吳 錦,李嘉嘉,王笑薇,王 娟

腹膜透析是臨床治療終末期腎臟疾病的常用方法,但長(zhǎng)期透析會(huì)引起腹膜纖維化,致使患者退出治療[1]。高糖刺激導(dǎo)致的腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)沉積,是腹膜纖維化的病理變化之一[2]。腹膜間皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是腹膜纖維化的早期機(jī)制,有效抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT對(duì)維持腹膜透析極為重要[3]。研究[4]表明,E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,ZNRF3)能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞EMT過(guò)程,調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá),在其遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。

miRNA是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,能靶向mRNA調(diào)控基因表達(dá),參與多種病理生理過(guò)程。Pellegrini et al[5]證明miR-146b-5p在腎損傷和纖維化進(jìn)展的不同階段呈差異表達(dá)。同時(shí),miR-146b-5p能靶向ZNRF3促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,并增強(qiáng)其耐藥性[6]。但miR-146b-5p與ZNRF3在腹膜纖維化中的作用和機(jī)制尚不清楚。因此,該研究通過(guò)高糖誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠腹膜纖維化動(dòng)物和細(xì)胞模型,探討miR-146b-5p對(duì)其EMT進(jìn)程的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡C57BL/6J小鼠12只,體質(zhì)量約20 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,在22～26 ℃、50%～60%的相對(duì)濕度,人工光照明暗各12 h環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2018-0104。

1.1.2主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉鹽、葡萄糖購(gòu)自Sigma公司;4.25%腹膜透析液購(gòu)自成都青山利康公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購(gòu)自阿拉丁公司;胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;青鏈霉素混合液、CCK-8、RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DAB濃縮型試劑盒、封閉山羊血清購(gòu)自Solarbio公司;PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司;蘇木精購(gòu)自雷根生物公司;兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(PAB46194)、兔抗上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)抗體(PAB33542)、兔抗波形蛋白(Vimentin)抗體(PAB40605)和兔抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(PAB33543)購(gòu)自Bioswamp公司;兔抗ZNRF3抗體(NBP3-03924)購(gòu)自Novus公司;兔抗I型膠原(type I collagen,COL I)抗體(ab87913)購(gòu)自Abcam公司;MaxVision二抗(KIT-5020)購(gòu)自邁新公司;TRIzol購(gòu)自Ambion公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司;Transwell小室購(gòu)自Corning公司;Matrigel膠購(gòu)自BD公司。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(型號(hào):Tanon-5200)購(gòu)自上海天能公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):MK3)購(gòu)自芬蘭雷勃公司;PCR儀(型號(hào):GE48527)購(gòu)自杭州柏恒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型構(gòu)建及分組處理 12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組6只。參考文獻(xiàn)[7]方法構(gòu)建腹膜纖維化小鼠模型,模型組小鼠腹腔注射4.25%葡萄糖透析液,每天100 ml/kg,持續(xù)4周,腹腔注射LPS,每天0.1 mg/kg,持續(xù)1周。對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取腹膜組織保存?zhèn)溆谩asson染色觀察腹膜組織膠原纖維變化,免疫組化檢測(cè)α-SMA和COL I表達(dá),Western blot檢測(cè)腹膜組織E-cadherin、α-SMA和COL I蛋白表達(dá)驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功。

1.2.2免疫組化檢測(cè) 取對(duì)照組和模型組小鼠腹膜組織按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋,冷凍后切片,貼附于載玻片上烤片1 h。二甲苯浸泡,梯度乙醇溶液浸泡,1 mmol/L的Tris-EDTA緩沖溶液中高壓修復(fù)18 min,置于3%H2O2中濕盒孵育10 min,10%山羊血清濕盒孵育30 min,滴加α-SMA和COL I一抗(1 ∶50),濕盒孵育,4 ℃過(guò)夜,滴加 maxvision二抗,37 ℃孵育60 min。DAB和蘇木精染色,乙醇溶液浸泡脫水,二甲苯中透明,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡拍照。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè) TRIzol提取腹膜組織樣本總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,cDNA模板1 μl,ddH2O 8 μl。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s;56 ℃ 10 s;72 ℃ 25 s;共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1,由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。反應(yīng)結(jié)束后獲取CT值,采用2-ΔΔCT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4小鼠腹膜間皮細(xì)胞原代分離 參考文獻(xiàn)[8]方法,無(wú)菌環(huán)境下取上述對(duì)照組小鼠大網(wǎng)膜,PBS漂洗3次,用含0.25%胰蛋白酶的PBS消化25 min后棄去消化液,加入含100 U/ml的青鏈霉素及15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化,15 min后移入離心管,4 ℃下800 r/min離心5 min。棄上清液,用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),72 h后換液,然后每2～3 d換液1次。

