A9055G，C9344T，A9424G，C9534，C9866T，C10029T，C10198T，G10447A，C10449A，C12880T，C14408T，C15714T，C17410T，A18163G，G19009T，G19684T，C19955T，A20055G），S區(qū)30個(gè)（C21618T，G21987A，T22200G，T22304A，G22578A，G22599C，C22674T，T22679C，C22686T，A22688G，G22775A，A22786C，G22813T，T22882G，G22992A，C22995A，A23013C，A23040G，A23055G，A23063T，T23075C，A23403G，C23525T，T23599G，C23604A，C23854A，G23948T，A24424T，T24469A，C25000T），ORF3a區(qū)4個(gè)（C25416T，C25418A，C25584T，C26060T），E區(qū)1個(gè)（C26270T），M 區(qū)3個(gè)（C26577G，G26709A，C26858T），ORF6 區(qū)4個(gè)（A27259C，G27382C，A27383T，T27384C），ORF7區(qū)1個(gè)（C27807T），ORF8區(qū)1個(gè)（C27972T），N區(qū)5個(gè)（C28311T，G28881A，G28882A，G28883C，A29510C），非編碼區(qū)2個(gè)（C241T，A28271T）。

感染者2的新型冠狀病毒全基因組序列存在78個(gè)核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了2個(gè)突變位點(diǎn)（C44T、C7843T）。感染者3的新型冠狀病毒全基因組序列存在77個(gè)核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了1個(gè)突變位點(diǎn)（G26140T）。感染者5的新型冠狀病毒全基因組序列存在78個(gè)核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了2個(gè)突變位點(diǎn)（C44T、G25996T）；感染者6的新型冠狀病毒全基因組序列存在77個(gè)核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了1個(gè)突變位點(diǎn)（C1122T）。

與新型冠狀病毒武漢株（NC_045512.2）相比，感染者1、2、4的氨基酸變異位點(diǎn)為56個(gè)且完全相同，分別為E：T9I，M：Q19E、A63T，N：P13L、R203K、G204R、S413R，ORF1a：S135R、T842I、G1307S、L3027F、T3090I、L3201F、T3255I、P3395H，ORF1b：P314L、R1315C、I1566V、D1848Y、V2073L、T2163I，ORF3a：T9K、T223I，ORF6：D61L，ORF8：Q27，ORF9b：P10S，S：T19I、A27S、G142D、V213G、Y248N、G339D、R346T、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K。

感染者3的氨基酸變異位點(diǎn)為57個(gè)，與感染者1相比增加了1個(gè)突變位點(diǎn)（ORF3a: D250Y），感染者5的氨基酸變異位點(diǎn)為57個(gè)，與感染者1相比增加了1個(gè)突變位點(diǎn)（ORF3a:V202L），感染者6的氨基酸變異位點(diǎn)為57個(gè)，與感染者1相比增加了1個(gè)突變位點(diǎn)（ORF1a: P286L），詳見(jiàn)表3。

表3 位點(diǎn)變異情況

3 討論

新型冠狀病毒經(jīng)過(guò)在全球不同人群間突變進(jìn)化與新冠疫苗選擇壓力的雙重選擇下，已演變出多種不同的亞型或分支，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron及現(xiàn)目前主要流行的XBB系列變異株等[8,9]。截至目前，奧密克戎變異株是基因組突變數(shù)量最多的VOC（(Variants of concern，VOC)）。突變影響了其生物學(xué)特性，包括增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力和與宿主細(xì)胞受體的親和力，導(dǎo)致奧密克戎變異株具有更強(qiáng)的傳播性[4]。2021年11月11日，奧密克戎（BA.1）變異株首次在博茨瓦納被發(fā)現(xiàn)，隨后在丹麥、南非和印度等國(guó)的感染患者中發(fā)現(xiàn)了奧密克戎的另一譜系BA.2。研究表明，BA.2變異株的傳染性比BA.1變異株高30%，但不會(huì)引起更嚴(yán)重的疾病[10]。BA.2.76變異株屬于BA.2的第三個(gè)亞變體，于2022年7月首先由捷克報(bào)告，后續(xù)傳入印度、緬甸等多個(gè)國(guó)家，在我國(guó)四川、西藏、重慶等多地也引起了多起疫情[11]。由于本輪疫情傳播鏈復(fù)雜，且存在多條傳播鏈同時(shí)傳播的情況，無(wú)法通過(guò)分子溯源分析證實(shí)其是否存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。通過(guò)在全球新冠病毒數(shù)據(jù)庫(kù)GISAID中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本研究中6例樣本與同時(shí)期國(guó)內(nèi)西藏、青海、四川病毒序列高度同源。本研究6例樣本均來(lái)自無(wú)癥狀感染者，因無(wú)同時(shí)期其他病例新冠病毒全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，無(wú)法判斷無(wú)癥狀感染者樣本中BA.2.76變異株與有癥狀感染者樣本中BA.2.76變異株的變異區(qū)別，后續(xù)可進(jìn)行深入研究。

2023年5月5 日，世界衛(wèi)生組織宣布，新冠疫情不再構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，然而結(jié)束“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”并不意味著新冠疫情的結(jié)束，也并不意味著疫情危害就徹底沒(méi)有。隨著新冠病毒的不斷傳播及變異，仍需繼續(xù)做好新冠病毒的變異情況和疫情發(fā)生發(fā)展情況的監(jiān)測(cè)，做好預(yù)警和風(fēng)險(xiǎn)的研判工作，保障群眾健康。