李慧芳 滕子文 范銀君 李津洋 萬(wàn)方浩 周忠實(shí) 周洪旭

摘要：【目的】明確不同蘋果品種漆酶基因在抗蘋果綿蚜過(guò)程中的差異表達(dá)模式，探索原核表達(dá)蘋果漆酶蛋白的方法與條件?！痉椒ā炕谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序分析抗蚜品種新紅星（Starkrimson）、小國(guó)光（Ralls Genet）與感蚜品種紅富士（Red Fuji）3個(gè)蘋果品種被蘋果綿蚜為害0 h、12 h、5 d 后漆酶基因的表達(dá)模式，篩選抗蚜候選漆酶基因；選擇pET-28a（+）、pET-32a（+）、pGEX-TEV、pHAT2 4 種載體，對(duì)4 個(gè)漆酶基因MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2 進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-Blot 驗(yàn)證，鎳柱親和層析純化，以ABTS為底物分析其酶活性。【結(jié)果】與對(duì)照相比，不同蘋果品種被害12 h、5 d后，蘋果枝條中漆酶差異表達(dá)基因數(shù)量為27 個(gè)。不同蘋果品種的漆酶基因表達(dá)模式存在差異，抗蚜品種新紅星及小國(guó)光漆酶差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)居多，感蚜品種紅富士下調(diào)表達(dá)居多，新紅星12 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，無(wú)下調(diào)表達(dá)基因；小國(guó)光9個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；紅富士10個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。其中新紅星特有的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為6 個(gè)，小國(guó)光特有的上調(diào)表達(dá)基因?yàn)? 個(gè)，紅富士特有的下調(diào)表達(dá)基因?yàn)? 個(gè)。在16 ℃、0.5 mmol·L-1IPTG，220 r ·min-1誘導(dǎo)24 h 的條件下，MdLac23、MdLac2 漆酶基因在pET-28a（+） 載體上清液中成功表達(dá)蛋白，Western-Blot 檢測(cè)到清晰目的蛋白條帶，與對(duì)照相比均未發(fā)現(xiàn)其催化活性。利用pET-32a（+）、pGEX-TEV、pHAT2 載體均未在上清液中誘導(dǎo)出目的重組蛋白?！窘Y(jié)論】明確了不同蘋果品種漆酶基因的表達(dá)模式以及原核表達(dá)所需表達(dá)載體與條件，為進(jìn)一步探索不同蘋果品種漆酶抗蚜基因及其蛋白功能奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蘋果綿蚜；蘋果品種；漆酶；原核表達(dá)；抗蟲防御

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）06-1202-13

中國(guó)是世界上蘋果屬植物最豐富的國(guó)家，作為蘋果起源地之一，蘋果種植面積不斷擴(kuò)大，目前已成為全球最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)[1]。蘋果綿蚜[Eriosomalanigerum（Hausmann）]，屬半翅目癭綿蚜科，是以蘋果屬植物為主要寄主的入侵害蟲，對(duì)北方蘋果產(chǎn)業(yè)構(gòu)成巨大危害[2-3]，多在新梢芽腋、枝干裂縫、根蘗基部處危害，其典型危害特征是寄主受害部位覆蓋白色棉絮狀物、形成腫瘤，難以防治[4]。研究顯示，生產(chǎn)中主栽品種紅富士高感蘋果綿蚜，新紅星、小國(guó)光具有一定抗性[5-8]。Zhou等[9]基于EPG刺吸電位技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蘋果綿蚜取食韌皮部階段，在抗蚜品種新紅星和小國(guó)光上需要多量、多次分泌唾液才可保證其順利吸食；非韌皮部取食階段，在新紅星和小國(guó)光上第一次刺探開始時(shí)間和非穿透波的總時(shí)間顯著多于紅富士，推測(cè)兩抗蚜品種中可能存在影響蘋果綿蚜口針刺探的物理或化學(xué)抗性因子。