1.2.5CCK-8檢測(cè) 收集上述小鼠腹膜間皮細(xì)胞于96孔板,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×103個(gè)/孔,每孔100 μl,培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度葡萄糖處理組(分別用含1%、2%、4%、6%、8%、10%葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞),培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)4 h。450 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值,選擇與對(duì)照組相比,增殖率下降最顯著的最低葡糖糖濃度用于后續(xù)的造模實(shí)驗(yàn)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 根據(jù)ZNRF3-3′ UTR野生型基因序列(5′-3′)為:GCTAGCGTGTGCTTGGGGTTCCGAGGTGTGGGATTGAGTTCTCTGCTTT-GTTTTTTTTTAAGATATTGTATGTCTAGA,ZNRF3-3′ UTR突變型對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變,將ZNRF3-3′ UTR中堿基AGTTCTC突變?yōu)镚ACCAGA。構(gòu)建含有miR-146b-5p結(jié)合位點(diǎn)的ZNRF3-3′ UTR野生型及突變型報(bào)告基因載體,進(jìn)行酶切回收,連接目的基因片段與線性化載體,提取質(zhì)粒DNA,測(cè)序。在小鼠腹膜間皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimic,然后分別轉(zhuǎn)染野生型及突變型報(bào)告基因載體;另一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic-NC質(zhì)粒,再分別轉(zhuǎn)染ZNRF3-3′ UTR野生型及突變型載體,24 h按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.7細(xì)胞分組與處理 將小鼠腹膜間皮細(xì)胞分為5組:對(duì)照組、模型組、mimic-NC組、miR-146b-5p-mimic組和miR-146b-5p-inhibitor組。將正常培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞作為對(duì)照組,模型組用含6%葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。構(gòu)建miR-146b-5p-mimic NC質(zhì)粒、mimic質(zhì)粒、inhibitor質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細(xì)胞纖維化模型,24 h后收集各組細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8Western blot檢測(cè) 收集各組約1×106個(gè)細(xì)胞,加裂解液裂解細(xì)胞,12 000 r/min離心10 min,取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。通過(guò)SDS-PSGE電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜,加一抗(E-cadherin、ZNRF3、Vimentin、N-cadherin,1 ∶1 000)室溫孵育1 h,洗膜,加HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)室溫孵育1 h,洗膜,ECL發(fā)光液顯影,TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.2.9Transwell小室檢測(cè) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×102/L,取0.5 ml接種至Transwell小室內(nèi)。下層24孔板加0.75 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗,每孔加4%甲醛室溫固定20 min。PBS洗滌,加0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min,用棉簽擦去Transwell小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞,置于200×顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):接種前在小室中鋪80 μl Matrigel膠,37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min。其余實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定如圖1A所示,對(duì)照組小鼠腹膜組織薄,呈連續(xù)分布;模型組小鼠腹膜組織明顯增厚,膠原纖維明顯增多。如圖1B所示,模型組中,主要集中于腹膜組織中血管的管壁的α-SMA和間皮基質(zhì)中的COL I陽(yáng)性表達(dá)明顯增多。

圖1 腹膜纖維化小鼠模型鑒定A:腹膜組織Masson染色 ×200;B:腹膜組織COL I和α-SMA免疫組化染色 ×200

2.2 腹膜纖維化小鼠模型中miR-146b-5p、ZNRF、COL I及α-SMA表達(dá)如圖2A所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠腹膜組織中E-cadherin表達(dá)降低(F=286.63),COL I(F=390.47)及α-SMA(F=663.10)表達(dá)升高(P<0.05)。如圖2B所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠腹膜組織中miR-146b-5p表達(dá)升高(F=405.66,P<0.05),ZNRF3表達(dá)降低(F=625.33,P<0.05)。

圖2 miR-146b-5p和ZNRF3在腹膜纖維化小鼠模型中的表達(dá)

2.3 miR-146b-5p靶向負(fù)調(diào)控ZNRF3表達(dá)如圖3A所示,miR-146b-5p與ZNRF3存在結(jié)合位點(diǎn)。如圖3B所示,與mimic-NC組相比,miR-146b-5p mimic可降低ZNRF3野生型3′-UTR熒光素酶活性(F=279.53,P<0.05),而ZNRF3突變型3′-UTR熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)。如圖3C所示,與對(duì)照組相比,模型組和mimic-NC組ZNRF3表達(dá)降低。與mimic-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimic的小鼠腹膜間皮細(xì)胞中ZNRF3表達(dá)降低,轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitor的小鼠腹膜間皮細(xì)胞中ZNRF3表達(dá)升高。

圖3 miR-146b-5p靶向負(fù)調(diào)控ZNRF3表達(dá)

2.4 高糖誘導(dǎo)小鼠腹膜間皮細(xì)胞纖維化并抑制ZNRF3表達(dá)如圖4A所示,與對(duì)照組相比,不同濃度(1%、2%、4%、6%、8%、10%)葡萄糖處理的小鼠腹膜間皮細(xì)胞增殖活性降低(F=446.47,P<0.05),且呈劑量依賴性,其中含6%的葡萄糖培養(yǎng)液處理后,細(xì)胞增殖活力下降17.17%,因此,選擇6%的葡萄糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖4B、4C所示,E-cadherin和ZNRF3表達(dá)也降低(F=220.72、246.33,P<0.05)。

