劉瀚文 王 旸 楊 崢

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率約14.6%,死亡率19.4%,占癌癥死亡1/3,居惡性腫瘤第一位[1]。非小細胞肺癌占肺癌85%,大部分患者確診時已屬于中晚期,傳統(tǒng)的單一癌癥治療方式如手術(shù)治療、放化療對于晚期非小細胞肺癌效果不佳,整體生存率極低[2]。因此,不斷開發(fā)綜合治療方案,對提高患者生存率和改善患者生活質(zhì)量有重大意義。腫瘤免疫治療是近年癌癥治療最有效的方法之一,解除腫瘤對免疫系統(tǒng)的屏蔽功能,激活免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞,對腫瘤細胞進行攻擊,該療法稱為免疫檢查點抑制劑療法(immune checkpoint inhibitor,ICB),程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)就是活化的T細胞表面高度表達的免疫檢查點分子[3]。免疫治療雖具有優(yōu)勢,但對很多癌癥響應(yīng)率不高,為了提高免疫檢查點抑制劑的抗腫瘤作用,很多研究將免疫療法與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用,并取得一定成效[4]。因此,本研究旨在通過建立肺癌荷瘤小鼠模型,探討PD-1抑制劑聯(lián)合高劑量照射對肺癌荷瘤小鼠腫瘤生的抑制作用,為臨床治療肺癌提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只3～4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量15～22 g,動物來源:濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,合格證號:SCXK(魯)2019-0003。所有小鼠飼養(yǎng)于相同飼養(yǎng)環(huán)境(溫度20 ℃～24 ℃,濕度50%～60%),自由飲水和攝食飼養(yǎng)7 d,定期更換墊料,保持良好通風(fēng)。小鼠Lewis肺癌細胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心(中國科學(xué)院上海生命院細胞庫)。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 PD-1抑制劑(純度98.48%,北京百奧萊博科技有限公司,批號:M04606,);白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、干擾素γ(interferon,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);兔抗β-actin多克隆抗體、PD-1、程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand,PD-L1)多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG(北京奧博森生物技術(shù)有限公司);細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液、胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 于含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠Lewis肺癌細胞,置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng),待細胞生長至80%融合度時,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代,消化終止后,使用PBS緩沖液吹打混勻,配置成1×107個/ml的細胞懸液。

1.2.2 造模、分組與給藥 選取40只小鼠建立肺癌荷瘤小鼠模型,將配置好的小鼠Lewis肺癌細胞懸液接種于小鼠右腋下0.2 ml,接種后7 d觀察小鼠皮下,若接種部位出現(xiàn)米粒大小硬物塊即為造模成功[5]。將造模成功小鼠隨機分為模型組、PD-1抑制劑組、高劑量照射組、聯(lián)合組(PD-1抑制劑聯(lián)合高劑量照射),各10只,另設(shè)對照組10只,不接種Lewis肺癌細胞。PD-1抑制劑組和聯(lián)合組小鼠腹腔注射2 mg/ml的PD-1抑制劑100 μL,對照組及模型組注射等量PBS,各組給藥1次/d,連續(xù)注射14 d;末日給藥后,高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠腫瘤部位接受單次劑量10 Gy的電離照射。

1.3 檢測指標

1.3.1 標本采集 各組小鼠給藥前和末次治療后稱重,末次給藥后禁食24 h,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,開腹,經(jīng)腹主動脈采集血液,靜置30 min,于4 ℃下3000 r/min,r=12 cm高速離心機離心15 min,分離血清,-20 ℃保存。脫頸法處死小鼠,剝離小鼠瘤體并進行稱重,摘取小鼠胸腺、脾臟進行稱重,將小鼠瘤體使用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后,剪取部分腫瘤組織裝入無菌凍存管內(nèi),-80 ℃保存?zhèn)溆?其余腫瘤組織置入4%多聚甲醛液固定24 h備用。

1.3.2 血清IFN-γ、IL-2、TNF-α水平檢測 通過ELISA法檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α濃度,取出ELISA試劑盒室溫下復(fù)溫30 min,按照說明書操作,依次加入待測樣品100 μL(各組小鼠血清樣本)、一抗、二抗、顯色液50 μL、終止液,以空白孔調(diào)零作對照,于450 nm波長處檢測各孔光密度值,根據(jù)標準品梯度濃度與對應(yīng)光密度值構(gòu)建標準曲線,代入待測樣品OD值并計算各樣本濃度。