次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素在被子植物中主要由愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G）、紫丁香基木質(zhì)素（S）和對(duì)羥基木質(zhì)素（H）組成，參與細(xì)胞壁的形成，并與纖維素一起增加細(xì)胞硬度[10]，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[11]。研究證明木質(zhì)素與植物抗病蟲有密切聯(lián)系，An等[12]研究發(fā)現(xiàn)菊花木質(zhì)素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞壁增厚、木質(zhì)化而提高了機(jī)械強(qiáng)度，從而阻止蚜蟲取食。漆酶EC.1.10.3.2（laccase，LAC）是一種含銅的糖蛋白氧化酶，一般具有4 個(gè)銅離子，均形成其催化位點(diǎn)，并包含3 個(gè)銅氧化酶蛋白結(jié)構(gòu)域（Cu-oxidase、Cu-oxidase2、Cu-oxidase 3）[13-14]。在高等植物中，漆酶參與木質(zhì)素合成通路中催化單分子醇聚合的最后一步[15]。此外，漆酶還參與植物的防御過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)小麥漆酶基因TaLAC4 能夠通過(guò)增加G-木質(zhì)素合成，使細(xì)胞壁增厚而抵抗小麥赤霉病菌的侵染[16]；GhLac1 在棉花中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，從而抵御棉鈴蟲和棉蚜的取食[17]，可見(jiàn)漆酶基因在植物抗病蟲中起著重要作用。

目前蘋果漆酶的研究未見(jiàn)報(bào)道，筆者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析蘋果漆酶基因在蘋果綿蚜脅迫壓力下的表達(dá)模式，基于漆酶基因的保守結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌O果品種漆酶差異基因進(jìn)行鑒定，初步篩選出抗蘋果綿蚜漆酶候選基因，并對(duì)原核表達(dá)所用載體及表達(dá)條件進(jìn)行研究，為深入了解蘋果漆酶基因的抗蚜功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker、Escherichia coliBL21（DE3）菌株購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。原核表達(dá)載體pET-28a（+）、pET-32a（+）、pGEXTEV、pHAT2 由本實(shí)驗(yàn)室保存。PUC19-EGFP 質(zhì)粒干粉購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)。酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID。漆酶檢測(cè)活性試劑盒、瓊脂粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。E. coli DH5α、DNA聚合酶、DNA連接酶（ClonExpress? Ⅱ One Step Cloning Kit）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。DNA合成、異丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）、抗His 標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司，其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 不同蘋果品種被蘋果綿蚜危害前后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

蘋果綿蚜在（23±2）℃、14 h 光照、10 h 黑暗、相對(duì)濕度60%～80%的溫室中用剝離成熟蘋果種子內(nèi)外種皮法[18]獲得的蘋果幼苗進(jìn)行繁殖。蘋果試驗(yàn)苗木（Malus domestica）栽植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)果樹基地（120.11° E，36.44° N），其砧木為海棠（M. spectabilis）。于2019 年5 月隨機(jī)選取1 年生健康植株新紅星（Starkrimson，SM）、小國(guó)光（RallsGenet，RG）、紅富士（Red Fuji，RF）3 種蘋果品種，在距頂芽8～10 cm處每株接種蘋果綿蚜40 頭，在植物對(duì)蘋果綿蚜的應(yīng)激反應(yīng)早期（12 h）[19]和蘋果綿蚜在蘋果苗木上的種群定殖期（5 d）[20]采集被蘋果綿蚜為害6 cm左右的蘋果枝條樣本，取未接種蘋果綿蚜的抗蚜、感蚜蘋果品種作為對(duì)照，每組處理均3 次生物學(xué)重復(fù)，共采集27 個(gè)樣本。樣本采集后迅速在液氮中冷凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ缮虾W易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 蘋果LAC基因的篩選與鑒定

以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot（https：//www.uniprot.org/）下載的擬南芥（Arabidopsis thaliana）漆酶蛋白為檢索序列，通過(guò)Blastp 在蘋果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列中比對(duì)匹配的蛋白序列，篩選出E-value＜1e-5 的候選基因，刪除冗余序列后將其蛋白序列通過(guò)NCBICDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)漆酶蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定基因；基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析新紅星、小國(guó)光及紅富士被蘋果綿蚜為害0 h（對(duì)照，ctr）、12 h、5 d 漆酶差異表達(dá)基因及其表達(dá)模式。組間差異表達(dá)分析，以p-value＜0.05、Fold Change＞2作為判斷基因表達(dá)差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。使用TBtools軟件制作結(jié)構(gòu)域直觀圖與基因表達(dá)模式熱圖[21]。

