李玲玲 林斯曉 周文英 彭曉謀

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤,也是我國第三大腫瘤致死病因[1]。其發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、惡性程度高、預(yù)后差,嚴(yán)重威脅著人類健康。在治療上Ⅰ和Ⅱ期患者以手術(shù)(肝切除術(shù)和肝移植術(shù))為主,對(duì)Ⅲb期的晚期患者除了放療、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞( transcatheter arterial chemoembolization,TACE)等治療手段外結(jié)合靶向治療亦可使患者獲益[1]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,密切參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可作為癌癥治療的重要靶點(diǎn)[2]。目前,以 STAT3 為靶點(diǎn)開發(fā)抗腫瘤藥物的研究越來越多。S3I-201是近年來鑒定出的一個(gè) STAT3小分子抑制劑,能特異結(jié)合在STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域,從而阻斷STAT3的磷酸化/活化、STAT3-STAT3復(fù)合物形成及細(xì)胞核內(nèi)STAT3-DNA結(jié)合活性,并最終抑制依賴于STAT3的轉(zhuǎn)錄活性[3]。S3I-201優(yōu)先作用于持續(xù)性表達(dá)STAT3活化蛋白的腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)其生長抑制和凋亡發(fā)生[4-6]。本文旨在探討S3I-201對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等的影響,為肝癌相關(guān)的靶向藥物研發(fā)和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM、FBS、PBS 購自美國 Gibco公司;BEL-7402保存于中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;細(xì)胞培養(yǎng)皿(板);STAT3 抑制劑( 商品名 S3I-201)購自美國MCE公司;Cell Couting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒及Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購自日本Dojindo公司;磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST)公司;內(nèi)參抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠購自Proteintech公司;EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;預(yù)染蛋白質(zhì)Marker為Thermofisher產(chǎn)品;蛋白提取RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜浸潤活化液、細(xì)胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;預(yù)制蛋白電泳凝膠為EZBiolab產(chǎn)品; Western blot 化學(xué)發(fā)光劑購自上海天能(Tanon)科技有限公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗、DAPI染色液、抗淬滅封片劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;Q-PCR引物、RT試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM購置TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞BEL-7402 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。1～2 d換液,每3～4 d 進(jìn)行傳代,實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,取生長良好的3～6代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 以對(duì)數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按照不同實(shí)驗(yàn)條件處理后進(jìn)行檢測。每孔加入10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中孵育2 h,置于酶標(biāo)儀中于450 nm下讀取OD值,根據(jù)公式:細(xì)胞存活率%=(加藥孔OD-空白OD)/(對(duì)照孔OD-空白OD)×100%,計(jì)算不同S3I-201濃度的細(xì)胞存活率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,繪制細(xì)胞增殖曲線,計(jì)算IC50值。

1.2.3 EdU細(xì)胞增殖檢測 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,以每孔1×105細(xì)胞接種于12孔板中,培養(yǎng)24 h后,S3I-201處理48 h,之后用20 μM溶液孵育標(biāo)記6 h,PBS洗滌1～2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定30 min,2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min中和過量的醛基,PBS洗滌,0.5% TritonX-100通透細(xì)胞,1×Apollo和1×Hoechst33342染色、PBS洗滌后,用抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞凋亡檢測:藥物處理后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用1×AnnexinⅤ Binding Solution制備成終濃度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液,取100 μL該細(xì)胞懸液依次加入AnnexinⅤ,FITC結(jié)合物及PI Solution,室溫下避光孵育15 min,加入400 μL 1×AnnexinⅤBinding Solution,在1h內(nèi)完成檢測。對(duì)照細(xì)胞設(shè)置了未染色組、AnnexinⅤ-FITC染色組及PI染色組,分別用于上機(jī)(Beckman Coulter Epics-XL)檢測中的電壓和補(bǔ)償調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期檢測:采用PI染色法。用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞,每孔1.5×106個(gè),細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期,60%～70%匯合度后更換成含藥培養(yǎng)液,分別處理0 h、24 h、48 h后,收集細(xì)胞檢測;胰酶消化細(xì)胞1000 rpm,5 min沉淀細(xì)胞后,先用預(yù)冷的PBS洗2次,再1000 rpm,5 min沉淀細(xì)胞;重懸后的細(xì)胞懸液1000 rpm,5 min離心后,用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕混勻,4 ℃固定2 h以上,然后1000 g離心5 min沉淀細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗一次,1000 g離心5 min再次沉淀細(xì)胞,加RNase A溶液及PI染色后上機(jī)檢測,應(yīng)用ModFit LT 5.0軟件對(duì)細(xì)胞周期檢測的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)檢測 收集處理后的細(xì)胞,RIPA提取總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度,取30 μg蛋白樣品上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,洗膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax及內(nèi)參抗體均以1∶1000 4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后,加入HRP標(biāo)記的特異性二抗以1∶10000室溫孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的影響

S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞體外增殖的影響分別采用CCK-8和EdU法進(jìn)行檢測,結(jié)果分別見圖1和圖2。經(jīng)不同濃度的S3I-201作用48 h后,隨著藥物濃度的增加BEL-7402細(xì)胞存活率呈現(xiàn)不同程度的下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.50,P=0.0001),其中藥物濃度為280 μM時(shí)即對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用達(dá)顯著水平(P<0.05)。IC50=343.9 μM。

圖1 S3I-201作用48 h對(duì)BEL-7402細(xì)胞體外增殖的劑量依賴性抑制作用

圖2 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制作用(×200)