1.3.3 抑瘤率計算 記錄各組小鼠瘤體質(zhì)量并計算平均值,按照公式計算腫瘤生長抑制率,腫瘤生長抑制率(%)=(模型組小鼠平均腫瘤質(zhì)量-治療組小鼠平均腫瘤質(zhì)量)/模型組小鼠平均腫瘤質(zhì)量×100%。

1.3.4 臟器指數(shù)計算 將摘取的胸腺和脾臟組織放入PBS中反復(fù)沖洗,去除表面血污,濾紙吸干表面水分,進行稱重并計算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.5 腫瘤組織HE染色 取出經(jīng)4%多聚甲醛固定后的腫瘤組織,梯度酒精溶液脫水,二甲苯透明。石蠟中包埋、切片(5 μm)。將切片放入二甲苯、無水乙醇、梯度酒精溶液進行脫蠟復(fù)水,切片置于蘇木素液10 min,流水沖洗1 min,1%鹽酸分化30 s,返藍后流水浸泡15 min,0.5%伊紅染液浸泡2 min,流水沖洗5 min,梯度酒精溶液再次脫水透明,使用中性樹脂封固。干燥后于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化,鏡下拍照。

1.3.6 PD-1、PD-L1 mRNA表達 Trizol法提取腫瘤組織總RNA,按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA,檢測RNA濃度及純度后。PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,配制PCR反應(yīng)體系20 μL:上、下游引物各0.5 μL,Reddy Mix PCR Master Mix 10.6 μL,DNA template 0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 25 s,56 ℃ 35 s,72 ℃ 65 s下進行40個循環(huán)。取樣本CT值平均數(shù),以目的基因相對內(nèi)參的表達量計算各樣本之間基因表達差異,2-△△CT計算各樣本基因的表達相對量。反應(yīng)引物序列設(shè)計為PD-1-F:5′-GCACCCCAAGGCAAAAATCG-3′、PD-1-R:5′-CAATACAGGGATACCCACTAGGG-3′;PD-L1-F:5′-TAGTGGG-TATCCCTGTATTGCTG-3′、PD-L1-R:5′-CTTCTCTCGT-CCCTGGAAGTC-3′;β-actin-F:5′-GGCTGTATTCCCCT-CCATCG-3′、β-actin-R:5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

1.3.7 PD-1、PD-L1蛋白表達 將腫瘤組織加入400 μL裂解液,充分接觸細胞,等待細胞完全裂解,將懸液在4 ℃下12000 rpm,r=12 cm離心機離心5 min,收集上清液。使用BCA蛋白濃度試劑盒,配制好BCA工作液,測定蛋白濃度。按照蛋白上樣量40 μL,加入配制好的10%蛋白分離膠與5%蛋白濃縮膠,恒壓80 V電泳30 min,恒壓120 V電泳90 min至溴酚藍指示劑到達底部即停。調(diào)整電流為260 mA,轉(zhuǎn)至PDVF膜上,使用TBST沖洗后,加入5%脫脂牛奶搖床封閉2 h,丟棄封閉液再加入1∶1000稀釋一抗,4 ℃過夜,TBST清洗PDVF膜10 min,加入1∶2000稀釋二抗,室溫封閉60 min,TBST清洗,滴加發(fā)光液放入凝膠圖像分析儀進行顯影,保存圖像,以β-actin為內(nèi)參,觀察并分析條帶上相應(yīng)的蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量比較

治療前,各組小鼠體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與治療前比較,治療后對照組、PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)。治療后與對照組比較,模型組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)。與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量升高(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較

2.2 血清IFN-γ、IL-2、TNF-α水平檢測

與對照組比較,模型組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低(P<0.05)。與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平均升高(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、TNF-α水平比較

2.3 腫瘤生長抑制率比較

與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量降低,腫瘤生長抑制率升高(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量降低,腫瘤生長抑制率升高(P<0.05),見表3。

表3 各組小鼠瘤質(zhì)量與抑瘤率的比較

2.4 臟器指數(shù)比較

與對照組比較,模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均降低(P<0.05)。與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均升高(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的比較

2.5 腫瘤組織HE染色比較

結(jié)果顯示,模型組小鼠腫瘤組織細胞結(jié)構(gòu)清晰、排列紊亂但緊密,細胞核分裂現(xiàn)象較多,細胞生長旺盛,壞死現(xiàn)象較少,免疫細胞浸潤現(xiàn)象較少,整體未見明顯壞死區(qū)域;PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠腫瘤組織細胞排列松散無序,細胞密度降低,細胞核分裂現(xiàn)象較少,核仁固縮,細胞壞死現(xiàn)象較多,免疫細胞浸潤現(xiàn)象明顯增多,整體可見明顯壞死區(qū)域。