1.4 蘋果LAC基因的克隆

基于漆酶基因表達(dá)量及其在抗蚜、感蚜蘋果品種的表達(dá)模式，選擇了3 類漆酶基因，即在抗蚜品種新紅星、小國(guó)光中均上調(diào)表達(dá)的MdLac23 基因，新紅星特有的上調(diào)表達(dá)基因MdLac6、MdLac7，小國(guó)光特有的上調(diào)表達(dá)基因MdLac2 進(jìn)行序列克隆。利用4 種原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）、pET-32a（+）、pGEXTEV、pHAT2 構(gòu)建目的蛋白表達(dá)載體。根據(jù)蘋果漆酶mRNA序列，去除信號(hào)肽序列后，利用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（下劃線部分為酶切位點(diǎn)序列，下劃線前的堿基為線性化載體兩末端同源序列）。為方便構(gòu)建目的DNA質(zhì)粒，插入片段擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式為：上游/下游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)+基因特異性正向/反向擴(kuò)增引物序列（表1，表2）。以蘋果苗木中獲得的cDNA 為模板，采用PCR擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)編碼序列（CDS）。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，各基因退火溫度分別為MdLac23 59.7 ℃、MdLac6 53 ℃、MdLac7 及MdLac2 56.7 ℃，退火20 s，72 ℃延伸3 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的條帶。

1.5 重組蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用內(nèi)切酶消化pET- 28a（+ ）、pET- 32a（+ ）、????? pGEX-TEV、pHAT2，雙酶切使載體線性化，凝膠回收后，參照南京諾唯贊一步克隆試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行同源重組反應(yīng)。線性化載體和插入的目的片段按照0.03 pmol∶0.06 pmol 比例，37 ℃條件下連接2 h。連接產(chǎn)物用熱激法導(dǎo)入感受態(tài)DH5α，獲得陽(yáng)性克隆后繼續(xù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將未連接目的片段的pET-28a（+）、pET-32a（+）、pGEX-TEV、pHAT2 質(zhì)粒也轉(zhuǎn)入E. coliBL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得重組表達(dá)菌株和對(duì)照表達(dá)菌株。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、Western-Blot檢測(cè)

將20 個(gè)重組蛋白表達(dá)菌株按1∶50 比例轉(zhuǎn)接至15 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r · min-1 震蕩培養(yǎng)至OD600 為0.7～0.8，加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol · L- 1，16 ℃、220 r · min- 1 誘導(dǎo)24 h，以不加IPTG的菌液作為陰性對(duì)照。收集菌體，加入PBS重懸后進(jìn)行超聲波破碎，分別取IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的上清液、沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（5%濃縮膠和10%分離膠），Western-Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。Western-Blot 后續(xù)步驟如下：將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，使用His 標(biāo)簽單克隆抗體搖床孵育1 h，1×TBST緩沖液洗滌5 次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG抗體室溫孵育50 min，1×TBST 緩沖液洗滌5 次，最后使用ECL 發(fā)光試劑顯影。

1.7 重組蛋白的純化及活性鑒定

將構(gòu)建的pET- 28a（+ ）-MdLac23、pET- 28a（+ ）-MdLac2 原核表達(dá)載體按上述誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)（1200 mL），以pET-28a（+）-EGFP重組載體作為對(duì)照，通過(guò)超聲波破碎，離心后取上清液，參照康為世紀(jì)的His-Tagged Protein Purification Kit （Soluble Protein）說(shuō)明書，過(guò)Ni2 +親和柱對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。純化的蛋白洗脫液，使用截留分子質(zhì)量為30 ku的超濾管進(jìn)行適當(dāng)濃縮和脫鹽，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)各樣品純度。采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)。按北京索萊寶漆酶檢測(cè)活性試劑盒測(cè)定表達(dá)蛋白的活性，以ABTS[2， 2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]為底物，測(cè)定420 nm下42 ℃反應(yīng)3 min 前后的吸光度值。酶活定義為：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol 底物ABTS所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位。漆酶酶活性（U·mg-1）=ΔA ÷（ε ×d）×V 反總× 109 ÷（V 樣×cpr）÷T。其中ΔA 測(cè)定管= A2 測(cè)定-A1 測(cè)定，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管；A1 為反應(yīng)3 min 前初始吸光值；A2 為反應(yīng)3 min 后吸光值；ε 為ABTS 摩爾消光系數(shù)，36 000 L · mol- 1 · cm- 1；d 為96 孔板光徑，0.6 cm；V反總為反應(yīng)總體積，2 × 10-4 L；V樣為反應(yīng)中樣本體積，0.03 mL；cpr為樣本蛋白質(zhì)量濃度，mg·mL-1；T 為反應(yīng)時(shí)間，3 min；109 為單位換算系數(shù)，1 mol=109 nmol。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果LAC差異表達(dá)基因的鑒定