采用EdU增殖法檢測S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的影響, 結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比280 μM的S3I-201能顯著抑制BEL-7402細(xì)胞的增殖(圖2)。

2.2 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)CCK-8結(jié)果,S3I-201的工作濃度采用230 μM,在此濃度下藥物可以發(fā)揮作用而又能使細(xì)胞保持較高的存活率。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖3),S3I-201作用24 h后,發(fā)生早期凋亡(右下象限)的細(xì)胞比對(duì)照組顯著增加(P<0.05),藥物作用48 h后,發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞急劇增加(P<0.001),達(dá)60.7%;S3I-201誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡的情況與誘導(dǎo)發(fā)生早期凋亡類似,即:藥物作用24 h后,發(fā)生晚期凋亡(右上象限)的細(xì)胞比對(duì)照組顯著增加(P<0.05), 48 h后,發(fā)生晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)目急劇增加(P<0.001),達(dá)28.5%。

A為流式散點(diǎn)圖; B為析因設(shè)計(jì)的方差分析。圖3 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞凋亡的影響

2.3 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

用230 μM的S3I-201處理BEL-7402細(xì)胞后,提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。結(jié)果表明,S3I-201能極顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(P<0.05),顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)(P<0.05)(圖4)。

2.4 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞周期的影響

將230 μM的S3I-201分別與BEL-7402細(xì)胞共培養(yǎng)24 h及48 h,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)24 h后處于細(xì)胞周期不同時(shí)相(G0/G1,S,G2/M)的細(xì)胞數(shù)目沒有顯著變化(P>0.05);共培養(yǎng)48 h后G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),S期細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05),而G2/M的細(xì)胞比例沒有顯著變化(P>0.05)?？梢?S3I-201能將BEL-7402阻滯于S期,從而影響其增殖(圖5)。

A為擬合的細(xì)胞周期圖; B為析因設(shè)計(jì)的方差分析。圖5 S3I-201對(duì)BEL-7402細(xì)胞周期的影響

3 討論

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,肝癌靶向治療成為了傳統(tǒng)治療外非常重要的一種治療手段[7-8]。近年來,除索拉非尼(SOR)外,侖伐替尼、瑞戈非尼及卡博替尼等靶向藥物陸續(xù)在國內(nèi)外上市,很大程度上提高了對(duì)肝癌的療效[9-10]。因此,開發(fā)新的靶向藥物以用于改善晚期肝癌患者的生存質(zhì)量也是未來研究工作的重要方向之一。

Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-STAT 信號(hào)通路主要介導(dǎo)由細(xì)胞膜向細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并激發(fā)轉(zhuǎn)錄過程。其中,STAT3作為STAT家族成員在許多癌癥中持續(xù)性高表達(dá)。持續(xù)活化的 STAT3進(jìn)一步促進(jìn)癌腫發(fā)展以及產(chǎn)生抗癌藥物抵抗,STAT3已成為治療癌癥的引人注目的靶點(diǎn)。目前,STAT3 非多肽類小分子抑制劑得到了迅速的發(fā)展,其中,基于計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選技術(shù)得到的化合物S31-201及其衍生物是直接靶向STAT3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑。在本研究中,我們用S31-201對(duì)人BEL-7402肝癌細(xì)胞進(jìn)行了量效和時(shí)效關(guān)系研究,結(jié)果表明:藥物濃度在0～400 μM區(qū)間時(shí),隨著藥物濃度逐漸加大,對(duì)細(xì)胞的殺傷作用越顯著,最高達(dá)80%以上;分別于0 h、12 h、24 h、48 h、60 h等時(shí)間點(diǎn)用230 μM的S31-201進(jìn)行時(shí)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),藥物作用24 h以前未見對(duì)細(xì)胞的明顯殺傷作用,但隨著作用時(shí)間的延長細(xì)胞存活率明顯下降,48 h存活率約80%,60 h時(shí)下降到約60%。

阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的重要方式。本實(shí)驗(yàn)中我們的結(jié)果顯示:S31-201能阻斷BEL-7402肝癌細(xì)胞S期DNA的復(fù)制,發(fā)生細(xì)胞周期S期阻滯。當(dāng)前抗肝癌藥物引起肝細(xì)胞癌發(fā)生周期阻滯的諸多研究中,肝癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1、S及G2/M期阻滯均有報(bào)道[11-13],但以S期阻滯最為多見,推測與受試對(duì)象如藥物、細(xì)胞株、動(dòng)物或組織等的不同有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)死亡過程,可以被多種內(nèi)在或外在的刺激誘發(fā),是細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答反應(yīng)。本研究根據(jù)CCK-8的結(jié)果,選擇了230 μM的S31-201流式Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測BEL-7402肝癌細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示隨著S3I-201作用時(shí)間的延長不管是早期凋亡還是晚期凋亡率都明顯增加。進(jìn)一步用Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示S3I-201能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。

綜上所述,STAT3小分子抑制劑S31-201能夠在體外阻滯BEL-7402肝癌細(xì)胞周期,使其停滯于S期,抑制BEL-7402的增殖,通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax 的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,更深入的分子機(jī)制以及在動(dòng)物模型中的驗(yàn)證工作仍在進(jìn)行中。

該研究結(jié)果將為靶向STAT3的小分子藥物的作用機(jī)理及潛在的臨床應(yīng)用提供一些有益的線索。