2.6 PD-1、PD-L1 mRNA水平比較

與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1 mRNA表達水平降低(P<0.05),見表5。

表5 各組小鼠PD-1、PD-L1 mRNA水平比較

2.7 PD-1、PD-L1蛋白水平比較

與模型組比較,PD-1抑制劑組、高劑量照射組和聯(lián)合組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達水平降低(P<0.05)。與PD-1抑制劑組和高劑量照射組比較,聯(lián)合組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達水平降低(P<0.05),見表6,圖1。

A為模型組,B為PD-1抑制劑組,C為高劑量照射組,D為聯(lián)合組。圖1 腫瘤組織蛋白檢測

表6 各組小鼠PD-1、PD-L1蛋白水平比較

3 討論

肺癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜,研究表明,多數(shù)患者病因與空氣污染程度、職業(yè)環(huán)境、吸煙和遺傳因素相關(guān),肺癌具有發(fā)病快、易轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)率等特點,病死率遠高于其他惡性腫瘤疾病,延長患者生命時長和生活質(zhì)量是治療難題[6-7]。臨床工作中,放射療法和近年提出的免疫療法都取得較大進展,但均具有一定局限性[8]。因此,聯(lián)合免疫療法和放射治療多途徑治療癌癥,開發(fā)新的治療方案刻不容緩[9]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機體自身的免疫功能失調(diào)和腫瘤微環(huán)境的改變密切相關(guān),惡性腫瘤的療法不應(yīng)局限于除去瘤體,積極調(diào)動機體自身免疫系統(tǒng),改變免疫微環(huán)境對抗腫瘤是治療腫瘤的關(guān)鍵[10]。本研究通過動物實驗,建立肺癌荷瘤小鼠模型,從分子機制上探討PD-1抑制劑對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用及免疫功能的影響。結(jié)果顯示,模型組小鼠腫瘤質(zhì)量升高,體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)水平均降低,提示模型組小鼠腫瘤組織生長迅速,小鼠免疫功能失調(diào),機體損傷嚴重,肺癌荷瘤模型建立成功。在給予PD-1抑制劑和高劑量照射治療后小鼠均表現(xiàn)腫瘤質(zhì)量降低,體質(zhì)量、腫瘤生長抑制率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)水平均升高,以聯(lián)合組效果最佳。說明治療組小鼠免疫功能失調(diào)現(xiàn)象得到改善,且抑制腫瘤生長。此外,腫瘤組織HE染色結(jié)果也表明腫瘤細胞受到攻擊,出現(xiàn)大量細胞壞死,細胞分裂現(xiàn)象較少,免疫微環(huán)境得到調(diào)節(jié),進一步驗證PD-1抑制劑和高劑量照射對腫瘤生長均有抑制作用。

PD-1作為誘導(dǎo)型蛋白,在未活化的T細胞中幾乎不表達,而活化的T細胞中會有大量PD-1誘導(dǎo)表達,PD-1具有調(diào)控T細胞抑制信號功能,是免疫系統(tǒng)進行應(yīng)答和調(diào)節(jié)免疫功能建立耐受的重要因子。其配體PD-L1通過EGFR、MAPK或PI3K/Akt等多種通路激活,受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)及免疫微環(huán)境中IFN-γ因子刺激可以在腫瘤細胞中高度表達,當(dāng)腫瘤細胞表面的PD-1與PD-L1結(jié)合后,會誘導(dǎo)腫瘤特異性T細胞對腫瘤抗原無反應(yīng)或者誘導(dǎo)腫瘤特異性T細胞凋亡,使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊[11]。通過PD-1抑制劑阻斷其結(jié)合可以恢復(fù)腫瘤特異性T細胞對腫瘤細胞的免疫抑制能力,從而達到抗腫瘤效果[12]。在本研究中,模型組小鼠IFN-γ、IL-2、TNF-α降低,PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表達水平均升高,表明模型組小鼠PD-1/PD-L1信號通路被激活后,機體免疫功能失調(diào),促進腫瘤生長。與模型組比較,PD-1抑制劑和高劑量照射治療的小鼠均表現(xiàn)IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高,PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表達水平均降低,可見PD-1抑制劑能夠有效抑制PD-1/PD-L1信號通路,提高免疫細胞攻擊腫瘤細胞,調(diào)節(jié)小鼠免疫功能,對小鼠腫瘤生長有明顯的抑制作用。

綜上所述,PD-1抑制劑對肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長有一定的抑制作用,聯(lián)合高劑量照射可以提高療效,可能是通過抑制PD-1/PD-L1信號通路發(fā)揮作用,為臨床治療肺癌提供實驗依據(jù)。