對(duì)LAC 差異表達(dá)基因保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果如圖1 所示。共鑒定出27 個(gè)LAC差異表達(dá)基因，其中MD10G1042700（MdLac25）僅含有Cu-oxidase 3???????????????????????????? 結(jié)構(gòu)域，MD10G1042600（MdLac24）僅含有Cu-oxidase2 結(jié)構(gòu)域，其他25 個(gè)基因均具有典型漆酶的3個(gè)特征結(jié)構(gòu)域（Cu- oxidase、Cu- oxidase 2、Cu- oxidase3）。27 個(gè)漆酶基因的簡(jiǎn)稱如表3 所示。

2.2 LAC基因在不同蘋果品種差異中的表達(dá)

同一品種不同時(shí)間點(diǎn)分別與對(duì)照相比，抗蚜品種新紅星（SM）、小國(guó)光（RG）和感蚜品種紅富士（RF）被蘋果綿蚜為害前后（ctr、12 h、5 d）漆酶差異表達(dá)基因數(shù)量為27個(gè)，其表達(dá)模式如圖2所示。根據(jù)漆酶基因在不同蘋果品種中的差異表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示，新紅星12 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，無(wú)下調(diào)表達(dá)基因；小國(guó)光9 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，3 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；紅富士10個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，4個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。其中，MdLac20、MdLac21、MdLac22 在3 個(gè)蘋果品種均上調(diào)表達(dá)；MdLac23 僅在新紅星、小國(guó)光中上調(diào)表達(dá)；MdLac24、MdLac25 在新紅星中上調(diào)表達(dá)，小國(guó)光中下調(diào)表達(dá)；MdLac26 在小國(guó)光和紅富士中上調(diào)表達(dá)；MdLac27在小國(guó)光和紅富士中下調(diào)表達(dá)，其余差異表達(dá)基因均在各品種中表現(xiàn)出特有的上下調(diào)表達(dá)。

綜上可見(jiàn)，不同蘋果品種漆酶基因表現(xiàn)出明顯的差異表達(dá)模式。抗蚜品種新紅星及小國(guó)光漆酶差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)居多，感蚜品種紅富士下調(diào)表達(dá)居多。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2 4 個(gè)LAC基因全長(zhǎng)分別為1659、1743、1644、1665 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在靠近2000 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期目的片段大小一致（圖3）。原核表達(dá)載體pET-28a（+）、pET-32a（+）的質(zhì)粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，pGEX-TEV、pHAT2 質(zhì)粒使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，各質(zhì)粒雙酶切線性化長(zhǎng)度分別為5322、5854、4386、5027 bp（圖4）。將PCR 產(chǎn)物及線性化質(zhì)粒純化后經(jīng)DNA連接酶進(jìn)行連接，最終獲得測(cè)序正確的大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株單菌落，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 重組蛋白Western-Blot檢測(cè)

Western-Blot 結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a（+）-MdLac23、pET-28a（+）-MdLac2 重組蛋白表達(dá)菌株各抽提液（上清液、沉淀）在大約70 ku（含標(biāo)簽大小）處出現(xiàn)了目的重組蛋白，與理論預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小相符合，而pET-28a（+）對(duì)照組的各抽提液均沒(méi)有條帶，表明其重組蛋白在pET-28a（+）16 ℃誘導(dǎo)系統(tǒng)成功表達(dá)，且有可溶性蛋白的表達(dá)，重組表達(dá)菌株在沉淀抽提液明顯亮于上清抽提液（圖5-A）；pET-32a（+）-MdLac7、pET-32a（+）-MdLac2大約在70 ku 處也出現(xiàn)了清晰的目的蛋白表達(dá)條帶，與理論預(yù)測(cè)值相符合，以包涵體的形式存在，而pET-32a（+）對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)目的蛋白表達(dá)條帶（圖5-B）；pGEX-TEV、pHAT2 原核表達(dá)載體中均無(wú)目的蛋白表達(dá)條帶（圖5-C～D）。