圖4 高糖誘導(dǎo)小鼠腹膜間皮細(xì)胞纖維化并抑制ZNRF3表達(dá)

2.5 過(guò)表達(dá)miR-146b-5p促進(jìn)小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲如圖5所示,與對(duì)照組相比,模型組與mimic-NC組小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)(P<0.05)。與mimic-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-146b-5p-mimic的小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-146b-5p-inhibitor的小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲能力下降(P<0.05)。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-146b-5p促進(jìn)小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲

2.6 過(guò)表達(dá)miR-146b-5p對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖6所示,與對(duì)照組相比,模型組與mimic-NC組E-cadherin表達(dá)降低(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高(F=639.34、572.69,P<0.05)。模型組與mimic-NC組E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。與mimic-NC組相比,miR-146b-5p-mimic組小鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)降低(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高(F=639.34、572.69,P<0.05),miR-146b-5p-inhibitor組小鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)升高(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達(dá)降低(F=639.34、572.69,P<0.05)。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-146b-5p對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腹膜透析作為終末期腎功能衰竭患者的替代療法,在世界范圍內(nèi)發(fā)展迅速,然而,進(jìn)行性腹膜纖維化是長(zhǎng)期腹膜透析患者無(wú)法避免的問(wèn)題。miRNA在抑制腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。He et al[9]研究認(rèn)為,與正常對(duì)照組大鼠相比,腹膜透析組大鼠miR-15a-5p表達(dá)水平降低,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)表達(dá)水平升高,miR-15a-5p可通過(guò)靶向VEGFR參與腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的EMT過(guò)程。Li et al[10]研究表明,腹膜透析患者miR-302c水平下調(diào),且miR-302c的表達(dá)與EMT相關(guān)因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。接受慢性高糖腹膜透析液輸注的小鼠具有腹膜纖維化的典型特征,并且α-SMA和COL Ⅰ的表達(dá)更高[11]。本研究構(gòu)建的腹膜纖維化小鼠模型中小鼠腹膜組織明顯增厚,膠原纖維明顯增多,α-SMA和COL Ⅰ的表達(dá)較正常腹膜組織升高,miR-146b-5p表達(dá)也升高。這提示腹膜纖維化小鼠模型成功構(gòu)建,且其miR-146b-5p表達(dá)較正常小鼠發(fā)生變化。同時(shí),通過(guò)采用不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)小鼠腹膜間皮細(xì)胞,構(gòu)建體外纖維化模型,進(jìn)一步探討miR-146b-5p在腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化中的作用。

EMT是導(dǎo)致腹膜纖維化的關(guān)鍵過(guò)程,其特點(diǎn)是破壞細(xì)胞極性和黏附能力以獲得間充質(zhì)特征,如遷移和侵襲能力,在EMT過(guò)程中,上皮鈣黏附蛋白E-cadherin下調(diào),而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin上調(diào)[12]。本研究中,模型組小鼠腹膜組織和腹膜間皮細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)均降低,上調(diào)miR-146b-5p表達(dá)后,高糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng),增殖活性下降,E-cadherin表達(dá)再次降低,Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高,而抑制miR-146b-5p表達(dá)后,細(xì)胞遷移和侵襲能力下降,E-cadherin表達(dá)升高,Vimentin和N-cadherin表達(dá)下降,這表明miR-146b-5p促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。

ZNRF3是E3泛素連接酶家族成員,在多種癌細(xì)胞中下調(diào),通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。張鈺欣 等[14]利用葛根素上調(diào)miR-490的表達(dá),降低ZNRF3的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá),抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)、侵襲和遷移。本研究中通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)網(wǎng)站和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p與ZNRF3存在結(jié)合位點(diǎn),ZNRF3是miR-146b-5p的靶基因之一。在甲狀腺癌相關(guān)研究中,miR-146b被證明在癌組織中高表達(dá),并能通過(guò)靶向作用于ZNRF3參與癌細(xì)胞EMT進(jìn)程,促進(jìn)其遷移和侵襲[15]。本研究中,高糖誘導(dǎo)降低了小鼠腹膜間皮細(xì)胞ZNRF3的表達(dá),將miR-146b-5p mimic轉(zhuǎn)染至小鼠腹膜間皮細(xì)胞后,ZNRF3的表達(dá)下調(diào),而miR-146b-5p表達(dá)受到抑制時(shí),ZNRF3的表達(dá)上調(diào),這提示miR-146b-5p靶向負(fù)調(diào)控ZNRF3的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT過(guò)程。

綜上所述,本研究顯示miR-146b-5p可靶向ZNRF3基因促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。盡管其機(jī)制需要進(jìn)一步的探索,但miR-146b-5p可作為預(yù)防腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的作用靶點(diǎn)。