2.5 重組蛋白的純化及其體外催化活性測(cè)定

SDS- PAGE 電泳顯示pET- 28a（+ ）-MdLac23、pET-28a（+）-MdLac2、pET-28a（+）-EGFP 成功純化出重組蛋白（圖6-A～B）。BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7，獲得標(biāo)準(zhǔn)方程y = 21.704x + 0.511 4，R? = 0.993 4，計(jì)算獲得MdLac23、MdLac2 純化后蛋白質(zhì)量濃度分別為0.011 2 μg·μL-1、0.012 6 μg·μL-1，EGFP蛋白質(zhì)量濃度為0.013 8 μg · μL- 1。以ABTS 為底物測(cè)定EGFP、MdLac23、MdLac2 純化蛋白的活性，分別為408 U·mg-1、427 U·mg-1 、433 U·mg-1 ，與對(duì)照EGFP相比，MdLac23、MdLac2 蛋白均無(wú)活性（圖8）。

3 討論

漆酶作為植物次生細(xì)胞壁形成過(guò)程中木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶，是催化木質(zhì)素單體聚合的最后一步。含有3 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Cu-oxidase、Cu-oxidase 2、Cu-oxidase 3，這是大多數(shù)植物漆酶基因的典型特征，例如梨（Pyrus bretschneideri）含有41 個(gè)漆酶基因[22]、高粱（Sorghum bicolor）含有27 個(gè)漆酶基因[23]，這些漆酶基因均包含3 個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，屬于典型的多銅氧化酶。但也有一些漆酶基因含有一個(gè)或兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，例如柑橘（Citrus sinensis）漆酶基因Cs-LAC1-02 僅含有Cu-oxidase 和Cu-oxidase 2 結(jié)構(gòu)域，CsLAC13 和CsLAC19 僅含有Cu- oxidas 3 結(jié)構(gòu)域[15]。筆者在本研究共鑒定出的27 個(gè)蘋果漆酶抗蚜候選基因中，MdLac25、MdLac24 基因分別只含有1 個(gè)Cu-oxidase 3 結(jié)構(gòu)域、Cu-oxidase 2 結(jié)構(gòu)域，其余25 個(gè)漆酶基因均具有Cu-oxidase、Cu-oxidase 2、Cuoxidase3 保守結(jié)構(gòu)域，這與上述柑橘漆酶基因的鑒定結(jié)果一致。

在脅迫壓力下，基因表達(dá)變化是植物防御反應(yīng)的根本[24]。大豆（Glycine max）感染疫霉后，9 個(gè)漆酶基因表達(dá)量上調(diào)，12 個(gè)漆酶基因表達(dá)水平被抑制[25]；當(dāng)茶樹（Camellia sinensis）受到食草昆蟲為害后，同樣也引起CsLACs 基因表達(dá)量的變化[13]。近年來(lái)，許多研究數(shù)據(jù)表明植物漆酶基因在生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在白楊（Populus tomentosa）中，PtoLAC14 的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了楊樹的木質(zhì)化，證實(shí)了漆酶參與木質(zhì)素的生物合成[26]。棉花（Gossypiumhirsutum）GhLac1 的過(guò)表達(dá)加速了細(xì)胞壁的再生，木質(zhì)素含量增加，增強(qiáng)了對(duì)棉蚜的抗性；而RNAi 后植株木質(zhì)素減少，更易感染棉蚜[17]。愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G）作為木質(zhì)素的一種，其交聯(lián)性強(qiáng)，耐解聚，當(dāng)棉花被大麗輪枝菌侵染后，GhLAC15 在抗性棉花品種Jimian20 中的表達(dá)水平高于敏感品種Han208；同樣通過(guò)表達(dá)或抑制GhLAC15 的轉(zhuǎn)錄水平，能夠?qū)е掠鷦?chuàng)木基木質(zhì)素（G）含量的增加和降低，進(jìn)而調(diào)節(jié)了對(duì)黃萎病的抗性[27]，可見(jiàn)漆酶基因的上調(diào)表達(dá)，有利于增強(qiáng)植株對(duì)病蟲害的抵御能力。本研究中，不同蘋果品種受到蘋果綿蚜刺吸為害后，抗蚜品種新紅星、小國(guó)光中漆酶基因呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式，基因上調(diào)表達(dá)居多。新紅星中12個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，無(wú)下調(diào)表達(dá)基因；小國(guó)光中9 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，3 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，眾多的上調(diào)表達(dá)基因調(diào)控了相應(yīng)的代謝通路，增強(qiáng)了對(duì)蘋果綿蚜的抗性，這可能是蘋果品種抗性增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。感蚜品種紅富士中的漆酶基因，僅4 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，10 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，與抗性蘋果品種相比整體表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，因而紅富士品種中的漆酶基因易感蘋果綿蚜。漆酶基因在不同蘋果品種中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，這表明漆酶基因在植物抗蚜反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

基因體外表達(dá)是研究其功能的重要方法，目前對(duì)植物漆酶基因體外表達(dá)的研究不多。有研究顯示，梨漆酶基因PbLAC4-like 在pET-28a（+） 28 ℃誘導(dǎo)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)出62.6 ku 的可溶性蛋白[28]；水稻漆酶基因OsLAC10 通過(guò)pET-30a 原核表達(dá)載體，37 ℃誘導(dǎo)條件下，在沉淀中產(chǎn)生了66 ku 的重組蛋白條帶[29]。原核表達(dá)系統(tǒng)為研究蛋白表達(dá)和功能提供了一條有效途徑，但外源基因的表達(dá)還受諸多因素影響，如目的蛋白特性、原核表達(dá)載體類型、誘導(dǎo)條件等。較低的誘導(dǎo)溫度有利于產(chǎn)生折疊的可溶性蛋白質(zhì)[30]，因此，筆者在本研究中用較低溫度16 ℃誘導(dǎo)，且從4 種不同的原核表達(dá)載體出發(fā)嘗試表達(dá)。結(jié)果顯示，不同的原核表達(dá)載體對(duì)漆酶蛋白的表達(dá)影響顯著，漆酶蛋白的表達(dá)主要以不溶性包涵體形式存在，pET-28a（+）載體誘導(dǎo)出了MdLac23、MdLac2 的可溶性蛋白；pET-32a（+）中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的MdLac7、MdLac2 蛋白只在沉淀中存在；pGEX -TEV、pHAT2 原核表達(dá)載體中，Md-Lac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2 蛋白均無(wú)法表達(dá)。本研究中蘋果漆酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)活性，在遺傳背景方面，原核表達(dá)系統(tǒng)因缺少稀有密碼子，可能導(dǎo)致較低的表達(dá)水平，且蛋白分子質(zhì)量越大，大腸桿菌中可溶性表達(dá)的概率隨之降低，特別是對(duì)于大于60 ku 的蛋白質(zhì)[30]，加之不具備活性所需的真核翻譯后修飾[31]，而漆酶作為一種高糖基化修飾的酶[32]，重組蛋白未經(jīng)糖基化或空間修飾，推測(cè)以上情況可能是導(dǎo)致漆酶活性喪失的原因。

綜上所述，筆者在本研究中分析了不同蘋果品種漆酶基因抗蘋果綿蚜的表達(dá)模式，克隆了蘋果LAC 基因序列，通過(guò)原核表達(dá)獲得了漆酶蛋白，進(jìn)一步檢測(cè)了漆酶活性。由于原核表達(dá)系統(tǒng)不足以獲得大量可溶性蛋白，表達(dá)的蛋白無(wú)活性，下一步還可嘗試在酵母細(xì)胞、絲狀真菌、植物、昆蟲細(xì)胞中等進(jìn)行漆酶表達(dá)純化的研究，還需大量試驗(yàn)去探索漆酶蛋白的功能、作用機(jī)制等一系列問(wèn)題。

4 結(jié)論

該研究分別從轉(zhuǎn)錄組及不同原核表達(dá)載體分析不同蘋果品種潛在的抗蘋果綿蚜基因，篩選漆酶表達(dá)載體。不同蘋果品種被蘋果綿蚜為害0 h、12 h、5 d的轉(zhuǎn)錄組分析中，共鑒定獲得27 個(gè)漆酶差異表達(dá)基因，為潛在的抗蘋果綿蚜基因，各品種漆酶基因的表達(dá)模式為抗蚜品種新紅星、小國(guó)光，上調(diào)表達(dá)居多，感蚜品種紅富士下調(diào)表達(dá)居多?？寺〉?em>MdLac23、Md-Lac6、MdLac7、MdLac2 4個(gè)漆酶基因，在pET-28a（+）、pET -32a（+ ）、pGEX -TEV、pHAT2 原核表達(dá)載體，16 ℃，220 r ·min-1，IPTG 終濃度0.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)24 h 的條件下，16 個(gè)原核表達(dá)重組構(gòu)建體，僅Md-Lac23、MdLac2 在pET-28a（+）載體中成功表達(dá)出可溶性蛋白，經(jīng)檢測(cè)無(wú)酶催化活性。本研究為進(jìn)一步探究蘋果漆酶基因在抗蘋果綿蚜中的作用、研究其功能蛋白奠定了基礎(chǔ)。

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